邢小芳，柏 青，何飛敏，邵文璠，李春健，黃 晶，華 蕾，王永梅

(云南省第三人民醫(yī)院，云南 昆明 650011)

妊娠后女性體重會(huì)大幅增加，只要沒(méi)有超出標(biāo)準(zhǔn)范圍，一般不會(huì)造成不良影響，但如果孕婦過(guò)度肥胖，會(huì)給自身和胎兒帶來(lái)不利影響。對(duì)孕婦自身而言，過(guò)度肥胖可引起難產(chǎn)、胎兒死亡等，產(chǎn)后可誘發(fā)高血糖、高血脂、高血壓等[1-2]。對(duì)胎兒可導(dǎo)致發(fā)育遲緩，甚至引起新生兒神經(jīng)管缺陷，另外胎兒在長(zhǎng)大后相較于正常人也容易發(fā)生肥胖、高血脂、高血壓等[3-4]。目前對(duì)于妊娠期肥胖的治療以鍛煉和控制飲食為主，但是多數(shù)孕婦依從性較差；部分肥胖孕婦使用辛伐他汀和二甲雙胍治療[5]，但均有不良反應(yīng)，耐受性較差，因此開(kāi)發(fā)安全的藥物用于妊娠期肥胖的治療勢(shì)在必行。紫檀芪是葡萄中的活性成分，其和白藜蘆醇在藥理活性上具有一定的相似性[6]，理論上有用于妊娠期肥胖治療的潛在價(jià)值。本研究通過(guò)構(gòu)建妊娠期肥胖小鼠模型，探討了紫檀芪對(duì)糖脂代謝的影響及可能作用機(jī)制，以為其臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 60只雌性和30只雄性清潔級(jí)昆明小鼠，均購(gòu)于昆明醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(滇)K2020-0004。購(gòu)買后飼養(yǎng)于云南中醫(yī)藥大學(xué)標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物房，溫度控制為21～23 ℃，濕度60%，光照/黑暗12 h，小鼠日常給予自來(lái)水飲用和普通飼料喂養(yǎng)，造模時(shí)相應(yīng)小鼠給予高脂飼料喂養(yǎng)，飼料均購(gòu)于昆明醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)云南省第三人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(202002)。

1.2實(shí)驗(yàn)試劑 0.9%氯化鈉注射液購(gòu)于貴州科倫藥業(yè)有限公司；胰島素ELISA試劑盒購(gòu)于上海酶聯(lián)生物科技公司；高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)生化試劑盒、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)生化試劑盒、總膽固醇(TC)生化試劑盒和三酰甘油(TG)生化試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所；PVDF膜購(gòu)于Millipore公司；GAPDH單克隆抗體、CD36單克隆抗體和載脂蛋白B(Aop B)單克隆抗體購(gòu)于Santa Cruz公司；成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子21(FGF21)單克隆抗體購(gòu)于Abcam公司；二抗購(gòu)于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3儀器設(shè)備 高精度防水電子天平(FX-200GD型，日本 AND 公司)；低溫高速離心機(jī)(Mini Spin型，德國(guó) Eppendorf 公司)；酶標(biāo)儀(MLDEL680型，美國(guó) Bio-Rad公司)；凝膠電泳圖像分析儀(Gel Doc XR型，美國(guó) Bio-Rad公司)；石蠟切片機(jī)(RM2235型，德國(guó) LEICA 公司)；石蠟包埋機(jī)(TKD-BMB型，湖北康強(qiáng)醫(yī)療器械有限公司)；倒置/熒光/相差顯微鏡(IX73型，日本 OLYMPUS 公司)；蛋白電泳系統(tǒng)(Mini-PROTEAN Tetra Cell型，美國(guó)伯樂(lè)公司)。

