蔣文賢，何依蓉，陳夢(mèng)婷，陳培富

（云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，昆明 650201）

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus, S.aureus）為葡萄球菌屬中的主要致病種，其分布廣泛，宿主種類眾多，主要引起皮膚、黏膜受損或免疫力低下個(gè)體的化膿性感染或壞死性疾病，嚴(yán)重的可引起敗血癥，還可引起人中毒性疾?。ㄊ澄镏卸净蛑卸拘孕菘耍?。據(jù)報(bào)道，原料牛乳的金黃色葡萄球菌檢出率為20%～50%[1-7]；從羊、豬等動(dòng)物皮膚膿腫分離到金黃色葡萄球菌的報(bào)道也不少；金黃色葡萄球菌引起的雞敗血癥死亡率很高，但在現(xiàn)代養(yǎng)殖條件下該病已不多見(jiàn)[8-9]。金黃色葡萄球菌所致感染性疾病類型在不同種宿主常表現(xiàn)不同，在牛多為乳腺炎，在羊和豬多見(jiàn)皮膚膿腫，在雞多見(jiàn)臍炎或敗血癥，提示該菌存在宿主種類及組織嗜性的差異。王偉等[10]提出金黃色葡萄球菌存在明顯宿主種類差異的觀點(diǎn)，并認(rèn)為這主要由其攜帶的可移動(dòng)遺傳原件決定。為了解金黃色葡萄球菌形成宿主種類差異的病原學(xué)因素，本試驗(yàn)對(duì)分離自山羊皮膚膿腫、乳房炎奶牛乳汁和敗血癥雞心包積液的3株金黃色葡萄球菌，做了一系列生物學(xué)特性比較研究。

1 材料與方法

1.1 材料膿汁采集自彌勒市某農(nóng)戶實(shí)施山地放牧的山羊群，該羊群近5年不斷發(fā)生皮膚膿腫病，畜主做排膿治療，雖未見(jiàn)發(fā)生死亡，但嘗試使用多種藥物注射治療均未見(jiàn)有改善效果。中段牛乳采自陸良縣某公司奶牛養(yǎng)殖基地患臨床型乳房炎的奶牛。心包積液采自某高校實(shí)習(xí)雞場(chǎng)病死數(shù)小時(shí)內(nèi)的武定雞。所有病料采集均使用一次性無(wú)菌注射器。雄性新西蘭青年肉兔4只，分籠飼養(yǎng)；BALB/c小白鼠96只（雌、雄各半），均為健康動(dòng)物。

1.2 分離培養(yǎng)分別將3個(gè)樣品劃線接種于含5%綿羊抗凝血的胰蛋白酶大豆胨（TSA）瓊脂平板，37℃培養(yǎng)24 h，挑取單個(gè)菌落再做劃線培養(yǎng)，直至形成外觀形態(tài)完全一致的菌落，轉(zhuǎn)種于Baird-Park瓊脂和卵黃高鹽瓊脂，37℃培養(yǎng)24 h，觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況和菌落形態(tài)特征。

1.3 染色鏡檢及生化鑒定取少許細(xì)菌純培養(yǎng)物，按革蘭染色及莢膜染色試劑盒說(shuō)明書(shū)染色鏡檢，同時(shí)按微量生化反應(yīng)試劑盒說(shuō)明書(shū)做細(xì)菌生化試驗(yàn)。

1.4 生長(zhǎng)曲線測(cè)定將裝有2 mL無(wú)菌LB液體培養(yǎng)基的9支EP管分為3組，每組分別接種10 μL相同OD550值的牛源、羊源和雞源菌液；置于37℃恒溫?fù)u床水浴培養(yǎng)，每間隔2.5 h測(cè)定并記錄OD550值。根據(jù)所測(cè)數(shù)據(jù)求OD550平均值，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD550值為縱坐標(biāo)繪制生長(zhǎng)曲線。

1.5 藥敏試驗(yàn)及耐藥基因檢測(cè)采用Kirby-Baue紙片擴(kuò)散法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。使用天根細(xì)菌DNA提取試劑盒提取細(xì)菌DNA，-20℃保存?zhèn)溆谩２捎肞CR擴(kuò)增檢測(cè)β-內(nèi)酰胺類耐藥基因（BlaZ）及氨基糖苷類耐藥基因aph（3'）-Ⅲ a。

