萬 璐，吳小軍

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院呼吸和危重癥科，湖北 武漢 430060)

銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa，PA)是一種適應(yīng)性很強的條件致病菌，其擁有較強的代謝可塑性、多樣性及產(chǎn)毒性[1]。PA感染常發(fā)生在燒傷、癌癥、呼吸道感染等免疫力低下患者，已在世界范圍內(nèi)造成嚴(yán)重的院內(nèi)感染[2-3]。2017年，PA被世界衛(wèi)生組織認(rèn)定為最具威脅性的細菌之一，同時也被列為急需新藥治療的重點病原體之一。Ⅲ型分泌系統(tǒng)(type Ⅲ secretion system，T3SS)是PA急性感染過程中的關(guān)鍵毒性因子[4]，該系統(tǒng)可將細菌分泌的幾種效應(yīng)蛋白靶向注入宿主細胞內(nèi)，這些效應(yīng)蛋白可在宿主細胞內(nèi)激活并幫助細菌逃避宿主細胞的吞噬。胞外酶U(exoenzyme U，ExoU)、胞外酶S(exoenzyme S，ExoS)、胞外酶T(exoenzyme T，ExoT)和胞外酶Y(exoenzyme Y，ExoY)是目前功能比較明確的4種PA的T3SS的效應(yīng)蛋白。目前，普遍認(rèn)為T3SS及其主要的效應(yīng)蛋白是PA感染宿主細胞并致病的關(guān)鍵，越來越多的學(xué)者致力于T3SS及其效應(yīng)蛋白的調(diào)控機制、抑制劑的研究，以期為PA的治療提供新的思路。本文就PA的T3SS的結(jié)構(gòu)組成及其效應(yīng)蛋白分泌方式、作用機制相關(guān)研究進行綜述，并對該系統(tǒng)和效應(yīng)蛋白的針對性治療策略進行展望,旨在為新型抗菌藥物的研發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 T3SS結(jié)構(gòu)組成

1996年首次發(fā)現(xiàn)PA的T3SS，并于后續(xù)的研究中確定T3SS是一套結(jié)構(gòu)和功能高度保守的蛋白傳遞系統(tǒng)[5]。PA中的T3SS總體結(jié)構(gòu)形似注射器針頭狀裝置，故被稱為T3SS注射裝置。根據(jù)功能可將T3SS的組成蛋白分為細菌膜裝置蛋白、轉(zhuǎn)位子蛋白、效應(yīng)蛋白和分子伴侶4類。細菌膜裝置蛋白是T3SS的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，橫跨細菌細胞內(nèi)外膜，形似指向細胞外的注射體。轉(zhuǎn)位子蛋白主要是指與宿主細胞接觸并可轉(zhuǎn)運效應(yīng)蛋白的部分。T3SS的效應(yīng)蛋白主要有ExoU、ExoY、ExoT和ExoS，這4種效應(yīng)蛋白幾乎不會在同一細菌內(nèi)同時表達，同一株P(guān)A也不會同時攜帶ExoS基因和ExoU基因。近期有學(xué)者提出了一些新的效應(yīng)蛋白，如PA效應(yīng)蛋白A和B[4]，但其具體結(jié)構(gòu)組成、功能還有待進一步研究。T3SS的分子伴侶多為小分子酸性蛋白，如PA ExoS和ExoU的特異性分子伴侶(SpcS和SpcU)等，可特異性與效應(yīng)蛋白結(jié)合，在效應(yīng)蛋白轉(zhuǎn)運過程中維持蛋白的穩(wěn)定性。

PA的調(diào)控基因中，與編碼、調(diào)控相關(guān)的5個操縱子(pscNOPQRSTU、popNpcr1234DR、pcrGVHpopBD、exsCEBA和exsDpscBCDEFGHIJKL)在染色體上相鄰構(gòu)成了毒力島，而編碼效應(yīng)蛋白和分子伴侶的基因則位于染色體的其他位置上[6-7]。

2 效應(yīng)蛋白

目前發(fā)現(xiàn)了多種PA的效應(yīng)蛋白，其中已明確功能的主要有ExoU、ExoS、ExoT和ExoY 4種，這些效應(yīng)蛋白可直接進入宿主細胞內(nèi)，引起宿主細胞凋亡。

