高夕雷，趙廣春，張雷鳴，于建秀

1.江蘇省鹽城市濱?？h第二人民醫(yī)院傳染科,江蘇鹽城 224500；2.江蘇省鹽城市濱?？h人民醫(yī)院檢驗(yàn)科,江蘇鹽城 224500；3.江蘇省鹽城市濱海縣人民醫(yī)院傳染科,江蘇鹽城 224500

慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染是全球面臨的嚴(yán)重公共衛(wèi)生問(wèn)題之一。據(jù)估計(jì)，在2.57億慢性HBV感染者中，約30%患有慢性乙型肝炎(CHB)和存在病毒復(fù)制，部分患者可發(fā)生急性和慢性肝功能衰竭或發(fā)展為肝硬化和肝細(xì)胞癌[1]。CHB是HBV復(fù)制與宿主免疫系統(tǒng)相互作用的結(jié)果，CHB患者全身免疫耐受導(dǎo)致HBV持續(xù)慢性感染[2]。研究表明，CD8+CD25+FoxP3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)是維持免疫抑制的核心細(xì)胞，可通過(guò)抑制機(jī)體抗病毒免疫應(yīng)答參與疾病發(fā)生、發(fā)展過(guò)程[3-4]，其在感染性疾病(如結(jié)核病和丙型肝炎等)、自身免疫性疾病(如系統(tǒng)性紅斑狼瘡和多發(fā)性硬化癥等)和腫瘤等疾病的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用[5]，但CD8+CD25+FoxP3+Treg在HBV感染患者疾病進(jìn)展中的作用尚不明確。本研究通過(guò)檢測(cè)CHB患者外周血CD8+CD25+FoxP3+Treg比例，并分析其與血清細(xì)胞因子的相關(guān)性，以探討其在CHB疾病進(jìn)展中的作用。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年3-11月在濱海縣第二人民醫(yī)院傳染科診治的無(wú)癥狀HBV攜帶者28例為攜帶組，CHB患者28例為CHB組。同時(shí)選取28例年齡、性別匹配的健康體檢者作為對(duì)照組。CHB的診斷參照《慢性乙型肝炎防治指南(2015更新版)》[6]。納入標(biāo)準(zhǔn)：至少1年未接受過(guò)核苷酸類(lèi)似物、干擾素或免疫調(diào)節(jié)藥物的治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：急性乙型肝炎、其他肝炎病毒感染、人類(lèi)免疫缺陷病毒感染、酒精性肝炎、脂肪肝、自身免疫性疾病或腫瘤。各組研究對(duì)象年齡、性別比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組一般資料比較

1.2儀器與試劑 異硫氰酸熒光素(FITC)鼠抗人-CD3單克隆抗體(mAb)、葉綠素蛋白偶聯(lián)物(PerCP-cy5.5)鼠抗人-CD8 mAb、別藻青蛋白(APC)鼠抗人-CD25 mAb、藻紅蛋白(PE)鼠抗人-叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子P3(FoxP3) mAb及同型對(duì)照、紅細(xì)胞裂解液及流式細(xì)胞儀均購(gòu)自美國(guó)BD公司；血清細(xì)胞因子白細(xì)胞介素(IL)-10、IL-35和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β1檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒及ABI 7300實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析儀購(gòu)自美國(guó)ABI公司；Trizol試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；Ficoll-HyPaque分離液購(gòu)自上海恒信試劑有限公司；AU2700全自動(dòng)生化分析儀及配套試劑購(gòu)自日本奧林巴斯公司；Luminex 200流式熒光檢測(cè)儀購(gòu)自美國(guó)Luminex公司。

1.3方法

1.3.1肝功能相關(guān)指標(biāo)及HBV-DNA檢測(cè) 采集3組研究對(duì)象外周血4 mL置于分離膠管，離心，收集上層血清用于檢測(cè)。采用奧林巴斯AU2700全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)總膽紅素(TBIL)、直接膽紅素(DBIL)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)和天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)水平。采用ABI 7300實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析儀檢測(cè)HBV-DNA水平。

