蕭建斌，陳思遠(yuǎn)，陳由強(qiáng)，蘇經(jīng)遷

（1.福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 福建師范大學(xué)南方海洋研究院，福建 福州 350117；2.福建師范大學(xué)南方生物醫(yī)學(xué)研究中心 福建省天然免疫生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350013）

鮑魚屬于軟體動物門，腹足綱，單殼貝類，又名“鰒魚”，位列中國“四大海味”之首[1]。鮑魚富含人體所需的蛋白質(zhì)、維生素和無機(jī)鹽等，口感極佳，故具有很高食用價值，從古至今都作為名貴海產(chǎn)品深受人們喜愛[2]。在中醫(yī)上認(rèn)為，鮑魚有潤肺養(yǎng)胃、滋陰補(bǔ)陽、養(yǎng)肝固腎的功效[3]。隨著鮑魚人工養(yǎng)殖技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，鮑魚開始逐漸步入尋常百姓家庭，鮑魚的深加工也開始飛速發(fā)展[4]。目前，鮑魚的深加工主要以鮑魚肌肉為主，大量的鮑魚內(nèi)臟未被充分利用，造成嚴(yán)重的資源浪費(fèi)[5]。因此，對鮑魚內(nèi)臟進(jìn)一步開發(fā)利用勢在必行。

鮑魚內(nèi)臟脂質(zhì)（Lipid of abalone viscera，LAV）是由鮑魚內(nèi)臟提取得到的混合脂質(zhì)，含量約為鮑魚內(nèi)臟4%，是食品、醫(yī)藥和化工等行業(yè)的重要原材料之一[6]。LAV中含有大量的脂肪酸ω-3、ω-6和ω-9，其中脂肪酸ω-3型多不飽和脂肪酸，在降膽固醇和降血脂方面均具有良好功效[7]。對鮑魚內(nèi)臟的研究表明，其富含的多糖、多肽和礦物質(zhì)等多種營養(yǎng)物質(zhì)具有抗腫瘤、增強(qiáng)免疫力和抗氧化等功能[8,9]。但是關(guān)于LAV增強(qiáng)免疫功能的生理活性還尚不清楚，因此本試驗(yàn)以C57BL/6小鼠為研究對象，探究LAV對小鼠的免疫調(diào)節(jié)作用，為鮑魚內(nèi)臟加工再利用和保健功能的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

C57BL/6 小鼠，雌雄各半，體重18～25 g，所有小鼠均喂養(yǎng)于福建師范大學(xué)南方醫(yī)學(xué)中心動物實(shí)驗(yàn)房。LAV由福建省水產(chǎn)研究所提供。

1.2 藥品與試劑

濃縮精制魚油購買于冰島LYSI公司；刀豆蛋白（ConA）購買于美國Sigma公司；綿羊紅細(xì)胞（SRBC）、RPMI 1640培養(yǎng)基、Hank's液、0.5%MTT溶液購買于北京索萊寶科技有限公司；胎牛血清（FBS）購買于美國Gibco公司；豚鼠血清購買于北京博爾西科技有限公司；二硝基氟苯（DNFB）購買于上海麥克林生化科技有限公司。其余藥品均為國產(chǎn)分析純。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

IC1000 細(xì)胞計(jì)數(shù)儀，上海睿鈺生物科技有限公司；Infinite 200全自動酶標(biāo)儀，瑞士TECAN公司；MCO-170AICDL-PC二氧化碳培養(yǎng)箱，日本松下公司；Avanti J-26S XP高速冷凍離心機(jī)，美國貝克曼公司。

2 方法

2.1 動物分組

小鼠灌胃前，進(jìn)行稱重，按照平均重量將小鼠分成空白對照組(C)、陽性藥物組(PC)、LAV低劑量組（LD）、LAV中劑量組(MD)、LAV高劑量組(HD)，每組6只，雌雄各半。LD、MD和HD組分別用LAV（用量分別為17、33、66 mg/kg）進(jìn)行灌胃，PC組用濃縮精制魚油（33 mg/kg）進(jìn)行灌胃，C組給予同等劑量的玉米油進(jìn)行灌胃。藥品均用玉米油配制，每天灌胃給藥1次，每只小鼠灌胃劑量為0.1 mL，自由飲食。

2.2 脾淋巴細(xì)胞增殖能力的測定

在末次給藥12 h后，無菌取出各組小鼠脾臟，于盛有無菌 Hank's液的平皿中將小鼠脾臟研碎，參考王璐等[10]的方法制成細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)細(xì)胞，用無菌RPMI 1640培養(yǎng)液將細(xì)胞濃度調(diào)整為1×107個/mL。將細(xì)胞懸液各取1 mL放入24孔培養(yǎng)板中，設(shè)置3個復(fù)孔，分別加入ConA液（終濃度為5 μg/mL），每組再設(shè)置3孔作為空白對照。將培養(yǎng)板置于37 ℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，培養(yǎng)結(jié)束前6 h，從每孔中精密吸取上清液0.7 mL，棄掉，同時每孔加0.7 mL不含牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液和100 μL 0.5%MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)至結(jié)束。從每孔中吸取0.8 mL溶液，棄掉，同時向每孔中加入1.0 mL的DMSO，混勻，使紫色結(jié)晶物完全溶解后，分裝到96 孔培養(yǎng)板中，利用全自動酶標(biāo)儀，測定OD570的值，按照公式計(jì)算淋巴細(xì)胞增殖能力。