2.1 ExoUExoU是由687個氨基酸組成、相對分子質(zhì)量為 74 000的水溶性蛋白質(zhì)。ExoU具有磷脂酶A2(phospholipase A2，PLA2)活性，屬于鈣非依賴性磷脂酶[8]，該酶的作用可導(dǎo)致宿主細胞快速裂解。ExoU在空間結(jié)構(gòu)上可折疊為4個結(jié)構(gòu)域[9]，結(jié)構(gòu)域1位于靠近N端的55～101位氨基酸，結(jié)構(gòu)域1是分子伴侶SpcU結(jié)合區(qū)，SpcU與結(jié)構(gòu)域1結(jié)合后可使ExoU在細菌胞質(zhì)中處于失活狀態(tài)，SpcU還能引導(dǎo)ExoU進入T3SS，隨后進入宿主細胞內(nèi)發(fā)揮作用；結(jié)構(gòu)域2是PLA2結(jié)構(gòu)域，位于106～471位氨基酸，是由絲氨酸(Ser142)和天冬氨酸(Asp344)殘基組成的催化二聯(lián)體；結(jié)構(gòu)域3和4位于ExoU的C端的480～580位氨基酸和588～687位氨基酸，結(jié)構(gòu)域4是一個四螺旋束的膜定位區(qū)，結(jié)構(gòu)域3和4主要發(fā)揮膜穩(wěn)定的功能，使ExoU能夠靶向進入宿主細胞膜的區(qū)域發(fā)揮作用。研究報道，結(jié)構(gòu)域3可能是一個泛素結(jié)合位點[10]，真核細胞泛素[11]、泛素化蛋白及Cu/Zn超氧化物歧化酶1都可能是ExoU的重要活化因子。

ExoU發(fā)揮磷脂酶作用需要真核細胞提供激活因子，這是細菌的一種自我保護機制，在水解宿主細胞的膜性結(jié)構(gòu)的同時不影響自身的膜結(jié)構(gòu)。另外，在早期感染中，ExoU對中性粒細胞等細胞的侵襲能力較強，導(dǎo)致宿主防御功能下降，因此，亟須研制特異性的抑制劑，在早期有效控制感染，從而減輕患者的癥狀，改善患者的預(yù)后。

2.2 ExoS和ExoTExoS和ExoT的編碼基因約有76%的序列同源性，二者蛋白質(zhì)鏈的羧基端均為二磷酸腺苷核糖轉(zhuǎn)移酶(adenosine diphosphate ribosyltransferase，ADPr)結(jié)構(gòu)域，氨基端均為三磷酸鳥苷酶活化蛋白(GTPase activating protein，GAP)結(jié)構(gòu)域[12-14]。ExoS和ExoT均能與分子伴侶SpcS結(jié)合從而進一步發(fā)揮作用。ExoS和ExoT的Rho GAP的活性在生理和生物化學(xué)特性上完全相同，作用于真核細胞的小分子GTP酶，導(dǎo)致宿主細胞肌動蛋白骨架破壞，降低吞噬細胞對細菌的吞噬作用[15-16]。

2.2.1 ExoSExoS由453個氨基酸組成，ADPr是ExoS發(fā)揮作用的最主要酶，ADPr作用的靶蛋白范圍廣泛，包括埃茲蛋白、根蛋白、膜突蛋白以及具有GTP酶活性的小G蛋白家族。ADPr會引起宿主細胞膜骨架的ADP核糖磷酸化，抑制DNA合成和囊泡運輸作用，引起宿主細胞內(nèi)的信號傳導(dǎo)過程失偶聯(lián)，誘導(dǎo)細胞凋亡。ExoS還具有T淋巴細胞絲裂原作用，可促進T淋巴細胞有絲分裂，誘導(dǎo)大量T淋巴細胞活化，這種作用與ADPr的活性無關(guān)，由此活化的T細胞易凋亡。之前的觀點認(rèn)為PA是一種在宿主細胞外發(fā)揮作用的細菌，但近來的研究表明，PA的效應(yīng)蛋白ExoS的ADPr可以促進細菌在宿主細胞的內(nèi)化，尤其是在上皮細胞內(nèi)，并且保護宿主細胞內(nèi)環(huán)境的相對穩(wěn)定，延長宿主細胞的生存時間，抵抗ExoS和ExoT的Rho GAP酶的抗吞噬作用，使得細菌在宿主細胞內(nèi)持續(xù)復(fù)制、繁殖[15-17]。ExoS 的ADPr酶促進細菌與上皮細胞共存可能與上述提到的ExoS的誘導(dǎo)細胞凋亡的過程相悖，仍需進一步的研究證實。

