陳 焰， 張 菁,*， 王 雨， 黃曉嵐， 劉笑芬

干血點(diǎn)（dried blood spot）技術(shù)是指通過微量采集末端毛細(xì)血管血（10～100 μL），經(jīng)特制卡片吸收形成干燥血點(diǎn)進(jìn)行分析的技術(shù)，是生物分析領(lǐng)域中一種有效可行的采血技術(shù)。1963年Guthrie和Susi首次報(bào)道了在干紙片上收集微量血樣用于新生兒苯丙酮尿癥的篩查[1]，之后干血點(diǎn)技術(shù)便迅速發(fā)展，在治療藥物監(jiān)測(cè)（TDM）、臨床前研究、輔助疾病診斷等諸多領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。與傳統(tǒng)的靜脈采血方式相比，干血點(diǎn)技術(shù)憑借其采血量少、侵入性低、可操作性強(qiáng)、運(yùn)輸便捷等顯著優(yōu)勢(shì)[2]，倍受關(guān)注和研究。隨著高效液相色譜、質(zhì)譜等精密分析技術(shù)，以及容量吸收微采樣裝置（VAMS）、干血點(diǎn)樣本全自動(dòng)在線提取設(shè)備、干血點(diǎn)全點(diǎn)分析技術(shù)等新裝置和技術(shù)的開發(fā)[3]，干血點(diǎn)技術(shù)與生物分析的結(jié)合越來越顯示了其臨床推廣應(yīng)用的前景。

TDM是實(shí)現(xiàn)個(gè)體化用藥、精準(zhǔn)醫(yī)療的重要手段。目前，我國(guó)開展TDM的藥物種類繁多，包括精神類藥物、抗菌藥物、抗腫瘤藥物、免疫抑制劑、心血管系統(tǒng)藥物等，約占臨床常用藥物的10%[4]。對(duì)一些治療指數(shù)低、治療窗窄、毒性大、個(gè)體差異大的藥物需進(jìn)行TDM，如萬古霉素、多黏菌素、阿米卡星等[5]，其重要性和必要性被廣大醫(yī)師和藥學(xué)研究者所認(rèn)識(shí)[6]。

干血點(diǎn)技術(shù)作為一種便捷可行的技術(shù)，在檢測(cè)條件有限、患者依從性差、儲(chǔ)存運(yùn)輸不便情況下能夠有效代替靜脈采血進(jìn)行TDM。然而，干血點(diǎn)技術(shù)在我國(guó)抗菌藥物乃至整個(gè)TDM領(lǐng)域的研究和應(yīng)用較少。本文對(duì)干血點(diǎn)技術(shù)實(shí)施中所涉及的問題以及在抗菌藥物TDM中的應(yīng)用進(jìn)行綜述，以促進(jìn)該項(xiàng)技術(shù)在TDM中應(yīng)用。

1 干血點(diǎn)技術(shù)

1.1 樣本的采集

微量采血作為干血點(diǎn)技術(shù)優(yōu)勢(shì)之一，規(guī)范的血樣尤為重要，嚴(yán)格意義上的干血點(diǎn)是指全血斑點(diǎn)，并不包括干血漿斑點(diǎn)（dried plasma spot）及干血清斑點(diǎn)（dried serum spot），但鑒于均來源于全血，對(duì)此一并討論。干血點(diǎn)樣本的采集、運(yùn)輸和儲(chǔ)存等過程，是結(jié)果差異的主要來源，是保證分析結(jié)果的準(zhǔn)確性和成功轉(zhuǎn)化臨床的基礎(chǔ)[7]。

首先，選擇合適的紙片收集微量血樣是保證最終分析準(zhǔn)確的前提，紙片的材質(zhì)、孔隙大小和厚度等性質(zhì)會(huì)影響微量血樣在紙片上的吸收特性和均勻性，對(duì)最終結(jié)果產(chǎn)生影響[2]。Whatman 903、Ahlstrom 226紙是FDA批準(zhǔn)的兩類醫(yī)療耗材[8]，由100%純棉絨制造，無任何濕強(qiáng)劑添加，應(yīng)用于眾多領(lǐng)域。Whatman FTA Elute卡片與液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）聯(lián)用，廣泛應(yīng)用于臨床研究中藥物小分子及其代謝物的定量分析[2]。對(duì)在抗菌藥物TDM中應(yīng)用的干血點(diǎn)紙片進(jìn)行篩選驗(yàn)證和質(zhì)量控制，將是促進(jìn)其更廣泛應(yīng)用的有效手段。