1.4實(shí)驗(yàn)方法 所有小鼠均給予適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，1周后隨機(jī)選取10只雌鼠作為正常組，其余50只雌鼠給予高脂飼料(83.25%基礎(chǔ)飼料、10%豬油、5%蔗糖、1.5%膽固醇和0.25%膽酸鈉)喂養(yǎng)2個(gè)月建立肥胖模型。2個(gè)月后，將所有小鼠按照雄性和雌性1∶2比例進(jìn)行合籠交配。次日清晨將查到陰道栓的肥胖孕鼠隨機(jī)分為模型組、紫檀芪低劑量組、紫檀芪中劑量組和紫檀芪高劑量組，每組12只。受孕4 d后，每天10：00-12：00，正常組和模型組孕鼠給予生理鹽水1 mL灌胃，紫檀芪低、中、高劑量組孕鼠分別給予2.5 mg/(kg·d)、5 mg/(kg·d)、10 mg/(kg·d)紫檀芪懸混液(相應(yīng)劑量的紫檀芪懸混于1 mL生理鹽水中)灌胃，均連續(xù)灌胃2周。灌胃期間正常組孕鼠給予普通飼料喂養(yǎng)，各造模孕鼠繼續(xù)給予高脂飼料喂養(yǎng)。

1.5動(dòng)物取材 末次灌胃結(jié)束后，麻醉孕鼠后腹主動(dòng)脈取血，然后取出肝臟，一部分置入超低溫冰箱中用于相關(guān)蛋白表達(dá)檢測(cè)，一部分置入多聚甲醛溶液中用于病理學(xué)觀察和相關(guān)蛋白免疫熒光檢測(cè)。

1.6檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.6.1血脂和血糖、胰島素 按照試劑盒提供的說(shuō)明書(shū)檢測(cè)血脂4項(xiàng)(TC、TG、HDL-C、LDL-C)、血糖、胰島素水平，計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)。胰島素抵抗指數(shù)=血糖×胰島素/22.5。

1.6.2組織病理學(xué)表現(xiàn) 將之前用固定液固定的組織取出，用清水洗干凈組織，把組織切成小塊，置于包埋盒中，自動(dòng)脫水機(jī)脫水，二甲苯透明后石蠟包埋；切片：厚度為4 μm；展片后進(jìn)行常規(guī)HE染色，置入載玻片封片即完成，之后采用熒光倒置顯微鏡收集圖像，每張切片選取5個(gè)不同的視野。

1.6.3肝臟組織中FGF21、CD36和Apo B免疫熒光染色 將組織切片后，加入二甲苯10 min，共2次；100%的乙醇10 min，共2 次；95%的乙醇10 min；75%的乙醇10 min；TBST5 min，共3次；內(nèi)源性過(guò)氧化物酶阻斷液 AR1108 10 min；0.25%的胰酶10～20 min/100 ℃PBS煮10 min ；去離子水5 min，共3 次； 5% 的BSA 封閉1 min；一抗(1∶50)4 ℃過(guò)夜；次日TBST 5洗滌3次；二抗(1∶100)室溫避光孵育 2 h；TBST洗滌3次； 晾干，加入DIPI 50 μL避光封片；熒光倒置顯微鏡觀察并收集圖像，每個(gè)圖片選取5個(gè)不同的視野。

1.6.4肝臟組織中FGF21、CD36和ApoB表達(dá)情況 Western blot法檢測(cè)：采用總蛋白提取試劑盒提取總蛋白；運(yùn)用BCA法對(duì)蛋白進(jìn)行定量，定量后調(diào)平；行SDS-PAGE電泳，電泳時(shí)壓縮膠電壓為60 V，分析膠電壓為100 V，待電泳樣品分離至膠下緣時(shí)結(jié)束電泳；轉(zhuǎn)膜；恒定電流260 mA 轉(zhuǎn)膜 1 h；將膜放入封閉液中，室溫?fù)u床封閉2 h；一抗孵育4 ℃過(guò)夜；二抗室溫?fù)u床孵育1 h；用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行分析并采集圖像，結(jié)果采用檢測(cè)蛋白的灰度值/GAPDH的灰度值表示。