1.6 分子生物學(xué)特性分析

1.6.1 引物設(shè)計(jì)及合成 據(jù)GenBank收錄的參考序列，使用Primer Premier 6.0設(shè)計(jì)引物16S rRNA（GenBank：BX571857.1）、耐熱核酸酶（Nuc）（GenBank：CP029080.1）和殺白細(xì)胞毒素（PVL）（GenBank：CP026957.1）；毒性休克毒素（Tst）、腸毒素（SEA～SEE）、β-內(nèi)酰胺類耐藥基因（BlaZ）、氨基糖苷類耐藥基因（ant(4')-Ia、aac(6')-Ie/aph(2'')、aph(3')-IIIa）、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA（RAPD）（OLP6、OLP11、OLP13、4M、Primer 6）等引物參照文獻(xiàn)[11-16]合成（表1）。

1.6.2 16S rRNA基因克隆測(cè)序分析 以16S rRNA通用引物做PCR擴(kuò)增，膠回收擴(kuò)增產(chǎn)物，插入pMD-18T載體，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞，涂布于LB（Amp＋）固體培養(yǎng)基培養(yǎng)過(guò)夜，挑取3～5個(gè)菌落，提取質(zhì)粒送至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序，最后使用DNAMAN比對(duì)分析測(cè)序結(jié)果。

1.6.3 耐熱核酸酶和毒力基因擴(kuò)增分析 PCR擴(kuò)增Nuc基因，按上述方法做克隆測(cè)序分析。使用引物PVL及Tst，PCR擴(kuò)增檢測(cè)毒力基因，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.6.4 隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA 使用隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA引物，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.7 SDS-PAGE及Western blot檢測(cè)蛋白將來(lái)自不同宿主的3個(gè)分離菌株懸液調(diào)整至相同吸光值及體積，與等體積2×SDS上樣緩沖液混勻，煮沸10 min，離心取上清液，加于4.5%濃縮膠上樣孔，經(jīng)10%分離膠110 V電泳90 min，取分離膠做考馬斯亮藍(lán)染色，甲醇-冰乙酸脫色；將凝膠置于轉(zhuǎn)移槽中100 V轉(zhuǎn)膜1 h，以10%脫脂奶粉溶液封閉NC膜2 h，依次加一抗（山羊血清）、二抗（HRP-兔抗羊）孵育，最后加入顯色液顯影，觀察并記錄結(jié)果。

表1 PCR擴(kuò)增所用引物Table 1 Primers for PCR amplification

1.8 免疫原性測(cè)定對(duì)兔子皮下注射3.95×109CFU細(xì)菌，兩周后加強(qiáng)免疫一次，過(guò)7 d采血，分離并倍比稀釋血清，采用平板凝集試驗(yàn)測(cè)定血清抗體凝集效價(jià)。

1.9 致病性試驗(yàn)離心細(xì)菌懸液，棄掉上清液，以生理鹽水重懸沉淀。將90只小鼠隨機(jī)平均分為3個(gè)大組（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組），每個(gè)大組又隨機(jī)分為3個(gè)小組，分別腹腔注射3×108、3×107和3×106CFU的羊源、牛源或雞源細(xì)菌懸液，以腹腔注射0.3 mL滅菌生理鹽水6只小鼠用作對(duì)照。每天觀察2～3次，統(tǒng)計(jì)7 d內(nèi)的發(fā)病與死亡情況，計(jì)算細(xì)菌對(duì)小鼠的半數(shù)致死量（median lethal dose, LD50）。

2 結(jié)果

2.1 培養(yǎng)結(jié)果在血瓊脂平板上羊源、牛源、雞源菌株分別形成純白色、灰黃色和灰白色的圓形菌落（圖1A，1B，1C）；出現(xiàn)β溶血時(shí)間分別為12、24、24 h；3個(gè)菌株在Baird-Parker瓊脂上均為黑色“雙環(huán)”菌落（圖1D，1E，1F），在7.5%～15%鹽濃度卵黃高鹽瓊脂平板上均能生長(zhǎng)（圖1G，1H，1I），鹽濃度為25%時(shí)亦能生長(zhǎng)，為白色圓形菌落，牛源菌株菌落較小；雞源和牛源菌株在7.5%卵黃高鹽瓊脂平板上偶爾形成金黃色菌落，但經(jīng)再次傳代培養(yǎng)恢復(fù)為白色菌落。