傳統(tǒng)的干血點(diǎn)采用針刺足后跟、手指或腳趾收集血樣，其中血容量不足、紅細(xì)胞壓積效應(yīng)、全血點(diǎn)中蛋白結(jié)合和基質(zhì)效應(yīng)等問題對(duì)藥物濃度測(cè)定有影響。紅細(xì)胞壓積會(huì)影響全血在紙片的擴(kuò)散均一性，是最受關(guān)注的影響因素[9]。避免或減少紅細(xì)胞壓積影響的技術(shù)和方法包括全點(diǎn)分析法、VAMS、容積式吸收紙盤（VAPD）、限定體積毛細(xì)管吸收的Capitainer-B設(shè)備、可折疊微流控HemaXis DB裝置、采用干血漿斑點(diǎn)替代全血、紅細(xì)胞壓積校正方法等[10]。

近年來，一些更高效便捷、新穎的設(shè)備用于干血點(diǎn)樣本采集，如新型的自動(dòng)化和可穿戴的Fluispotter設(shè)備，可實(shí)現(xiàn)高精度的連續(xù)自動(dòng)采樣[11]；熱誘導(dǎo)相分離（TIPS）和非溶劑誘導(dǎo)相分離（NIPS）相結(jié)合的平板型PAN膜，可有效分離100%血細(xì)胞制得干血漿點(diǎn)[12]，這些新采樣技術(shù)均能有效改善干血點(diǎn)應(yīng)用所面臨的問題，從而推動(dòng)其廣泛應(yīng)用，但在實(shí)際應(yīng)用時(shí)還需要進(jìn)行充分的驗(yàn)證以及考慮成本效益等因素。

1.2 干血點(diǎn)樣本保存、運(yùn)輸

對(duì)于干血點(diǎn)樣品的干燥，一般情況下，建議紙片在室溫（20～25℃）下放置2～3 h，或可采用氮?dú)饬鞔蹈?，具體時(shí)間需要隨紙片性質(zhì)和采血量而調(diào)整[2]。在應(yīng)用中，有必要對(duì)干燥時(shí)間進(jìn)行考察，以確定最佳干燥時(shí)間，保證樣品的均一性。干燥的紙片樣本，無論在室溫、低溫還是復(fù)雜的運(yùn)輸條件下，其穩(wěn)定性優(yōu)于血液樣本，但穩(wěn)定性的時(shí)間還要考察及驗(yàn)證。干血點(diǎn)技術(shù)為TDM樣本的保存運(yùn)輸提供了保障，尤其對(duì)在液體基質(zhì)中不穩(wěn)定的藥物如黏菌素甲磺酸鹽具有重要優(yōu)勢(shì)[13]。此外，干燥處理后的樣本可有效降低其生物危害性，只需簡(jiǎn)單的自封袋包裝便能便捷運(yùn)輸。

1.3 樣本前處理和分析測(cè)定

干血點(diǎn)樣本的打孔和提取是前處理過程的重要部分，從紙片上截取合適大小的樣本和將待測(cè)物從紙片中充分提取出來可有效提高分析的準(zhǔn)確性。一般認(rèn)為小的點(diǎn)樣體積和大的打孔面積會(huì)帶來較好的精密度[14]，穿孔樣本的提取需要根據(jù)分析物的極性、穩(wěn)定性來選擇合適的提取溶劑（甲醇、乙腈或水混合物），選擇適當(dāng)?shù)恼饟u或超聲可提高提取率[2]。也有研究在預(yù)處理前添加適宜的溶劑進(jìn)行預(yù)浸漬，以提高提取效率[15]。LC-MS/MS是生物樣品中藥物定量測(cè)定的首選方法，其高靈敏度為干血點(diǎn)中微量樣本的分析提供了可靠的技術(shù)支持[16]。雖然高效液相色譜、氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜、免疫分析法等也有應(yīng)用，但由于靈敏度、特異度或耗時(shí)問題，應(yīng)用有限[2]。

近年來，在線提取和預(yù)處理方法已被開發(fā)應(yīng)用到干血點(diǎn)樣本的前處理過程，免除了繁瑣的打孔和預(yù)處理步驟，如DBS-MS 500自動(dòng)進(jìn)樣器（CAMAG，瑞士）連接CTC PAL （Zwingen，瑞士）系統(tǒng)，可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)提取和預(yù)處理，與LC-MS/MS聯(lián)用可實(shí)現(xiàn)全自動(dòng)檢測(cè)[17]；Gerstel （Mülheim an der Ruhr，德國(guó)）自動(dòng)干血點(diǎn)樣本制備系統(tǒng)，是集提取、進(jìn)樣、多位置蒸發(fā)站、高壓分配泵等模塊于一體的高效在線樣本處理系統(tǒng)[18]。