2 結(jié) 果

2.1各組血糖、胰島素和血脂水平比較 模型組孕鼠血清TG、TC、LDL-C水平及血糖、胰島素、胰島素抵抗指數(shù)均明顯高于正常組(P均<0.05)，血清HDL-C水平明顯低于正常組(P<0.05)；紫檀芪各組孕鼠血清TG、TC、LDL-C水平及血糖、胰島素、胰島素抵抗指數(shù)均明顯低于模型組(P均<0.05)，血清HDL-C水平均明顯高于模型組(P均<0.05)；紫檀芪中、高劑量組血清TG、LDL-C、血糖及紫檀芪高劑量組TC、胰島素、胰島素抵抗指數(shù)均明顯低于紫檀芪低劑量組(P均<0.05)；紫檀芪高劑量組血清HDL-C水平均明顯高于紫檀芪低、中劑量組(P均<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 正常組和肥胖各組孕鼠血脂指標(biāo)及血糖、胰島素、胰島素抵抗指數(shù)比較

2.2各組肝臟組織病理學(xué)表現(xiàn) 正常組孕鼠肝細(xì)胞大小均一，細(xì)胞核基本位于細(xì)胞中央，分布均勻；模型組孕鼠肝臟組織中彌漫有大量的脂肪空泡，無(wú)明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；相較于模型組，紫檀芪各組孕鼠肝臟組織脂肪空泡明顯減少，且均無(wú)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。見(jiàn)圖1。

圖1 正常組和肥胖各組孕鼠肝臟組織HE染色情況(×400)

2.3各組肝臟組織中FGF21、CD36和ApoB免疫熒光染色表現(xiàn) 細(xì)胞核染色為藍(lán)色，F(xiàn)GF21、CD36和ApoB陽(yáng)性表達(dá)為綠色；與正常組比較，模型組孕鼠肝臟組織中FGF21、CD36陽(yáng)性表達(dá)明顯增多，Apo B陽(yáng)性表達(dá)明顯減少；與模型組比較，紫檀芪各組孕鼠肝臟組織中FGF21和CD36陽(yáng)性表達(dá)均明顯減少，Apo B陽(yáng)性表達(dá)均明顯增多；與紫檀芪低、中劑量組比較，紫檀芪高劑量組FGF21和CD36陽(yáng)性表達(dá)更少，Apo B陽(yáng)性表達(dá)更多。見(jiàn)圖2。

圖2 正常組和肥胖各組孕鼠肝臟組織中FGF21、CD36和Apo B免疫熒光染色情況(×200)

2.4各組肝臟組織中FGF21、CD36和ApoB表達(dá)情況 模型組孕鼠肝臟組織中FGF21和CD36相對(duì)表達(dá)量均明顯高于正常組(P均<0.05)，Apo B相對(duì)表達(dá)量明顯低于正常組(P<0.05)；紫檀芪各組孕鼠肝臟組織中FGF21和CD36相對(duì)表達(dá)量均明顯低于模型組(P均<0.05)，Apo B相對(duì)表達(dá)量均明顯高于模型組(P均<0.05)；紫檀芪中、高劑量組FGF21相對(duì)表達(dá)量均明顯低于紫檀芪低劑量組(P均<0.05)，且紫檀芪高劑量組明顯低于紫檀芪中劑量組(P<0.05)；紫檀芪高劑量組CD36相對(duì)表達(dá)量均明顯低于紫檀芪低、中劑量組(P均<0.05)，Apo B相對(duì)表達(dá)量均明顯高于紫檀芪低、中劑量組(P均<0.05)。見(jiàn)圖3和表2。

圖3 正常組和肥胖各組孕鼠肝臟組織中FGF21、CD36和Apo B表達(dá)情況

表2 正常組和肥胖各組孕鼠肝臟組織中FGF21、CD36和Apo B相對(duì)表達(dá)量比較

3 討 論

肥胖孕鼠造模較為復(fù)雜，理論上妊娠后給予肥胖造模更符合孕期肥胖的特點(diǎn)，但嚙齒類動(dòng)物的孕期較短，小鼠孕期只有21 d，在這么短的時(shí)間內(nèi)還沒(méi)有一種藥物可另其急劇發(fā)胖[7]。為此本實(shí)驗(yàn)參考文獻(xiàn)報(bào)道[8],先高脂飲食建立肥胖模型，后合籠受孕，另外在整個(gè)孕期繼續(xù)給予高脂飲食喂養(yǎng)，以盡可能地保證動(dòng)物模型與人孕期肥胖相似。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組孕鼠肝臟HE染色見(jiàn)大量脂肪空泡，血液學(xué)檢測(cè)存在胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)和明顯的高血脂，提示造模相對(duì)成功。

