付佳琪 蔡治國(guó) 于漫亞 郭志江 張?jiān)茣?崔興

〔摘要〕 目的 基于骨髓瘤細(xì)胞株外泌體測(cè)序及網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究當(dāng)歸四逆湯抑制多發(fā)性骨髓瘤血管新生的機(jī)制，為后續(xù)研究提供有針對(duì)性的指導(dǎo)。方法 利用TCMSP在線平臺(tái)及SwissTargetPrediction網(wǎng)站獲取當(dāng)歸四逆湯主要化學(xué)成分及對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)，借助GeneCards獲取多發(fā)性骨髓瘤血管新生相關(guān)靶點(diǎn)基因，經(jīng)與當(dāng)歸四逆湯作用靶點(diǎn)匹配后，獲得當(dāng)歸四逆湯抑制多發(fā)性骨髓瘤血管新生的作用靶點(diǎn)，并篩選出相應(yīng)作用成分。取正常人（n=5）和骨髓瘤患者（n=6）外周血清提取外泌體進(jìn)行測(cè)序，獲得差異表達(dá)基因。對(duì)骨髓瘤細(xì)胞外泌體進(jìn)行全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，取交集后獲得骨髓瘤來(lái)源外泌體差異表達(dá)基因。進(jìn)而與當(dāng)歸四逆湯抑制多發(fā)性骨髓瘤血管新生的作用靶點(diǎn)匹配，獲得當(dāng)歸四逆湯干預(yù)外泌體抑制多發(fā)性骨髓瘤的作用靶點(diǎn)。借助STRING平臺(tái)與Cytoscape 3.8.2軟件對(duì)靶點(diǎn)間相互作用網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，并利用Metascape網(wǎng)站進(jìn)行GO功能和KEGG通路富集分析。運(yùn)用R語(yǔ)言對(duì)結(jié)果進(jìn)行可視化處理。最后對(duì)主要有效成分和作用靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證。結(jié)果 當(dāng)歸四逆湯作用于多發(fā)性骨髓瘤血管新生的有效成分有117種，干預(yù)外泌體發(fā)揮作用的相關(guān)靶點(diǎn)39個(gè)，包括CCND1、EGF等。GO分析結(jié)果顯示，當(dāng)歸四逆湯作用于多發(fā)性骨髓瘤血管新生潛在靶點(diǎn)的生物功能涉及血管新生、血管系統(tǒng)發(fā)育、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)等。KEGG通路富集顯示，當(dāng)歸四逆湯作用于多發(fā)性骨髓瘤血管新生潛在靶點(diǎn)的通路主要涉及PI3K-AKT、HIF-1等與VEGF相關(guān)的信號(hào)通路等。分子對(duì)接結(jié)果表明主要有效成分槲皮素、樺木酸與關(guān)鍵作用靶點(diǎn)AKT1之間具有良好的對(duì)接活性。結(jié)論 本研究初步揭示了當(dāng)歸四逆湯能夠通過(guò)PI3K-AKT、HIF-1通路干預(yù)外泌體抑制多發(fā)性骨髓瘤血管新生，為進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究提供基礎(chǔ)。

〔關(guān)鍵詞〕 外泌體;全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序;當(dāng)歸四逆湯;多發(fā)性骨髓瘤;血管新生;網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)

〔中圖分類號(hào)〕R285.5 ? ? ? 〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A ? ? ? ?〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2022.01.024

〔Abstract〕 Objective To explore the mechanism of Danggui Sini Decoction in inhibition of angiogenesis in multiple myeloma based on exosome sequencing of myeloma cells and network pharmacology， in order to provide targeted guidance for further studies. Methods The main chemical components and corresponding targets of Danggui Sini Decoction were obtained by TCMSP online platform and SwissTargetPrediction website. GeneCards was used to obtain the target genes related to angiogenesis of multiple myeloma. After matching with the targets of Danggui Sini Decoction， the targets of Danggui Sini Decoction inhibiting angiogenesis of multiple myeloma was obtained， and the corresponding action components were screened. Exosomes were extracted from peripheral blood serum of normal persons （n=5） and myeloma patients （n=6） and sequenced to obtain differentially expressed genes. Whole transcriptome sequencing of myeloma exosomes was performed， and the differentially expressed genes of myeloma-derived exosomes were obtained after intersection. Then， the targets of Danggui Sini Decoction in inhibiting angiogenesis of multiple myeloma were matched， and the targets of Danggui Sini Decoction intervening exosomes in inhibiting multiple myeloma were obtained. The interaction network between targets was analyzed by STRING platform and Cytoscape 3.8.2 software， and GO function and KEGG pathway enrichment analysis were performed by Metascape website. R language was used to visualize the results. Finally， molecular docking verification was performed on the main effective components and targets. Results There were 117 effective components of Danggui Sini Decoction on angiogenesis in multiple myeloma， and 39 related targets for intervention of exosomes， including CCND1， EGF， etc. GO analysis showed that the biological functions of potential targets of Danggui Sini Decoction on angiogenesis in multiple myeloma were related to angiogenesis， vascular system development and cell cycle regulation. KEGG pathway enrichment showed that the pathways of Danggui Sini Decoction acting on potential targets of multiple myeloma angiogenesis mainly involved PI3K-AKT， HIF-1 and other VEGF-related signaling pathways. Molecular docking results showed that quercetin and betulinic acid had good docking activity with key target AKT1. Conclusion This study preliminarily revealed Danggui Sini Decoction can intervene exosomes to inhibit multiple myeloma angiogenesis through PI3K-Akt and HIF-1 pathways， providing a basis for further research.

