生發(fā)中心B細(xì)胞應(yīng)答異常引起的自身免疫性疾病研究進(jìn)展

2022-02-18 01:48陳雅雯蔡少麗

福建輕紡 2022年2期

陳雅雯，蔡少麗

（福建師范大學(xué)南方生物醫(yī)學(xué)研究中心福建省天然免疫生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗室，福建福州 350117）

生發(fā)中心（germinal center，GC）是抗原（antigen，Ag）激活的B細(xì)胞進(jìn)行克隆擴(kuò)增、免疫球蛋白基因超突變和親和力選擇的主要位點(diǎn)，是在T細(xì)胞依賴性抗體應(yīng)答過程中于外周淋巴組織內(nèi)形成的一個促使B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生特異性抗體的特殊結(jié)構(gòu)。GC主要由B細(xì)胞組成，其中也有部分抗原特異性T細(xì)胞，為B細(xì)胞分化提供輔助。GC B細(xì)胞的選擇包括： B 細(xì)胞進(jìn)一步克隆擴(kuò)增、免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）基因可變區(qū)的體細(xì)胞高頻突變（somatic hypermutation，SHM)、高親和力B細(xì)胞克隆的陽性選擇以及無關(guān)或自身反應(yīng)性B細(xì)胞克隆的陰性選擇[1]，Ig類型轉(zhuǎn)換以及分化為可分泌特異性抗體的記憶B細(xì)胞和漿細(xì)胞，從而參與體液免疫的過程。這些選擇受轉(zhuǎn)錄因子、表觀遺傳修飾因子和信號通路的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)調(diào)控，且信號通路與GC B細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制起協(xié)同作用[2]。調(diào)節(jié)B淋巴細(xì)胞成熟和穩(wěn)定的基本機(jī)制——凋亡在生發(fā)中心B細(xì)胞的生長分化中極為重要，當(dāng)?shù)蛲稣{(diào)控系統(tǒng)出現(xiàn)異常，存活下來的自身反應(yīng)性B細(xì)胞會產(chǎn)生無法被自然清除的自身反應(yīng)性抗體，進(jìn)而與自身抗原反應(yīng)引起自身免疫性疾病，進(jìn)一步導(dǎo)致免疫系統(tǒng)的異常。

1 生發(fā)中心B細(xì)胞的應(yīng)答過程

在外周淋巴組織的T細(xì)胞區(qū)，抗原提呈細(xì)胞（antigen presenting cell，APC)/并指狀細(xì)胞（interdigitating dendritic cell，IDC）將攝取的抗原（antigen，Ag）加工后，通過主要組織相容性復(fù)合物（major histocompatibility complex，MHC)Ⅱ類分子將Ag提呈給T細(xì)胞，通過CD80-CD28膜分子將共刺激信號傳導(dǎo)給T細(xì)胞使其活化?；罨疶細(xì)胞成功識別B細(xì)胞受體（B-cell receptor，BCR）提呈的加工后Ag，通過CD40-CD40L傳導(dǎo)B細(xì)胞活化信號。活化后的B細(xì)胞能與活化T細(xì)胞一起進(jìn)入初級淋巴濾泡中起始生發(fā)中心反應(yīng)[3]，也能在濾泡間區(qū)繼續(xù)增殖進(jìn)而終末分化為產(chǎn)生IgM和IgG兩種較低親和力抗體（antibodys，Abs）的短期漿細(xì)胞。