圖1 不同培養(yǎng)基上的菌落Fig.1 The colonies in different media

2.2 染色鏡檢結(jié)果各分離菌株革蘭染色鏡檢均為紫色葡萄串狀球菌（圖2A，2B，2C），即為革蘭陽(yáng)性球菌；莢膜染色鏡檢均未見(jiàn)莢膜。

圖2 染色鏡檢結(jié)果（1000×）Fig.2 The results of staining microscopy (1000×)

2.3 生化鑒定羊源菌株（Y）、牛源菌株（N）和雞源菌株（J）蔗糖、乳糖、果糖、麥芽糖、尿素、甘露醇、精氨酸、兔血漿凝固酶試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)及觸酶試驗(yàn)均為陽(yáng)性，新生霉素生長(zhǎng)試驗(yàn)均為陰性，符合金黃色葡萄球菌的生化特性，但甘露糖、蕈糖發(fā)酵試驗(yàn)及甲基紅、二乙酰試驗(yàn)結(jié)果有差異（表2）。

表2 生化鑒定結(jié)果Table 2 Biochemical identification results

2.4 生長(zhǎng)曲線及世代時(shí)間生長(zhǎng)曲線顯示，羊源菌株較牛源和雞源菌株生長(zhǎng)較快（圖3），對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期細(xì)菌數(shù)分別為3.52×109、2.46×109、1.83×109CFU/mL，世代時(shí)間分別為40、46、42 min。

圖3 細(xì)菌生長(zhǎng)曲線Fig.3 The Bacteria growth curves

2.5 分子生物學(xué)鑒定

2.5.1 16S rRNA基因克隆測(cè)序分析 16S rRNA基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物及TA克隆質(zhì)粒條帶符合預(yù)期大?。▓D略）；測(cè)序與金黃色葡萄球菌16S rRNA相似度均達(dá)99%以上，繪制遺傳進(jìn)化樹(shù)可知雞源、牛源菌株同源性相近（圖4）；3個(gè)菌株16S rRNA基因克隆序列長(zhǎng)度分別為1477、1472、1472 bp，均存在位點(diǎn)差異，且羊源菌株比另兩株在42 bp位置多4個(gè)A，在1281 bp位置多一個(gè)C（GenBank登錄號(hào)：MT628393-MT628395）。

圖4 分離菌株與參考菌株的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.4 Phylogenetic tree of isolated and reference strains

2.5.2 耐熱核酸酶和毒力基因 3株菌耐熱核酸酶基因（Nuc）PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序比對(duì)結(jié)果符合預(yù)期大小。殺白細(xì)胞毒素毒力基因（PVL）檢測(cè)結(jié)果：使用引物PVL1擴(kuò)增，僅羊源菌株出現(xiàn)目的條帶；使用引物PVL擴(kuò)增，雞源及牛源菌株均出現(xiàn)目的條帶，表明3個(gè)分離菌株的PVL存在堿基序列差異。中毒性休克綜合征毒素毒力基因（Tst）的檢測(cè)均為陽(yáng)性；但未擴(kuò)增出腸毒素A～E（SaeA～E）目的條帶。

2.5.3 RAPD檢測(cè)結(jié)果 使用5條不同引物做PCR擴(kuò)增，其中OLP6、OLP11、Primer6能有效將3株菌分為不同基因型，尤以O(shè)LP11擴(kuò)增多態(tài)性顯示3個(gè)菌株之間存在較大的遺傳差異，具有較好的分型效果（圖3）。

圖5 3個(gè)菌株隨機(jī)多態(tài)性基因擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.5 RAPD produts of 3 strains

2.6 藥敏試驗(yàn)及耐藥基因檢測(cè)結(jié)果3個(gè)菌株耐藥情況總體相似：對(duì)左氧氟沙星、頭孢噻肟、利福平等藥物高度敏感；對(duì)乙酰螺旋霉素、磺胺甲噁唑等中度敏感；對(duì)鏈霉素、林可霉素、氨芐西林、青霉素等耐藥（表3）；且檢出β-內(nèi)酰胺類耐藥基因Blaz和氨基糖苷類耐藥基因aph(3')-IIIa。