計(jì)算公式：

式中：A——淋巴細(xì)胞增殖能力；

OD1——ConA孔中OD值；

OD2——對照孔的OD值。

2.2 DNFB 誘導(dǎo)小鼠DTH的測定

采用姚滿林等[11]的方法。小鼠腹部脫毛，用50 μL 1%DNFB溶液均勻涂抹致敏。第2天同劑量重復(fù)致敏，5 d后，用DNFB溶液10 μL均勻涂抹于小鼠左耳（兩面）進(jìn)行攻擊，24 h后，用頸椎脫臼的方法處死小鼠，剪下左右耳殼，用打孔器取下直徑8 mm的耳片，稱重。用左右耳重量之差表示DTH的程度。

2.3 抗體生成細(xì)胞水平的測定

參考趙慶楓等[12]的方法。自首次灌胃處理后的第55天開始，每組實(shí)驗(yàn)鼠注射0.2 mL 2%SRBC，連續(xù)腹腔注射5 d，1次/d。末次注射12 h后，無菌取出脾臟，制成細(xì)胞懸液，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，稀釋處理后，細(xì)胞終濃度調(diào)整為3×107個/mL。在新的離心管中，加入0.1 mL脾臟細(xì)胞懸液，0.3 mL 10%豚鼠血清和0.3 mL 10%SRBC混懸液，混合均勻。以不加細(xì)胞懸液做空白對照，37 ℃保溫l h，通過冰浴終止反應(yīng)，離心，取上清液轉(zhuǎn)移至96孔板，每孔100 μL，使用酶標(biāo)儀測定OD540值，以O(shè)D值表示抗體細(xì)胞生成水平。

2.4 血清溶血素水平的測定

參考朱艷等[13]的方法。在灌胃處理的第55天，每組實(shí)驗(yàn)鼠腹腔注射0.2 mL 4%SRBC懸液，連續(xù)腹腔注射5 d，1次/d。在末次灌胃處理1 h后，眼球取血置于離心管內(nèi)，放置約2 h，將凝固血與管壁剝離，使血清充分析出，2000 r/min離心10 min，收集血清。取10μL血清以生理鹽水稀釋200倍。在200 μL稀釋后的血清中分別加0.2 mL 4%SRBC和0.2 mL 10%豚鼠血清，混合均勻，同時設(shè)置不加血清即200μL生理鹽水的空白組進(jìn)行對照。將4%SRBC隨實(shí)驗(yàn)組共同溫浴，測定OD數(shù)值作為SRBC半數(shù)溶血OD值。37 ℃孵育30 min，0 ℃冰浴下終止反應(yīng)，3000 r/min離心10 min，吸取200 μL上清，分裝至96孔板中，酶標(biāo)儀測定OD540值，溶血素的水平以半數(shù)溶血值（HC50）表示，按下式計(jì)算HC50：

2.5 腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力的測定

參考張思哲等[14]的方法。自首次灌胃處理后的第30天，用頸椎脫臼的方法處死小鼠，無菌條件下酒精浸泡3 min，每鼠腹腔無菌注射2 mL含2%FBS的PBS，收集腹水于無菌離心管中，1000 r/min 離心5 min，棄上清液，用RPMI 1640完全培養(yǎng)液吹打細(xì)胞使其成為單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)后將細(xì)胞濃度調(diào)整為1×106個/mL。將巨噬細(xì)胞接種于96孔板（200 μL/孔），于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h，每孔棄100 μL培養(yǎng)液后，各加入100 μL 0.072%中性紅溶液，繼續(xù)培養(yǎng)30 min，棄去中性紅溶液，用PBS清洗3次以除去未被吞噬的中性紅，之后每孔加入100 μl 細(xì)胞裂解液，振蕩混勻，用酶標(biāo)儀測定540 nm處的吸光值，吞噬能力以O(shè)D值表示。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

兩組間比較用t檢驗(yàn)，由Graphpad prism 7.0和Adobe Illustrator軟件繪圖。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（*，P＜0.05；**，P＜0.01；***， P＜0.001）。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