2 干血點(diǎn)在抗菌藥物TDM中的應(yīng)用

2.1 β內(nèi)酰胺類

β內(nèi)酰胺類抗生素包括青霉素類、頭孢菌素類以及其他β內(nèi)酰胺類，其抗菌譜廣、毒性低、治療窗寬，在臨床廣泛應(yīng)用，然而藥物不良反應(yīng)也不容忽視，尤其在老年人、兒童以及重癥患者中應(yīng)給予足夠重視，TDM是優(yōu)化治療、減少不良反應(yīng)發(fā)生的重要措施[6]。干血點(diǎn)技術(shù)可有效改善分析物的穩(wěn)定性，例如進(jìn)行常規(guī)TDM時(shí)，一般美羅培南從采血到分析超過4 h就需要干冰存儲(chǔ)，而干血點(diǎn)樣本中的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)顯示美羅培南在－20℃和6℃下至少7 d穩(wěn)定、23℃時(shí)48 h穩(wěn)定，顯示出了優(yōu)勢(shì)[19]。干血點(diǎn)樣本中厄他培南在不同溫度下運(yùn)輸時(shí)至少1個(gè)月穩(wěn)定[20]。此外，在已報(bào)道采用LC-MS/MS測(cè)定干血點(diǎn)中β內(nèi)酰胺類抗生素還有頭孢曲松[21]、哌拉西林-他唑巴坦[22]等，同樣顯示比常規(guī)TDM樣本具有更好的穩(wěn)定性。

2.2 氨基糖苷類和多肽類

氨基糖苷類和多肽類藥物TDM在實(shí)際應(yīng)用中相對(duì)最為廣泛，尤其在腎功能不全患者中已被列為常規(guī)檢測(cè)[5]，在治療過程中對(duì)氨基糖苷類藥物、萬古霉素和多黏菌素等多肽類抗菌藥物進(jìn)行TDM在國(guó)內(nèi)外許多指南中均有提及[23]。Da等[24]采用Whatman-903紙片收集25 μL血漿樣本，采用超高效液相色譜（UPLC） -MS/MS同時(shí)測(cè)定干血漿斑點(diǎn)中的阿米卡星和肌酐濃度，實(shí)現(xiàn)了血藥濃度和腎功能的同時(shí)監(jiān)測(cè)，該方法用于藥動(dòng)學(xué)模擬，并提出劑量建議，為有限資源下獲得阿米卡星個(gè)體化劑量提供了極大的幫助。Scribel等[16]對(duì)干血點(diǎn)中萬古霉素和肌酐同時(shí)進(jìn)行測(cè)定，同樣采用Whatman-903紙片，但選用全血樣本，結(jié)果顯示患者血漿與干血點(diǎn)中萬古霉素濃度存在差異，即使經(jīng)過紅細(xì)胞壓積校正，濃度差異仍然很大，不能用于監(jiān)測(cè)萬古霉素的血藥濃度，而對(duì)肌酐則能獲得滿意的結(jié)果，因此基于干血點(diǎn)技術(shù)的萬古霉素血藥濃度檢測(cè)方法還有待研究。

Tsai等[13]使用LC-MS/MS測(cè)定干血點(diǎn)中黏菌素的主要成分（黏菌素A和黏菌素B），使用乙腈和0.15%甲酸水溶液（1∶1）作為提取液，線性分別為0.13～10.4 mg/L、 0.27～21.6 mg/L，通過對(duì)易水解的前藥黏菌素甲磺酸鹽（CMS）在干血點(diǎn)中的穩(wěn)定性考察，顯示室溫放置48 h后CMS水解少于4%，可有效降低因水解所產(chǎn)生的偏差，成為黏菌素定量的重要替代方法。Cangemi等[25]采用干血漿斑點(diǎn)樣本以及干燥樣點(diǎn)設(shè)備（DSSD）來定量黏菌素，避免了紅細(xì)胞壓積影響，為臨床應(yīng)用提供了有效的支持。

2.4 抗結(jié)核類藥物

結(jié)核病是全球主要的公共衛(wèi)生問題之一，抗結(jié)核藥物的TDM對(duì)結(jié)核病的治療非常重要，然而有限的PK/PD數(shù)據(jù)及不發(fā)達(dá)地區(qū)的監(jiān)測(cè)條件不足，使得抗結(jié)核藥在治療中受到限制，尤其是兒童患者[28]。Martial等[28]對(duì)兒童患者的一線抗結(jié)核藥物（利福平、吡嗪酰胺和乙胺丁醇）的干血點(diǎn)和常規(guī)靜脈采樣的測(cè)定結(jié)果進(jìn)行分析和對(duì)比，利福平和吡嗪酰胺在兩種方法中具有良好的一致性，而乙胺丁醇顯示有較大差異。Lee等[29]采用LC-MS/MS對(duì)比分析靜脈和毛細(xì)血管干血點(diǎn)以及血漿中的異煙肼濃度，顯示三者之間存在偏差，但成比例，相關(guān)性良好，鑒于缺乏對(duì)紅細(xì)胞壓積影響的考察和足夠的樣本數(shù)量驗(yàn)證，這項(xiàng)研究依然存在著局限性。