表3 藥敏試驗(yàn)部分結(jié)果Table 3 Partial results of drug susceptibility test

2.7 SDS-PAGE及Western blot結(jié)果3個(gè)菌株表達(dá)的蛋白質(zhì)種類基本相同，但表達(dá)量有差異；牛源菌株黃色與白色菌落在分子量約38.5 kDa的蛋白質(zhì)條帶表達(dá)量差異較大（圖6）。Western blot結(jié)果顯示羊源菌株在28、36.5、45 kDa處出現(xiàn)特異性條帶，其余兩株菌無(wú)特異性條帶出現(xiàn)（圖7）。

圖6 SDS-PAGE分析Fig.6 SDS-PAGE analysis

圖7 Western blot分析Fig.7 Western blot analysis

2.8 免疫原性測(cè)定結(jié)果雞源菌株（J）誘導(dǎo)兔產(chǎn)生的抗體效價(jià)最高，為27；羊源菌株（Y）與牛源菌株（N）誘導(dǎo)兔產(chǎn)生的抗體效價(jià)略低，為26。（表4）。

表4 免疫兔血清凝集抗體效價(jià)Table 4 The agglutinating antibody titers of immunized rabbits

2.9 致病性試驗(yàn)小鼠在注射高劑量菌液后表現(xiàn)出扎堆、顫抖現(xiàn)象，至96 h，羊源、牛源和雞源菌株分別致死1只、5只和2只小鼠，死亡小鼠經(jīng)剖檢未見(jiàn)積液及膿腫；對(duì)照組（生理鹽水）、中劑量和低劑量組均無(wú)小白鼠死亡。因未設(shè)置更高劑量組，未能測(cè)出3株菌的LD50。

3 討論

3.1 分離菌株的培養(yǎng)特性差異本試驗(yàn)所獲3個(gè)臨床分離菌株培養(yǎng)及生化特性均符合金黃色葡萄球菌的基本特征，屬于血漿凝固酶陽(yáng)性、對(duì)新生霉素敏感的葡萄球菌群成員。但3個(gè)菌株在甘露糖、蕈糖利用及甲基紅、二乙酰產(chǎn)生試驗(yàn)存在能力差異，表明這3株不同宿主來(lái)源的金黃色葡萄球菌存在代謝差異。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，羊源菌株的生化特性較接近牛源菌株，提示反芻動(dòng)物來(lái)源的菌株具有某些生化特性的相似性。但牛源與雞源菌株生長(zhǎng)模式相似，而羊源菌株生長(zhǎng)速度明顯快于它們。羊源菌株產(chǎn)生β溶血的能力較強(qiáng)，可能是引起羊群患頑固性皮下膿腫的重要原因。此外，細(xì)菌小菌落突變株（SCVs）表型可能是該菌進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)攝作用和在宿主細(xì)胞中生存的一種最佳策略[17]。

本試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)牛源菌株和雞源菌株在卵黃高鹽瓊脂多數(shù)形成白色菌落，偶爾形成黃色菌落，表明其存在2個(gè)色素相。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)該菌可產(chǎn)生葡萄球菌金黃色素（staphyloxanthin，STX），其化學(xué)本質(zhì)為類胡蘿卜素，可保護(hù)一些菌株免受嗜中性粒細(xì)胞的氧化殺傷[18]。國(guó)內(nèi)外學(xué)者發(fā)現(xiàn)萘替芬（naftifine）和新型抑制劑NP16都能通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)抑制該色素合成的關(guān)鍵催化酶（CrtN），而降低金黃色葡萄球菌的致病力[19-20]，提示色素產(chǎn)生與毒力有關(guān)，調(diào)控STX分泌的基因CrtN已成為新的治療靶點(diǎn)。STX的產(chǎn)生不僅受基因的調(diào)控，還受其他因素影響，如檸檬酸循環(huán)參與色素調(diào)控機(jī)制，而不同培養(yǎng)條件又可影響檸檬酸循環(huán)?？傊?，金黃色葡萄球菌菌落顏色的轉(zhuǎn)變機(jī)理及其聯(lián)系的致病意義，尚不完全清楚。