目前研究認(rèn)為紫檀芪沒(méi)有毒副作用，其雖然不能降低體重，但具有降低血脂作用[9-10]。如胡向陽(yáng)等[11]研究發(fā)現(xiàn)，紫檀芪能夠明顯降低高血脂癥小鼠TG和LDL-C水平，改善高血脂癥小鼠狀態(tài)。Zhang等[12]研究證實(shí)紫檀芪可以調(diào)節(jié)動(dòng)脈粥樣硬化小鼠血清中血脂的含量，保護(hù)血管。本研究結(jié)果顯示，紫檀芪各組孕鼠血清TG、TC和LDL-C水平均明顯低于模型組，HDL-C水平明顯高于模型組。提示紫檀芪可調(diào)節(jié)肥胖孕鼠血脂代謝。

肥胖和糖尿病具有明顯的相關(guān)性。一項(xiàng)流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，肥胖人群發(fā)生糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)是正常人群的3倍，在肥胖早期可能存在胰島素抵抗[13]。肥胖不僅可以促進(jìn)胰島素抵抗的發(fā)展，也是導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生糖脂代謝紊亂的核心因素[14]。本研究結(jié)果顯示，模型組孕鼠血糖、胰島素和胰島素抵抗指數(shù)均明顯升高，紫檀芪各組上述指標(biāo)均明顯降低。提示肥胖孕鼠存在高血糖、高胰島素血癥和胰島素抵抗，而紫檀芪可以明顯改善這一狀態(tài)。

肥胖患者存在脂質(zhì)代謝紊亂，脂代謝基因FGF21、CD36、Apo B與肥胖密切相關(guān)。FGF21主要由肝細(xì)胞分泌，其可以促進(jìn)脂肪細(xì)胞攝取葡萄糖，增加胰島素的敏感性，降低血糖，但其過(guò)量分泌可促進(jìn)脂質(zhì)物質(zhì)，特別是脂質(zhì)中TG的合成[15]。CD36又稱之為脂肪酸轉(zhuǎn)位酶，其是調(diào)控外源性脂肪酸進(jìn)入細(xì)胞的關(guān)鍵因子，其表達(dá)過(guò)多會(huì)造成外源性脂肪酸在器官和組織中過(guò)量積累，進(jìn)而造成肥胖；Apo B在功能上與CD36正好相反，其主要作用為幫助內(nèi)源性脂肪酸從細(xì)胞中轉(zhuǎn)運(yùn)出來(lái)，進(jìn)而分解代謝掉[16-17]。FGF21、CD36和Apo B共同作用，促進(jìn)了肥胖的發(fā)生和發(fā)展，調(diào)節(jié)三者的表達(dá)可能有預(yù)防肥胖發(fā)生或抑制肥胖相關(guān)疾病進(jìn)展的作用。本研究結(jié)果顯示，模型組孕鼠肝臟組織中FGF21、CD36表達(dá)量明顯高于正常組，Apo B表達(dá)量明顯低于正常組，說(shuō)明肥胖孕鼠存在FGF21、CD36和Apo B表達(dá)異常；與模型組比較，紫檀芪各組小鼠FGF21、CD36表達(dá)量明顯降低，Apo B表達(dá)量明顯升高，且紫檀芪高劑量組各指標(biāo)改善更明顯，說(shuō)明紫檀芪可調(diào)節(jié)FGF21、CD36和Apo B的表達(dá)，并呈一定劑量依賴性。

綜上所述，紫檀芪可調(diào)節(jié)肥胖孕鼠的糖脂代謝，其作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)FGF21、CD36、Apo B表達(dá)有關(guān)。但本實(shí)驗(yàn)沒(méi)有進(jìn)一步觀察紫檀芪對(duì)肥胖孕鼠子代的影響，特別是安全性方面的影響，需要后續(xù)進(jìn)一步研究。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。