1.3.2外周血CD8+CD25+FoxP3+Treg比例檢測(cè) 采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。具體步驟如下，取肝素抗凝靜脈血100 μL，加入 FITC鼠抗人-CD3 mAb、PerCP-cy5.5鼠抗人-CD8 mAb、APC-鼠抗人CD25 mAb及同型對(duì)照各10 μL，避光孵育30 min。加紅細(xì)胞裂解液1 mL破壞紅細(xì)胞，經(jīng)磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌，離心棄上清液。每管加入250 μL 1×Fix/Perm buffer渦旋約3 s，避光孵育40 min，加入300 μL 1×Perm/wash buffer洗滌，離心棄上清液。用100 μL Perm/wash buffer重懸細(xì)胞，加入10 μL PE鼠抗人-FoxP3 mAb，室溫避光孵育40 min，洗滌離心，棄上清液。最后加入400 μL PBS重懸細(xì)胞，上機(jī)檢測(cè)。以淋巴細(xì)胞設(shè)門(mén)，先分選CD3+CD8+T細(xì)胞，再分選CD8+CD25+T細(xì)胞，最終分析CD8+CD25+FoxP3+Treg占外周血淋巴細(xì)胞的比例。

1.3.3RNA提取及RT-PCR檢測(cè)FoxP3 mRNA 采集3組研究對(duì)象外周血置于肝素鈉抗凝管中，用等量Hank′s液稀釋全血；取10 mL玻璃管3支，每管加3 mL比重為1.007的淋巴細(xì)胞分離液(Ficoll-HyPaque分離液)，然后將稀釋的全血6 mL慢慢加在分離液面上，液層界面不能打亂。2 000 r/min離心20 min,離心后液體分為3層，上中下層分別為血漿和Hank′s液、淋巴細(xì)胞分離液、粒細(xì)胞和紅細(xì)胞，在上層與中層交界處，有1層白膜即為目標(biāo)細(xì)胞。毛細(xì)吸管慢慢插入白膜層，輕輕抽吸外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，放入另一管中，再加10 mL Hank′s液，1 500 r/min離心10 min，離心3次，洗去抗凝物質(zhì)、血小板和分離介質(zhì)。用Trizol試劑提取總RNA。用cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行cDNA合成，用QuantiTect SYBR Green PCR試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增。引物序列：FoxP3上游引物5′-CACAACATGCGACCCCCTT TCACC-3′;，下游引物5′-AGGTTGTGGCGGATGGCGTTCTTC-3′；β-actin上游引物5′-TGGCACCCAGCACAATGAA-3′，下游引物5′-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3′。熱循環(huán)條件：95 ℃ 15 min，95 ℃ 15 s，40個(gè)循環(huán)，72 ℃ 30 s。根據(jù)2-ΔΔCt法計(jì)算標(biāo)本中FoxP3 mRNA相對(duì)表達(dá)水平。

1.3.4血清細(xì)胞因子水平檢測(cè) 采用Luminex液相芯片檢測(cè)血清細(xì)胞因子水平。采集研究對(duì)象外周血3 mL，1 500 r/min離心5 min，收集血清，儲(chǔ)存于-80 ℃冰箱，避免反復(fù)凍融。按試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)IL-10、IL-35和TGF-β1水平，每份標(biāo)本檢測(cè)兩次，結(jié)果取均值。

2 結(jié) 果

2.13組肝功能相關(guān)指標(biāo)及HBV-DNA水平比較 CHB組ALT、AST、TBIL、DBIL水平均高于攜帶組與對(duì)照組，HBV-DNA水平高于攜帶組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 3組肝功能相關(guān)指標(biāo)及HBV-DNA水平比較

2.23組外周血CD8+CD25+FoxP3+Treg比例及PBMC中FoxP3 mRNA水平比較 與對(duì)照組相比，攜帶組、CHB組外周血CD8+CD25+FoxP3+Treg比例及PBMC中 FoxP3 mRNA水平均明顯升高，且CHB組均高于攜帶組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 3組外周血CD8+CD25+FoxP3+Treg比例及PBMC中FoxP3 mRNA水平比較