〔Keywords〕 exosome; whole transcriptome sequencing; Danggui Sini Decoction; multiple myeloma; angiogenesis; network pharmacology

多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma， MM）屬于中醫(yī)學(xué)“骨蝕”“骨痹”的范疇。中醫(yī)理論認(rèn)為，腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要病因病機(jī)是寒凝瘀血內(nèi)阻。寒凝血瘀證表明腫瘤組織處于缺血缺氧的微環(huán)境中[1]，這種微環(huán)境能促進(jìn)腫瘤分泌攜帶有血管生成因子的外泌體[2]，促使腫瘤血管的新生?！端貑?wèn)·調(diào)經(jīng)論》中載有“血?dú)庹?，喜溫而惡寒，寒則泣不能流，溫則消而去之”的治則，因而可以采用溫陽(yáng)化瘀的中藥治療本病。溫陽(yáng)化瘀中藥能夠改善機(jī)體高凝狀態(tài)和腫瘤周圍組織微循環(huán)，不僅可以直接抑制腫瘤血管新生，還能夠通過(guò)改善腫瘤周圍組織微環(huán)境，從腫瘤的生物學(xué)特征與血管生成相關(guān)因子等方面，阻斷腫瘤的血管新生[3]。當(dāng)歸四逆湯源于《傷寒雜病論》，為醫(yī)圣張仲景所作的經(jīng)典名方。本方溫陽(yáng)活血通脈并舉，恰符合抑制外泌體所介導(dǎo)腫瘤血管新生的機(jī)制。

腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)的血管新生是大多數(shù)惡性腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的前提[4]，越來(lái)越多的研究表明，血管新生是MM瘤生長(zhǎng)、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移過(guò)程中的重要環(huán)節(jié)[5]。沙利度胺、來(lái)那度胺可以通過(guò)抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor， VEGF）、堿性成纖維細(xì)胞生成因子（basic fibroblast growth factor， BFGF）等的表達(dá)進(jìn)而抑制血管新生[6]，目前在MM的治療中已取得較好臨床效果[4]。外泌體對(duì)細(xì)胞通訊有著重要作用，能夠參與多種生物過(guò)程，如細(xì)胞凋亡、血管形成、炎癥等[7]。在對(duì)MM瘤的研究中發(fā)現(xiàn)，外泌體中富含雙調(diào)蛋白（amphiregulin， AREG），而AREG可以通過(guò)激活表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor， EGFR）[8]促進(jìn)血管新生;外泌體亦可通過(guò)靶向抑制缺氧誘導(dǎo)因子1（hypoxia inducible factor 1， HIF-1）增強(qiáng)血管生成[9]，從而參與骨髓微環(huán)境的血管新生，這些特點(diǎn)為抑制MM血管新生的治療提供了新的靶點(diǎn)。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)能夠系統(tǒng)地研究藥物對(duì)疾病網(wǎng)絡(luò)的干預(yù)和影響[10]，其整體觀和系統(tǒng)理論與中醫(yī)學(xué)的整體觀念及中藥方劑多靶點(diǎn)、多成分的原理相一致，是研究中藥復(fù)方配伍與藥理作用的有效技術(shù)方法。分子對(duì)接技術(shù)通過(guò)理論模擬受體與配體之間的相互作用，預(yù)測(cè)其結(jié)合模式和親和力，從而能夠完善藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)。

本研究通過(guò)提取外泌體并進(jìn)行分析，結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)，旨在闡釋當(dāng)歸四逆湯抑制MM血管新生的有效活性成分及可能的分子機(jī)制，為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究提供一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 ?外泌體提取與分析