2.5 多種抗菌藥物同時(shí)檢測(cè)

開發(fā)多種抗菌藥物同時(shí)檢測(cè)的方法，在TDM中具有非常大的應(yīng)用價(jià)值， Barco等[30]開發(fā)了采用VAMS設(shè)備聯(lián)用LC-MS/MS同時(shí)測(cè)定哌拉西林-他唑巴坦、美羅培南、利奈唑胺和頭孢他啶4種藥物的方法，并將這種新的采樣設(shè)備與傳統(tǒng)的干血點(diǎn)技術(shù)所檢測(cè)的結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，VAMS-LC-MS/MS方法對(duì)4種藥物均有良好的選擇性、精密度和重現(xiàn)性，可以在不受紅細(xì)胞壓積影響的情況下進(jìn)行準(zhǔn)確的定量，現(xiàn)已被應(yīng)用于兒科患者的TDM。Ferrone等[31]建立了HPLC-PDA（二極管陣列檢測(cè)器）測(cè)定毛細(xì)血管干血點(diǎn)樣本和靜脈干血點(diǎn)樣本中利奈唑胺和環(huán)丙沙星濃度的方法，選用非纖維素Bond Elut DMS（干基質(zhì)點(diǎn)）樣品制備卡，可有效減少紅細(xì)胞壓積帶來的分析誤差，結(jié)果顯示兩者相關(guān)性良好，準(zhǔn)確度、精密度等驗(yàn)證結(jié)果良好，可作為常規(guī)監(jiān)測(cè)的重要工具。

2.6 其他抗菌藥物

達(dá)托霉素對(duì)革蘭陽(yáng)性菌有快速殺菌作用，具有濃度依賴性，對(duì)其進(jìn)行TDM有助于提高療效、改善預(yù)后， Baietto等[32]采用UPLC-PDA檢測(cè)方法定量血漿和干血漿斑點(diǎn)中達(dá)托霉素，分別用乙腈和乙酸乙酯∶乙酸∶丙酮∶水（50∶20∶20∶10）提取，兩種方法在0.781～200 mg/L校正范圍內(nèi)呈線性相關(guān)，藥物濃度也具有顯著的相關(guān)性（P＜0.001，r2=0.919），方法驗(yàn)證提示可適用于TDM。

磷霉素可有效治療由多藥耐藥細(xì)菌引起的嚴(yán)重感染，然而在危重癥患者中PK研究和TDM的缺乏給治療帶來了困難， Parker等[33]利用LCMS/MS對(duì)干血點(diǎn)中磷霉素進(jìn)行定量，并且采用了VAMS設(shè)備進(jìn)行樣本的收集，結(jié)果顯示準(zhǔn)確度和精密度均在±15%偏差內(nèi)，線性為5～2 000 mg/L，但穩(wěn)定性和回收率的考察結(jié)果顯示其應(yīng)用存在不足。

另外氟喹諾酮類藥物莫西沙星，在口服治療耐多藥結(jié)核病中具有良好前景應(yīng)用。Vu 等[34]開發(fā)一種LC-MS/MS測(cè)定干血點(diǎn)中莫西沙星的方法，觀察紅細(xì)胞壓積和血容量的影響，并對(duì)靜脈和指尖干血點(diǎn)中的藥物濃度進(jìn)行了對(duì)比，經(jīng)過充分驗(yàn)證和對(duì)紅細(xì)胞壓積校正，可適用于TDM。

3 總結(jié)與展望

通過對(duì)近年來關(guān)于干血點(diǎn)及其在抗菌藥物TDM中的應(yīng)用相關(guān)文獻(xiàn)的回顧發(fā)現(xiàn)，干血點(diǎn)技術(shù)的開展，以及新技術(shù)、儀器、方法相繼出現(xiàn)，使該項(xiàng)技術(shù)也成功用于多種抗菌藥物的TDM。其微量采血、優(yōu)良的適應(yīng)性、便捷高效的樣本儲(chǔ)存運(yùn)輸?shù)冉^對(duì)優(yōu)勢(shì)，使得干血點(diǎn)技術(shù)在有限的資源環(huán)境下表現(xiàn)出了巨大的應(yīng)用潛力。盡管我國(guó)抗菌藥物TDM中干血點(diǎn)技術(shù)的應(yīng)用有限，但不斷深入開展和研究，將會(huì)為個(gè)體化用藥拓展新的發(fā)展方向。