進(jìn)入初級淋巴濾泡中的再循環(huán)B細(xì)胞在大量濾泡樹突狀細(xì)胞形成的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)中穿行，在生發(fā)中心的暗區(qū)（dark zone，DZ）迅速增殖，分化為中心母細(xì)胞（centroblasts，CBs）并發(fā)生IgV區(qū)基因體細(xì)胞高頻突變（SHM）[4]，在FDC提供的生長因子作用下，凋亡受抑制。隨著時間的推移，形成數(shù)量巨大、具有不同親和力BCR的B細(xì)胞克隆，即中央細(xì)胞（centrocytes，CCs)，它們向GC的亮區(qū)（light zone，LZ）遷移，先后與在親和力選擇過程中介導(dǎo)關(guān)鍵作用[5]的FDC和T濾泡輔助細(xì)胞（T follicular helper，Tfh)[6]進(jìn)行Ag識別和結(jié)合，完成親和力成熟和Ig同類型轉(zhuǎn)換。接收Tfh信號的表達(dá)高親和力Abs CCs能進(jìn)一步增殖分化為長壽命存儲單元記憶B細(xì)胞和抗體分泌型漿細(xì)胞[7]，也能回到DZ啟動新一輪的GC應(yīng)答[8]（圖1）。

圖1 生發(fā)中心B細(xì)胞的應(yīng)答過程

經(jīng)過SHM，CCs會形成高親和力、低親和力以及自身反應(yīng)性突變株。高親和力B細(xì)胞與FDC結(jié)合后能免于被溶酶體破裂而發(fā)生凋亡，其余B細(xì)胞因無法與FDC作用而發(fā)生凋亡，繼而被可染體巨噬細(xì)胞（tingible body macrophages，TBMs）清除[9]。GC獨(dú)特的生理功能就是使功能性B細(xì)胞存活，使無關(guān)或自身反應(yīng)性B細(xì)胞凋亡，以維持B淋巴細(xì)胞的動態(tài)穩(wěn)定，防止因自身反應(yīng)性B細(xì)胞的存活而引起自身免疫性疾病的情況發(fā)生。

2 靶向異常的應(yīng)答治療自身免疫性疾病

自身免疫性疾?。╝utoimmune Disease，AID）反映了免疫耐受的崩潰[10]。正常情況下的免疫反應(yīng)對自身組織不產(chǎn)生攻擊反應(yīng)[11]，但是如果自身抗體過量產(chǎn)生或異常就有可能會對機(jī)體產(chǎn)生傷害，導(dǎo)致自身免疫性疾病的發(fā)生。

生發(fā)中心B細(xì)胞的應(yīng)答會產(chǎn)生數(shù)量多、特異性強(qiáng)的各種B細(xì)胞克隆，該過程能起到維持B細(xì)胞動態(tài)穩(wěn)定的作用。當(dāng)GC B細(xì)胞應(yīng)答異常時，可能會使自身反應(yīng)性B細(xì)胞免于凋亡而存活，進(jìn)而產(chǎn)生自身抗體，引起自身免疫性疾病。Fas-FasL和CD40-CD40L參與調(diào)控GC B細(xì)胞凋亡的過程，在維持GC穩(wěn)態(tài)、防止自身反應(yīng)性B細(xì)胞的存活上起重要作用。探究靶向Fas-FasL和CD40-CD40L調(diào)控過程異常的方法，對防止GC B細(xì)胞應(yīng)答異常以及預(yù)防和治療因其引起的包括關(guān)節(jié)炎在內(nèi)的自身免疫性疾病具有參考價值。

2.1 Fas/FasL 在關(guān)節(jié)炎癥中的治療潛力

Fas(CD95 ）是含有死亡結(jié)構(gòu)域的腫瘤壞死因子受體超家族（tumor necrosis factor receptor superfamily，TNFRSF）中的一員，能生理性調(diào)控凋亡及在免疫系統(tǒng)疾病和淋巴瘤中起重要作用[12]。FasL（CD95L）是生發(fā)中心中T細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子之一，同屬于腫瘤壞死因子超家族，T細(xì)胞可通過它誘導(dǎo)GC B細(xì)胞發(fā)生凋亡。Fas-FasL系統(tǒng)是外源性凋亡途徑的觸發(fā)因素[13]，該系統(tǒng)異常將會導(dǎo)致正常的凋亡受抑制[14]。Fas和FasL結(jié)合后激活死亡受體，死亡受體和FasL相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域（Fas-associated death domain，F(xiàn)ADD）互相作用后能募集連接體蛋白，隨后連接體蛋白上的死亡效應(yīng)結(jié)構(gòu)域與凋亡起始酶procaspase-8上的死亡結(jié)構(gòu)域結(jié)合，從而形成能使蛋白酶水解并把procaspase-8活化為caspase-8的死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合物（death inducing signalling complex，DISC)，觸發(fā)下游效應(yīng)的caspase-3活化來誘導(dǎo)凋亡發(fā)生。

