李恩民，曹瑞偉，陳 龍，章潮軍，徐慧婷

（1.浙江昌海制藥有限公司，浙江 紹興 312000；2.紹興文理學(xué)院 脂溶性維生素浙江省工程研究中心，浙江 紹興 312000）

半胱氨酸（Cys）又稱為L(zhǎng)-半胱氨酸（L-Cys），是一種含硫氨基酸，存在三種構(gòu)型（L型、D型和DL型），僅有L型在體內(nèi)具有活性。半胱氨酸因其特有的理化性質(zhì)[1]和反應(yīng)活性[2]，廣泛應(yīng)用于食品、飼料、化妝品及醫(yī)藥領(lǐng)域[3]。半胱氨酸在醫(yī)藥領(lǐng)域，肝功能恢復(fù)依賴于其鹽酸鹽；還可應(yīng)用于放射性藥物中毒、銻中毒的治療以及肝炎和血清病等[4-5]。Cys是一種含硫氨基酸，可組成蛋白質(zhì)，起著營(yíng)養(yǎng)和免疫的功效。帕金森、老年癡呆、嗜睡、水腫等疾病的發(fā)生與人體中半胱氨酸含量的上下大幅度波動(dòng)相關(guān)，因此實(shí)時(shí)準(zhǔn)確地檢測(cè)體內(nèi)半胱氨酸的含量至關(guān)重要。

1980年，從膀胱結(jié)石中以胱氨酸形式發(fā)現(xiàn)了半胱氨酸，迄今為止，針對(duì)制劑中其含量的檢測(cè)方法也是層出不窮，如化學(xué)容量法、光譜法、高效液相色譜法等[6-10]。本文采用熒光分光光度法測(cè)定制劑中半胱氨酸的含量。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與主要試劑

F-4500熒光分光光度計(jì)，日本島津株式會(huì)社；電子天平，梅特勒-托利多。

羅丹明B、碘、碘化鉀、鹽酸、半胱氨酸，均為市售，分析純；實(shí)驗(yàn)用水為蒸餾水。

1.2 實(shí)驗(yàn)步驟

1.2.1 溶液的配制

（1）羅丹明B標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

取一250 mL容量瓶，精確稱量0.119 8 g羅丹明B固體，適量蒸餾水溶解，定容，可得羅丹明B貯備液（5.0×10-3mol/L），使用時(shí)稀釋10倍。

（2）碘標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

加入15 mL 1.0 mol/L的NaOH溶液溶解準(zhǔn)確稱量的1.265 0 g碘固體，振動(dòng)30 s，密封靜置以確保碘完全溶解（無(wú)色），而后使用分析天平準(zhǔn)確稱取3.6 g碘化鉀固體，加入15 mL 1.0 mol/L的鹽酸溶液，冷沸水于100 mL容量瓶中定容，最后將溶液轉(zhuǎn)入棕色細(xì)口瓶中，靜置36 h待用，即0.05 mol/L碘的貯備液，使用時(shí)需稀釋10倍。

（3）L-半胱氨酸供試品的配制

取一100 mL容量瓶，精確稱量1.210 1 g L-半胱氨酸固體，適量1.0 mol/L的鹽酸溶液溶解，蒸餾水定容，得0.01 mol/L的L-半胱氨酸供試品，使用時(shí)需稀釋100倍。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

室溫下，于50 mL容量瓶中分別加入精確提取的0 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL、0.8 mL、1 mL Cys對(duì)照液，加2.00 mL 1.0×10-3mol/L碘標(biāo)準(zhǔn)溶液，搖勻，反應(yīng)5 min，再依次加入3.00 mL 1.0×10-4mol/L羅丹明B溶液、5.00 mL乙酸-乙酸鈉緩沖溶液，蒸餾水定容，靜置10 min，578 nm下測(cè)定熒光強(qiáng)度。

分別對(duì)0.80μmol/L、1.00μmol/L、2.00μmol/L半胱氨酸對(duì)照液進(jìn)行精密度實(shí)驗(yàn)，見圖1。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

由實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)計(jì)算得，Y=224.1c+323.73（R2=0.991 5），在0.00～2.00μmol·L-1濃度區(qū)間時(shí)兩者呈線性關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)平行進(jìn)行11次空白溶液的測(cè)定，計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)偏差S，根據(jù)公式計(jì)算出檢測(cè)限為3.14×10-9mol·L-1。

分別對(duì)0.80μmol/L、1.00μmol/L、2.00μmol/L進(jìn)行精密度實(shí)驗(yàn)得RSD為0.8%、1.7%、1.6%（n=5）。

1.2.3 半胱氨酸樣品測(cè)定

取一粒半胱氨酸膠囊，除膠囊殼，取出其中粉末稱量后加10 mL 0.1 mol/L鹽酸攪拌溶解，與不溶物一起轉(zhuǎn)移到1 L量瓶中，蒸餾水定容，過(guò)濾，得半胱氨酸膠囊供試品溶液。于50 mL容量瓶中精確量取0.5 mL的半胱氨酸膠囊供試品溶液，加入2.00 mL 1.0×10-3mol/L碘標(biāo)準(zhǔn)溶液，搖勻，于室溫下反應(yīng)5 min，依次加入3.00 mL 1.0×10-4mol/L羅丹明B溶液、5.00 mL乙酸-乙酸鈉緩沖溶液，蒸餾水定容，靜置10 min后，測(cè)定熒光強(qiáng)度。帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算半胱氨酸的濃度。按照實(shí)驗(yàn)方法平行測(cè)定5次。

精密量取新配制的半胱氨酸樣品溶液1.00 mL于比色管中，于其中加入1.00 mL半胱氨酸對(duì)照品溶液，蒸餾水定容至10 mL，得樣品溶液，即加樣回收實(shí)驗(yàn)。

精密度測(cè)量結(jié)果如表1所示。

表1 精密度實(shí)驗(yàn)

加樣回收結(jié)果如表2所示，可得加樣回收率為90.33%。

表2 加樣回收實(shí)驗(yàn)

2 結(jié)論

本文對(duì)制劑中半胱氨酸含量的測(cè)定選用的是熒光猝滅的原理，檢出限為3.14×10-9mol·L-1，明顯優(yōu)于高效液相色譜法（0.01 mg·mL-1）。

按照實(shí)驗(yàn)方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程Y=224.1c+323.73（R2=0.991 5），當(dāng)半胱氨酸 濃 度 于0.00～2.00μmol·L-1區(qū)間時(shí)，兩者呈線性關(guān)系。對(duì)0.80 μmol·L-1、1.00μmol·L-1、2.00μmol·L-1進(jìn)行精密度實(shí)驗(yàn)得RSD為0.8%、1.7%、1.6%（n=5）。

按照實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定制劑中半胱氨酸的含量，計(jì)算得半胱氨酸含量為標(biāo)示量的106.77%，RSD約為1.28%，回收率為90.33%。

該方法不需催化、加熱等復(fù)雜過(guò)程便可完成制劑中半胱氨酸含量的快速測(cè)定，具有操作簡(jiǎn)單，穩(wěn)定性好，靈敏度高，精確度、準(zhǔn)確度良好等優(yōu)點(diǎn)。