2.3CHB患者外周血CD8+CD25+FoxP3+Treg比例與PBMC中FoxP3 mRNA水平的相關(guān)性 CHB患者外周血CD8+CD25+FoxP3+Treg比例與PBMC中FoxP3 mRNA水平呈正相關(guān)(r=0.568，P<0.05)。見(jiàn)圖1。

圖1 CHB患者外周血CD8+CD25+FoxP3+Treg比例與PBMC中FoxP3 mRNA水平的相關(guān)性分析

2.43組血清細(xì)胞因子水平比較 與對(duì)照組相比，CHB組和攜帶組血清IL-10、TGF-β1和IL-35水平明顯升高，且CHB組高于攜帶組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 3組血清細(xì)胞因子水平比較

2.5CHB患者外周血CD8+CD25+FoxP3+Treg比例與血清細(xì)胞因子水平的相關(guān)性 CHB患者外周血CD8+CD25+FoxP3+Treg比例與血清IL-10、TGF-β1及IL-35水平均呈正相關(guān)(r=0.537、0.377、0.484，P<0.05)。見(jiàn)圖2。

2.6CHB患者外周血CD8+CD25+FoxP3+Treg比例與肝功能相關(guān)指標(biāo)及HBV-DNA水平的相關(guān)性 CHB患者外周血CD8+CD25+FoxP3+Treg比例與TBIL、HBV-DNA、ALT水平呈正相關(guān)(r=0.536、0.570、0.443，P<0.05)；與DBIL、AST水平無(wú)相關(guān)性(r=0.302、0.343，P>0.05)。見(jiàn)圖3。

注：A為外周血CD8+CD25+FoxP3+Treg比例與血清IL-10水平的相關(guān)性分析；B為外周血CD8+CD25+FoxP3+Treg比例與血清TGF-β1水平的相關(guān)性分析；C為外周血CD8+CD25+FoxP3+Treg比例與血清IL-35水平的相關(guān)性分析。

注：A為外周血CD8+CD25+FoxP3+Treg比例與ALT水平的相關(guān)性分析；B為外周血CD8+CD25+FoxP3+Treg比例與TBIL水平的相關(guān)性分析；C為外周血CD8+CD25+FoxP3+Treg比例與HBV-DNA水平的相關(guān)性分析；HBV-DNA水平為實(shí)際值取log10。

3 討 論

HBV感染慢性化的機(jī)制主要與機(jī)體免疫應(yīng)答能力低下有關(guān)，抑制性T細(xì)胞受體、免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞和細(xì)胞因子等多種免疫抑制因子參與CHB患者的免疫應(yīng)答降低，另一方面，抗病毒T細(xì)胞缺失或凋亡導(dǎo)致機(jī)體抗病毒免疫功能下降[1]。T細(xì)胞根據(jù)功能和表面標(biāo)志物不同可分為T(mén)reg、細(xì)胞毒性T細(xì)胞和輔助性T細(xì)胞等，其中Treg屬于免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞，可以通過(guò)抑制樹(shù)突狀細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)等多種免疫細(xì)胞的增殖和功能來(lái)調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)[7]。Treg根據(jù)表面標(biāo)志物不同分為CD4+Treg和CD8+Treg兩種主要細(xì)胞亞型，兩者有相似的免疫抑制功能。較多研究證實(shí)CHB患者CD4+Treg明顯增多[1-2,8]，導(dǎo)致患者體內(nèi)形成免疫抑制微環(huán)境，從而參與CHB的免疫耐受過(guò)程。