生發(fā)中心B細(xì)胞在隨機(jī)性的體細(xì)胞高頻突變后不可避免地會產(chǎn)生自身反應(yīng)性B細(xì)胞，若這些細(xì)胞逃脫耐受機(jī)制，將會形成自身反應(yīng)性漿細(xì)胞和記憶細(xì)胞，產(chǎn)生自身反應(yīng)性抗體，導(dǎo)致自身免疫性疾病的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)as缺陷型小鼠身患自身免疫性綜合征是因其不能清除自身反應(yīng)性B細(xì)胞，由此可得，F(xiàn)as/FasL基因缺陷，可能會導(dǎo)致GC B細(xì)胞的陰性選擇發(fā)生異常。另一研究[15]表明，去除自身反應(yīng)性GC B細(xì)胞不是必須要依靠Fas的表達(dá)，但Fas的表達(dá)是防止非抗原依賴性的自身反應(yīng)性B細(xì)胞發(fā)展和持續(xù)存在，繼而分化為漿細(xì)胞導(dǎo)致免疫系統(tǒng)出現(xiàn)異常，是引起自身免疫性疾病發(fā)生的必要條件。Fas-Fas 配體（FasL）途徑在維持對自身抗原的免疫耐受中起關(guān)鍵作用?？扇苄訤asL（sFasL）是膜結(jié)合F a s L（m F a s L）被基質(zhì)金屬蛋白酶（m a t r i x metalloproteinase，MMP）水解切割產(chǎn)生的，mFasL對于觸發(fā)Fas誘導(dǎo)的凋亡至關(guān)重要[16]，而sFasL調(diào)節(jié)非凋亡過程，但以劑量依賴性方式刺激類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（Rheumatoid arthritis，RA）患者成纖維樣滑膜細(xì)胞（fibroblast-like synovial cells，F(xiàn)LSCs）中的凋亡[17]。有研究[18]表明，腫瘤壞死因子受體超家族（TNFRSF）10B（死亡受體DR5）是促進(jìn)炎癥的mFasL和sFasL非Fas依賴性膜結(jié)合受體，F(xiàn)asL-DR5和Fas-FasL相互作用誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和壞死，而sFasL-DR5相互作用可能依賴于NF-κB信號通路，通過CX3X1-CX3CR1增加關(guān)節(jié)炎癥。但當(dāng)施用FasL或CX3CR1的抗體阻斷其作用，則減弱了小鼠自身抗體誘發(fā)的關(guān)節(jié)炎（autoantibody-induced arthritis,AIA），說明sFasL-DR5相互作用和CX3CL1-CX3CR1可能是控制炎癥的治療靶點(diǎn)。加之sTRAIL可競爭性結(jié)合DR5，且sFasL-DR5和sTRAIL-DR5相互作用可誘導(dǎo)FLSCs凋亡，研究DR5與FasL、sFasL、sTRAIL的結(jié)合作用大小及先后順序和具體的作用機(jī)制，弄清其作用時期是在FLSCs的誘導(dǎo)期還是效應(yīng)期能更好地確定治療靶點(diǎn)，研發(fā)靶向藥物，可能可以規(guī)避以往使用的非甾體類控制炎癥藥物具有的引起臟器功能損壞的風(fēng)險[19,20]。