3.2 分離菌株的遺傳及基因表達(dá)差異16S rRNA基因序列分析顯示，羊源菌株較其他兩株多5個(gè)核苷酸，其中4個(gè)核苷酸集中分布，這可能是有利于rRNA高效表達(dá)和核糖體合成蛋白質(zhì)，從而促進(jìn)細(xì)菌快速生長(zhǎng)的一種變異。三者的Nuc基因片段未見(jiàn)序列差異，表明該基因高度保守。本試驗(yàn)RAPD結(jié)果顯示，3個(gè)菌株指紋圖譜存在眾多差異，表明金黃色葡萄球菌存在豐富的基因多態(tài)性，是引起不同菌株生長(zhǎng)培養(yǎng)特性和致病性存在差異的根本原因[16]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)以O(shè)LP11為引物，擴(kuò)增產(chǎn)物最能顯示3株細(xì)菌之間的基因組差異，提示應(yīng)用該引物可對(duì)廣泛來(lái)源的金黃色葡萄球菌快速進(jìn)行基因分型。遺傳進(jìn)化分析顯示，牛源與雞源菌株非常相近，而羊源菌株與它們相距較遠(yuǎn)，這與16S rRNA基因差異情況吻合。近來(lái)有研究發(fā)現(xiàn)，通常扮演機(jī)會(huì)致病菌的金黃色葡萄球菌，其宿主差異主要由基因組攜帶的可移動(dòng)遺傳原件決定[10]。這與RAPD分型顯示不同宿主來(lái)源的菌株之間存在基因差異大體相符。

SDS-PAGE分析未見(jiàn)3個(gè)菌株存在蛋白質(zhì)表達(dá)種類的顯著差異，可能與考馬斯亮藍(lán)染色法靈敏度不高有關(guān)。但Western blot顯示羊源菌株表達(dá)能誘導(dǎo)宿主動(dòng)物產(chǎn)生良好免疫應(yīng)答的3個(gè)蛋白質(zhì)成分，而在雞源和牛源菌株未見(jiàn)這些蛋白質(zhì)。本試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，牛源菌株黃色與白色菌落在分子量約38.5 kDa的蛋白質(zhì)條帶表達(dá)量差異較大，提示該蛋白質(zhì)可能與色素表達(dá)有關(guān)。但我們未檢測(cè)到腸毒素基因及其蛋白質(zhì)，提示引起食物中毒的菌株與引起感染的菌株可能存在基因種類的差異。將來(lái)通過(guò)基因組比較分析，有望解釋該菌菌株之間的差異來(lái)源。

3.3 分離菌株的多重耐藥性本試驗(yàn)所用菌株分離自奶牛、山羊和雞的不同組織樣品，表明該菌能夠在特定條件下進(jìn)入不同宿主體內(nèi)，并在不同部位定植。我國(guó)牛源金黃色葡萄球菌多呈現(xiàn)多重耐藥，且易發(fā)生耐藥性變異[21]。尤其耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）引起的臨床感染讓人擔(dān)心無(wú)藥可用[5-7]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，3個(gè)菌株都表現(xiàn)出對(duì)青霉素類、鏈霉素及林可霉素的多重耐藥性，其中牛源菌株對(duì)氨基糖苷類耐藥性尤為突出，可能與我們發(fā)現(xiàn)奶牛場(chǎng)經(jīng)常使用該類藥物治療乳房炎等疾病有很大的關(guān)系，即發(fā)揮了選擇作用。由于現(xiàn)代養(yǎng)殖環(huán)境已有明顯改善，雞群死于金黃色葡萄球菌相關(guān)的敗血癥現(xiàn)已少見(jiàn)，但本試驗(yàn)從敗血癥病死雞的心包液分離到該菌，可能是因?yàn)椴∷纻€(gè)體免疫力低下，這與我們發(fā)現(xiàn)采集樣品的雞場(chǎng)存在較高比例的馬立克病毒感染的調(diào)查結(jié)果一致?？傮w看來(lái)，加強(qiáng)控制養(yǎng)殖環(huán)境衛(wèi)生和免疫抑制疾病，對(duì)防范多重耐藥性金黃色葡萄球菌的危害具有生產(chǎn)意義。