CD8+CD25+FoxP3+Treg可降低機(jī)體對(duì)病原體的免疫應(yīng)答能力，從而防止機(jī)體因?qū)Σ≡w產(chǎn)生免疫應(yīng)答而引起組織損傷，同時(shí)，這也導(dǎo)致了病原體的免疫逃逸。結(jié)核分枝桿菌感染患者外周血CD8+CD25+FoxP3+Treg在結(jié)核分枝桿菌增殖過(guò)程中處于較高水平，能夠抑制輔助性T細(xì)胞的增殖[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，CHB患者外周血CD8+CD25+FoxP3+Treg比例明顯升高。FoxP3是Treg的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，F(xiàn)oxP3表達(dá)對(duì)Treg發(fā)育和功能的發(fā)揮起著關(guān)鍵作用。本研究發(fā)現(xiàn)，CHB組患者PBMC中FoxP3 mRNA水平明顯升高，且與外周血CD8+CD25+FoxP3+Treg比例呈正相關(guān)(r=0.568，P<0.05)。此外，CHB患者外周血CD8+CD25+FoxP3+Treg比例與TBIL、HBV-DNA、ALT水平也呈正相關(guān)(r=0.536、0.570、0.443，P<0.05)。

CD8+CD25+FoxP3+Treg可通過(guò)釋放可溶性細(xì)胞因子發(fā)揮免疫抑制作用[5,10]。TGF-β1是一種多功能細(xì)胞因子，可抑制免疫細(xì)胞的增殖、分化和激活，在調(diào)節(jié)病毒復(fù)制和宿主對(duì)病原體的反應(yīng)中起雙重作用。TGF-β1通過(guò)刺激Treg的分化誘導(dǎo)針對(duì)HBV抗原的免疫耐受，在肝癌和肝硬化發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。有研究表明，TGF-β1可以通過(guò)調(diào)節(jié)肝細(xì)胞中微小RNA的表達(dá)改變肝細(xì)胞功能，并下調(diào)NK細(xì)胞中NKG2D/DAP10和2B4/SAP的表達(dá)，從而介導(dǎo)HBV持續(xù)感染[11]。本研究也發(fā)現(xiàn)，CHB組血清TGF-β1水平明顯高于攜帶組與對(duì)照組，且與外周血CD8+CD25+FoxP3+Treg比例呈正相關(guān)(r=0.377，P<0.05)。IL-35是一種新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞因子，屬于IL-12家族，是Treg分泌的主要效應(yīng)細(xì)胞因子之一，具有誘導(dǎo)免疫耐受的作用。在病毒感染性疾病中，如甲型流感病毒感染可導(dǎo)致PBMC中IL-35的表達(dá)增加[12]。IL-35在慢性丙型肝炎病毒感染中具有免疫抑制作用，在維持病毒持續(xù)性感染和抑制炎性反應(yīng)方面發(fā)揮著相反的作用[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，CHB組血清IL-35水平明顯升高，與ZHOU等[14]的研究結(jié)果一致。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)血清IL-35水平與外周血CD8+CD25+FoxP3+Treg比例呈正相關(guān)(r=0.484，P<0.05)。IL-10是重要的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子，具有抑制免疫應(yīng)答的能力，對(duì)肝臟疾病的預(yù)后有重要影響[15]。研究表明，IL-10參與HBV感染的免疫耐受過(guò)程，導(dǎo)致機(jī)體對(duì)HBV的免疫應(yīng)答能力降低[16]。IL-10通過(guò)抑制宿主的抗HBV活性，使HBV在體內(nèi)持續(xù)復(fù)制和表達(dá)。IL-10水平的升高與HBV表達(dá)水平和肝臟炎癥程度相關(guān)[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，CHB組血清IL-10水平明顯高于攜帶組及對(duì)照組，并與外周血CD8+CD25+FoxP3+Treg比例呈正相關(guān)(r=0.537，P<0.05)。

綜上所述，CHB患者外周血CD8+CD25+FoxP3+Treg比例升高，并與HBV感染過(guò)程中Treg相關(guān)免疫抑制細(xì)胞因子(IL-10、TGF-β1、IL-35)、肝功能相關(guān)指標(biāo)(TIBL、ALT)及HBV-DNA呈正相關(guān)。外周血CD8+CD25+FoxP3+Treg可能通過(guò)抑制機(jī)體對(duì)HBV的特異性免疫應(yīng)答，造成機(jī)體的免疫反應(yīng)低下，從而導(dǎo)致HBV感染的持續(xù)存在。因此，調(diào)控CHB患者外周血CD8+CD25+FoxP3+Treg比例，可能是防治乙型肝炎慢性化的新途徑。