目前市面上沒有治療RA的特效藥，吳寧的研究[21]證實(shí)天然重要苗藥“四大血”（SX）中的活性成分能有效結(jié)合包括Fas和FasL在內(nèi)的調(diào)控凋亡的分子，能在毒副作用小的前提下較好地起到抑制FLSCs增生、緩解關(guān)節(jié)炎癥的作用，但其作用的具體機(jī)制仍不清楚，因此還未應(yīng)用于臨床。

通過Fas-FasL途徑研究分子抑制劑來控制炎癥的發(fā)展以達(dá)到延緩和治療自身免疫性疾病的效果，然而進(jìn)一步研究該途徑的作用機(jī)制會發(fā)現(xiàn)在調(diào)控非抗原依賴性自身反應(yīng)性B細(xì)胞凋亡上，F(xiàn)as的表達(dá)才是更為主要的。這些B細(xì)胞不僅能逃脫免疫耐受存活下來，還能直接分化為漿細(xì)胞，產(chǎn)生自身抗體（多為IgG）引起自身免疫性疾病。不僅如此，在發(fā)展后期，IgG抗體可轉(zhuǎn)變?yōu)镮gE抗體，可能還會引起過敏性疾病，促進(jìn)系統(tǒng)系紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）的發(fā)展。

深入探究Fas在防止非抗原依賴性自身反應(yīng)性B細(xì)胞存活和增殖的表達(dá)機(jī)制，是否與在某些情況下能抑制GC反應(yīng)的T濾泡調(diào)節(jié)細(xì)胞相關(guān)，控制施加Fas或作用機(jī)理相同的分子激活劑來確定治療靶點(diǎn)，在治療關(guān)節(jié)炎癥等自身免疫性疾病及預(yù)防過敏性疾病的發(fā)生中具有一定的參考價值。

2.2 靶向阻斷CD40/CD40L防止炎癥發(fā)生

生發(fā)中心要具有功能性，必須得在生發(fā)中心T細(xì)胞的協(xié)助下才能產(chǎn)生IgM、IgG、IgA和IgE抗體，同樣為T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子之一的CD40L[22]可參與調(diào)控抗體產(chǎn)生種類的過程。與Fas-FasL在GC的作用相反，CD40L是阻止B細(xì)胞凋亡的分子，其依賴生發(fā)中心T細(xì)胞來識別濾泡樹突狀細(xì)胞呈遞的抗原，通過CD40配體[23]來激發(fā)CD40分子，使B細(xì)胞得以繼續(xù)存活[24,25]。CD40信號分子可通過轉(zhuǎn)錄因子NF-κB介導(dǎo)表達(dá)靶基因FADD樣白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）轉(zhuǎn)化酶抑制蛋白（Fas-associated death domain like interleukin-1 betaconvert ingenzyma inhibitory protein，F(xiàn)LIP）來維持FLIP的穩(wěn)態(tài)，抑制caspase-8激活，使DISC失活，即下調(diào)Fas作用以使B細(xì)胞與FDC的結(jié)合作用增強(qiáng)來起到抗凋亡的作用[26]。CD40-CD40L通路是免疫系統(tǒng)細(xì)胞之間通訊的支柱[27]，CD40的表達(dá)是GC形成和功能所必需的[28]，在生發(fā)中心B細(xì)胞分化的早期階段，若沒有CD40L的刺激，GC B細(xì)胞將會自發(fā)凋亡[29]。膜分子CD40與CD40L的結(jié)合能促進(jìn)陽性選擇抗原特異性B細(xì)胞，也能起到穩(wěn)定溶酶體的作用，防止溶酶體酶對GC B細(xì)胞的破壞。