2.2.2 ExoTExoT由457個氨基酸組成，是唯一一種在所有PA中都表達的效應(yīng)蛋白，這表明ExoT在PA中發(fā)揮最基本的功能。ExoT具有與ExoS相同的ADPr活性，但其作用的底物并不完全相同，ExoT 的ADPr可靶向作用于Crk樣蛋白(CrK-like proteins，CRKL)和糖酵解酶磷酸甘油酸激酶1(phosphoglycerate kinase 1，PGK1)。CRKL是一種細胞內(nèi)信號結(jié)合蛋白，可在肺癌、胃癌、胰腺癌等癌細胞內(nèi)表達，參與細胞內(nèi)細胞因子、生長因子及BCR-ABL 融合蛋白等的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，促進癌細胞的增殖、分化、結(jié)合和轉(zhuǎn)移[18]。PGK1是糖酵解過程中的關(guān)鍵代謝酶，催化1，3-二磷酸甘油酸轉(zhuǎn)化為3-磷酸甘油酸，產(chǎn)生糖酵解途徑中的第1個ATP。PGK1除了發(fā)揮催化產(chǎn)能的活性，還是一種蛋白激酶，參與多種癌基因的表達和調(diào)控，影響腫瘤中與增殖轉(zhuǎn)移有關(guān)的信號通路，對腫瘤細胞的增殖、生長和轉(zhuǎn)移表現(xiàn)出明顯的促進作用[19]。有研究表明，ExoT是PA抗擊宿主炎癥細胞的關(guān)鍵效應(yīng)蛋白，這與ADPr作用于細胞內(nèi)的CRKL激活宿主細胞的凋亡通路相關(guān)[20]，ExoT的ADPr還能作為誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的重要分子[18-19，21]。

2.3 ExoYExoY由378種氨基酸組成，與其他3種效應(yīng)蛋白不同的是目前ExoY的分子伴侶尚未明確。ExoY具有核苷酸環(huán)化酶的作用，ExoY進入宿主細胞后通過與F-肌動蛋白結(jié)合而激活，促進宿主細胞產(chǎn)生核苷酸，如環(huán)磷酸腺苷等，這些單磷酸環(huán)核苷酸的升高會引起內(nèi)皮細胞tau蛋白過度磷酸化，從而使微管破裂、內(nèi)皮細胞通透性增高，導(dǎo)致細胞水腫乃至凋亡[22-24]。有研究表明，ExoY分泌缺乏的PA菌株要比ExoY分泌活躍的PA菌株的毒力更大，即ExoY可能具有緩解PA毒力的作用[25]。這可能是細菌延長自身生存、維持宿主慢性感染的一種方式。

3 PA的T3SS及效應(yīng)蛋白抑制劑的研究進展

PA的耐藥形勢日益嚴(yán)峻，現(xiàn)已嚴(yán)重威脅人類的生命健康。PA由于其高耐藥性和基因多樣性，臨床防治具有一定的挑戰(zhàn)性[26],因此，亟須開發(fā)新的作用模式的抗菌藥物，如針對PA的T3SS及其分泌的效應(yīng)蛋白的抑制劑。