3.1 LAV 對脾淋巴細(xì)胞增殖能力的影響

淋巴細(xì)胞具有免疫識別功能，在免疫應(yīng)答中起到關(guān)鍵作用，可通過特異性抗原途徑來誘導(dǎo)活化，也可以通過ConA等刺激物的途徑來誘導(dǎo)活化[15]。結(jié)果如圖1所示，C組的淋巴細(xì)胞增殖能力為0.205，PC組的淋巴細(xì)胞增殖能力為0.363，相對于C組提高了77%（P＜0.05）。LD、MD和HD的增殖能力分別為0.246、0.334、0.460，與C組相比，分別提高了20%（P＞0.05）、63%（P＜0.05）和124%（P＜0.01），3個劑量組呈一定的劑量依賴性，說明口服LAV對提高小鼠的脾淋巴細(xì)胞增殖能力具有促進(jìn)作用。

圖1 LAV對小鼠脾臟淋巴細(xì)胞增殖能力的影響

3.2 LAV 對DNFB誘導(dǎo)小鼠DTH的影響

耳腫脹是遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)中的一種，可用于檢測體內(nèi)細(xì)胞免疫功能[16]。結(jié)果如圖2所示，C組的平均DTH程度為17.9 mg，PC組的DTH程度平均為24.4 mg，與C組相比增加了22.6%（P＜0.05）。LD組、MD組和HD組的DTH程度平均為20.6 mg、21.9 mg和23.7 mg，與C組相比DTH程度分別增加了15.1%（P＜0.05）、22.3%（P ＞0.05）和32.4%（P＜0.05）。

圖2 LAV對DNFB誘導(dǎo)小鼠DTH的影響

3.3 LAV 對小鼠抗體生成細(xì)胞水平的影響

抗體生成細(xì)胞是淋巴系細(xì)胞，包含B細(xì)胞和T細(xì)胞，其中B細(xì)胞是抗體生成細(xì)胞前體，在細(xì)胞膜表面具有以單一特異性抗體作為抗原受體，一旦與抗原結(jié)合就直接或借助于T細(xì)胞進(jìn)行增殖分化，因而通過測定抗體細(xì)胞生成水平可表示體液免疫的水平[17]。結(jié)果如圖3所示，PC組的抗體生成細(xì)胞水平與C組相比上調(diào)了23.3%（P＜0.05），在實(shí)驗(yàn)組中，LD組與C組的抗體生成細(xì)胞水平?jīng)]有顯著變化（P＞0.05），MD和HD組的抗體生成細(xì)胞水平與C組相比分別上調(diào)13.5%（P＜0.05）和17.9%（P＜0.05）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，中、高劑量的LAV能顯著提高抗體生成細(xì)胞水平，對小鼠的體液免疫產(chǎn)生有益作用。

圖3 LAV對小鼠抗體生成細(xì)胞水平的影響

3.4 LAV 對小鼠血清溶血素的影響

利用SRBC刺激小鼠進(jìn)行免疫應(yīng)答，從而產(chǎn)生特異性抗體，通過檢測紅細(xì)胞溶血過程中血紅蛋白的量可以反映抗體產(chǎn)生的水平[18]。如圖4所示，C組的溶血素表達(dá)水平為680，HD組的HC50為749，相比C組提高了10.1%（P＜0.01）。LD組和MD組的HC50為741和752，分別升高了9.0%（P＜0.05）和10.6%（P＜0.01）。

圖4 LAV對小鼠血清溶血素的影響

3.5 LAV 對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力的影響

腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力可反映體內(nèi)單核巨噬細(xì)胞的免疫功能，在一定程度上反應(yīng)小鼠非特異性免疫水平[19]。由圖5可知，PC組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬能力相對C組提高了29.98%（P＜0.01）。與C組相比，LAV的LD、MD和HD三個劑量組均可改善小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬能力，且MD和HD組的效果更佳，吞噬能力分別提高了19.4%（P＜0.05）和16.9%（P＜0.01）。

圖5 LAV對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力的影響

4 討論

細(xì)胞免疫和體液免疫構(gòu)成機(jī)體的特異性免疫系統(tǒng)，并分別通過T細(xì)胞和B細(xì)胞發(fā)揮作用[20]。在非特異性免疫中，腹腔巨噬細(xì)胞可以抵抗或者清除外來異物或抗原，并可以通過吞噬指數(shù)反映其吞噬能力[21]，因此本文從體液免疫、細(xì)胞免疫及非特異性免疫功能等方面評價LAV對小鼠免疫功能的調(diào)節(jié)作用。結(jié)果表明LAV能夠通過增強(qiáng)小鼠細(xì)胞免疫、體液免疫，改善小鼠巨噬細(xì)胞吞噬活性等途徑從而增強(qiáng)小鼠機(jī)體免疫機(jī)能，但是具體的免疫作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，LAV具有突出的免疫調(diào)節(jié)作用，高劑量的LAV的效果與市場上的魚油類似，本研究為鮑加工過程中所產(chǎn)生副產(chǎn)物的多元化開發(fā)和全值化利用提供了初步的理論依據(jù)。