以前對于K/BxN小鼠的研究表明，關(guān)節(jié)炎的發(fā)展取決于B細(xì)胞CD40的表達(dá)。在對治療自發(fā)性關(guān)節(jié)炎小鼠實(shí)驗的研究[30]發(fā)現(xiàn)，在關(guān)節(jié)炎發(fā)病前進(jìn)行抗CD40L抗體治療，能明顯降低關(guān)節(jié)炎的發(fā)展，表明抗CD40L抗體可以預(yù)防或延遲關(guān)節(jié)炎的發(fā)展。這因為關(guān)節(jié)炎是由特異性靶標(biāo)GPI(glucose-6-phosphate isomerase）的抗體引起的，所以可以通過阻斷CD40信號來防止致病性抗葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶（GPI）抗體的形成，但抗CD40L抗體并不能治療已經(jīng)形成的關(guān)節(jié)炎?？笴D40L的單抗能與抗體IgM共同刺激使B細(xì)胞大量擴(kuò)增，CD40L阻斷可能通過促進(jìn)其外周缺失阻止了新的自身反應(yīng)性B細(xì)胞的出現(xiàn)[31]，所以該治療方式只適用于延緩炎癥及病情發(fā)展。通過抑制自身抗體新形成，或通過與有效的抗炎劑聯(lián)合使用，可對關(guān)節(jié)炎疾病產(chǎn)生長期抑制作用。此研究實(shí)驗的小鼠疾病模型類似于人類的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA)，對RA的預(yù)防與阻斷炎癥進(jìn)程的治療具有參考價值。

CD40-CD40L 是B細(xì)胞活化的關(guān)鍵共刺激途徑，是一個有吸引力的免疫治療靶點(diǎn)[47]，其阻斷可抑制自身免疫性疾病中的致病性B細(xì)胞反應(yīng)。研究[32]表明KPL-404（一種人源化的IgG4抗CD40單克隆抗體）能靶向結(jié)合CD40，達(dá)到抑制干燥綜合征（sjogren's syndrome，SjS）和系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）中B細(xì)胞反應(yīng)的治療效果。該研究通過成像流式細(xì)胞術(shù)檢測對比KPL-404對來自健康供體（healthy donor，HD）以及自身免疫疾病患者的外周血單個核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）的體外作用。用抗CD3/CD28交聯(lián)劑免疫刺激細(xì)胞，誘導(dǎo)CD40-CD40L介導(dǎo)的B細(xì)胞反應(yīng)，將檢測的抗CD40 Ab細(xì)胞內(nèi)化與G28-5[33]（一種部分拮抗性抗CD40抗體）的作用進(jìn)行比較。結(jié)果表明，KPL-404在體外不僅能與不同亞群B細(xì)胞上的CD40高親和結(jié)合，而且不產(chǎn)生任何激動活性，比G28-5的抗性特異性強(qiáng)且只需要1-10 μg/mL就能有效阻斷CD40-CD40L介導(dǎo)的HD的B細(xì)胞活化。

單獨(dú)用KPL-404處理不會促進(jìn)細(xì)胞因子產(chǎn)生并能抑制某些炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生，而且不影響它們抗IgM反應(yīng)或細(xì)胞因子產(chǎn)生，結(jié)果顯示出對B細(xì)胞和總PBMC的純拮抗作用。KPL-404能抑制健康對照和自身免疫性患者PBMC培養(yǎng)物中CD40-CD40L介導(dǎo)的B細(xì)胞活化，可阻斷致病性B細(xì)胞反應(yīng)，在有效防止自身免疫性疾病發(fā)生的研究上做出了貢獻(xiàn)。但施用KPL-404是否能在抑制自身反應(yīng)性B細(xì)胞產(chǎn)生的同時增強(qiáng)其凋亡，或與其他分子抑制劑交聯(lián)使用是否能到達(dá)更好的效果，以便后期應(yīng)用于臨床試驗，這是值得進(jìn)一步研究的問題。