3.1 亞水楊基酰肼類亞水楊基酰肼衍生物是一類小分子物質(zhì)，能夠抑制PA的T3SS的分泌、轉(zhuǎn)錄等，其活性化合物對T3SS抑制率的半抑制濃度一般在5～25 mol·L-1[27]。亞水楊基酰肼衍生物的抑制作用可表現(xiàn)在以下幾個方面：下調(diào)T3SS相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄作用；抑制T3SS效應(yīng)蛋白的分泌和轉(zhuǎn)運；影響細菌的運動能力等。近年來，對于亞水楊基酰肼衍生物研究較多，已知的幾種類型的亞水楊基酰肼類藥物如INP0010、INP0400、INP0007對沙門菌、志賀菌和耶爾森菌中的T3SS有較好的抑制作用。亞水楊基酰肼INP0341也被證實可抑制PA的生物膜形成，減弱其感染能力[28]。

3.2 苯氧乙酰胺類苯氧乙酰胺類抑制劑通過作用于PA的T3SS針尖樣結(jié)構(gòu)上的PscF蛋白，特異性影響T3SS效應(yīng)蛋白的分泌和轉(zhuǎn)運，降低T3SS的毒力作用[29]。PscF蛋白在T3SS的ExoS和ExoU分泌和轉(zhuǎn)運效應(yīng)蛋白的過程中發(fā)揮著重要作用，苯氧乙酰胺類與PscF蛋白結(jié)合后能夠持久地降低PA的感染能力。

3.3 黃芩苷群體感應(yīng)(quorum sensing，QS)是PA的濃度依賴性信號傳遞調(diào)控機制，PA可分泌多種自誘導(dǎo)物，細菌通過感應(yīng)這些自誘導(dǎo)物來判斷周圍菌群密度和環(huán)境變化，當(dāng)自誘導(dǎo)物密度達到閾值后，啟動調(diào)控基因表達和細菌生物學(xué)行為[30]。目前發(fā)現(xiàn)PA存在3個QS系統(tǒng)，其中包括PA喹諾酮信號分子(Pseudomonasquinolone signal，PQS)介導(dǎo)的QS系統(tǒng)[31]。在PA中，PQS介導(dǎo)的QS系統(tǒng)可通過調(diào)控下游轉(zhuǎn)錄因子——PQS結(jié)合因子(PQS-binding response regulator，PqsR)的轉(zhuǎn)錄，進而影響PA的生物膜形成、T3SS的分泌等過程[32-34]。黃芩苷是從植物黃芩的干燥根中提取分離出來的一種黃酮類化合物，有研究表明，黃芩苷能夠通過抑制PqsR轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄進而抑制T3SS的表達[35-36]。

3.4 磷脂酶抑制劑LEE等[37]通過高通量篩選發(fā)現(xiàn)一種針對ExoU的化合物pseudolipasin A,研究表明，該化合物不會影響T3SS的分泌或注射過程，而是通過靶向抑制ExoU的PLA2活性而發(fā)揮作用。目前已知的磷脂酶抑制劑有花生四烯酸甲酯等，特異性靶向PA的PLA2的抑制劑研究成果較少，尚需進一步探索。

3.5 磺酰胺衍生物KIM等[38]篩選鑒定了新的ExoU的抑制劑磺胺衍生物。但磺酰胺衍生物的活性并沒有pseudolipasin A高?；酋０费苌镌诮Y(jié)構(gòu)上呈現(xiàn)多樣化，可以作為進一步開發(fā)ExoU抑制劑的優(yōu)選對象，且可以與常見的抗菌藥物合用以增強抑菌作用。目前，該化合物正在進一步設(shè)計實驗中。

4 展望

T3SS及其4種主要的效應(yīng)蛋白ExoU、ExoS、ExoT和ExoY在PA的感染過程中發(fā)揮著關(guān)鍵的毒性作用。盡管近些年來對T3SS及其效應(yīng)蛋白的研究取得了很多進展，但是對于靶向T3SS及其效應(yīng)蛋白的抗菌藥物的研發(fā)仍有很多問題需要解決。靶向T3SS及其效應(yīng)蛋白的抗菌藥物不僅可以降低細菌對抗生素的耐藥作用，而且可與常規(guī)抗菌藥物聯(lián)用加強抗菌作用[39]?，F(xiàn)在靶向T3SS及其效應(yīng)蛋白的抗菌藥物多處于試驗階段，尚未投入臨床使用，但新型靶向藥物為臨床治療提供了一個新的治療思路和方法。