CD154(CD40 配體，TNFSF5）是一種可以傳遞共刺激信號的T細(xì)胞分子，CD40-CD154的上調(diào)表達(dá)發(fā)生在不同自身免疫性疾病的免疫效應(yīng)細(xì)胞和非免疫細(xì)胞中，其復(fù)雜的免疫反應(yīng)會促進(jìn)關(guān)節(jié)炎癥和骨損傷。在膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎（collagen induced arthritis，CIA）動物中。阻斷CD40-CD154的相互作用可觀察到治療效果。以前的治療方式是用合成消炎藥來抑制炎癥反應(yīng)、控制疾病進(jìn)展并預(yù)防自身免疫性關(guān)節(jié)炎患者的關(guān)節(jié)損傷[34]，但因其是非特異性藥物，有一群關(guān)節(jié)炎患者對這些治療并沒有反應(yīng)，依然遭受持續(xù)和不可逆的關(guān)節(jié)破壞。通過實(shí)驗研究[35]可得，抑制CD40-CD154可減弱CD154介導(dǎo)的T細(xì)胞共刺激，并抑制CD40介導(dǎo)的對B細(xì)胞和抗原呈遞細(xì)胞的激活信號，達(dá)到抑制致病性B細(xì)胞形成的效果。T細(xì)胞激活在自身免疫性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制中起主要作用，有效抑制T細(xì)胞的激活是免疫調(diào)節(jié)治療非常重要和有效的途徑[36,37]，CD40-CD154作為治療自身免疫性關(guān)節(jié)炎的潛在靶點(diǎn)，對后期的藥物研發(fā)具有重要意義。

目前，已經(jīng)開發(fā)了幾種靶向CD40-CD154的生物產(chǎn)品，正在進(jìn)行相關(guān)臨床試驗。Tn3（一種小蛋白質(zhì)支架）是其中一種能與CD154特異性結(jié)合的藥物，被命名為VIB4920。通過臨床前分析結(jié)果可得出VIB4920能有效抑制B細(xì)胞的活化和分化，且在體外不引起血小板聚集。使用VIB4920治療顯著降低了類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎疾病活動度，超過50%接受兩次更高劑量治療的患者在第12周達(dá)到了低疾病活動度或臨床緩解[38]?；颊邔υ撍幬锉憩F(xiàn)出良好的耐受性，并且在整個試驗過程中沒有具體的安全性問題。雖然該阻斷劑的治療效果顯著，但其療效和安全性的臨床評估只涉及有限的患者數(shù)量，考慮到在檢查阻斷CD40-CD154信號通路治療自身免疫性疾病的長期安全性方面，還需要更多的臨床驗證。

Fas-FasL 與CD40-CD40L都能通過NF-κB信號通路來發(fā)揮作用?；谶@兩個分子的作用在研發(fā)治療關(guān)節(jié)炎癥等自身免疫性疾病的過程中，應(yīng)考慮藥物分子在NF-κB信號通路中是否會導(dǎo)致其他細(xì)胞因子的激活或炎癥分子的產(chǎn)生。若同時使用Fas激活劑和CD40阻斷劑，是否能使治療效果及可長期使用性達(dá)到最優(yōu)值。除此之外，參與親和力成熟選擇的FDC和影響Ag攝取能力的Lis1因子的作用在預(yù)防自身免疫性疾病發(fā)生的過程中也具有值得探討的價值。

3 結(jié)語與展望

生發(fā)中心反應(yīng)支持了強(qiáng)大的抗體反應(yīng)[39]，當(dāng)此過程出現(xiàn)差錯，如自身反應(yīng)性B細(xì)胞克隆的存活、產(chǎn)生自身抗體后與自身抗原結(jié)合起免疫反應(yīng)，會導(dǎo)致自身免疫性疾病的產(chǎn)生。研究[40]發(fā)現(xiàn)GC DZ的B細(xì)胞群可分為暗區(qū)增殖（dark zone proliferation，DZp）群和暗區(qū)分化（dark zone differentiation，DZd）群，DZp可協(xié)助去除凋亡細(xì)胞及有絲分裂前未被陽性選擇的LZ B細(xì)胞，可作為一個免疫檢查點(diǎn)，在適宜藥物或分子的靶向療法下以維持凋亡和有絲分裂的穩(wěn)定，在疫苗設(shè)計和調(diào)節(jié)自身免疫性疾病的適應(yīng)性體液免疫中具有很大的參考價值。