1.1.1 ?試劑與儀器 ?RPMI-1640培養(yǎng)液（產(chǎn)品編號(hào)：CF0001-500ML）、RIPA裂解緩沖液均購(gòu)自濟(jì)南Spark jade生物技術(shù)有限公司;胎牛血清（fetal bovine serum， FBS）（上海Beyotime生物技術(shù)有限公司，產(chǎn)品編號(hào)：C0256）;anti-Calnexin（產(chǎn)品編號(hào)：sc-46669）、anti-TSG101（產(chǎn)品編號(hào)：sc-101254）、anti-CD63（產(chǎn)品編號(hào)：sc-5257）均購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司;外泌體快速沉淀試劑盒（美國(guó)System Bioscience公司）;透射電鏡（日本Hitachi公司，型號(hào)：TEM-HT7700）;BCA蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒（上海Beyotime生物技術(shù)有限公司）。

1.1.2 ?臨床血清標(biāo)本 ?本研究納入2019年8月在山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院（中國(guó)濟(jì)南）血液科住院的6例MM患者。招募5名健康志愿者作為對(duì)照組。該研究獲得山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有參與者在試驗(yàn)前簽署了知情同意書。將外周血樣品收集在真空促凝管中，并在離心（離心半徑16 cm，2500 r/min）5 min后獲得血清樣品。

1.1.3 ?U266細(xì)胞株培養(yǎng)收集上清液 ?MM細(xì)胞系U266來(lái)自美國(guó)模式培養(yǎng)物保藏所（American Type Culture Collection， ATCC），置于含有10% FBS、1%雙抗的培養(yǎng)液中，并放在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)骨髓瘤細(xì)胞到密度80%左右，棄上清，應(yīng)用PBS洗滌細(xì)胞沉淀2次。將培養(yǎng)基更換為含有10%去除外泌體的FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)36 h后收集細(xì)胞上清液。

1.1.4 ?外泌體提取 ?通過(guò)Exo Quick外泌體快速沉淀試劑盒分離正常人外周血血清及U266細(xì)胞上清液的外泌體。將250 μL血清樣品與63 μL Exo Quick外泌體沉淀溶液混合，在冰上孵育30 min并離心，然后吸取上清液，離心5 min，最后分離沉淀中的外泌體。

1.1.5 ?透射電鏡分析 ?用4%多聚甲醛固定外泌體，用PBS洗滌。將樣品在室溫下放置在碳涂覆的200目銅網(wǎng)格上20 min，并在1%戊二醛中固定5 min，然后用去離子水洗滌3次。用草酸鈾酰對(duì)樣品進(jìn)行染色5 min，并以1∶9的比例加入一滴4%乙酸鈾酰和2%甲基纖維素在冰上包埋，再用透射電子顯微鏡對(duì)干燥的網(wǎng)格成像。

1.1.6 ?蛋白印跡分析 ?對(duì)MM患者和健康志愿者血清中提取的外泌體分別進(jìn)行蛋白印跡分析。用RIPA裂解緩沖液（Spark jade）裂解細(xì)胞，用BCA蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒測(cè)定（Beyotime）蛋白質(zhì)濃度。等量的樣品蛋白用10% SDS-PAGE進(jìn)行電泳分離，然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。在5%脫脂奶溶液中浸泡2 h后，將膜在40 ℃下與一級(jí)抗體anti-Calnexin， anti-TSG101， anti-CD63（Santa Cruz Biotechnology， Santa Cruz， CA， USA）一起孵育過(guò)夜。然后，將膜與第二抗體（Beyotime）一起孵育1 h。最后，使用Alpha Innotech

Fluor Chem Q成像分析系統(tǒng)進(jìn)行可視化。

1.1.7 ?高通量測(cè)序 ?利用Illumina Hiseq儀器上述兩種來(lái)源的外泌體進(jìn)行150 bp雙端測(cè)序，相關(guān)基因表達(dá)分析由上海云序生物科技有限公司進(jìn)行。

1.2 ?網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

1.2.1 ?當(dāng)歸四逆湯有效成分及靶點(diǎn)的篩選 ?通過(guò)TCMSP在線平臺(tái)[11]尋找當(dāng)歸四逆湯中當(dāng)歸、桂枝、白芍、細(xì)辛、通草、甘草、大棗的化學(xué)組成成分，根據(jù)口服生物利用度（oral bioavailability， OB）≥30%和類藥性（drug likeness， DL）≥0.18的2個(gè)ADME屬性值篩選出符合條件的化學(xué)成分及其對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)，借助UniProt蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)，物種設(shè)定為“human”，將靶點(diǎn)轉(zhuǎn)換為對(duì)應(yīng)的基因，并利用SwissTargetPrediction網(wǎng)站[12]（http：//www.swisstargetprediction.ch/）補(bǔ)充藥物有效成分的作用靶點(diǎn)信息。

1.2.2 ?MM靶點(diǎn)的收集與篩選 ?以“multiple myeloma and angiogenesis”為檢索詞，通過(guò)GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)、OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)檢索相應(yīng)的靶點(diǎn)。合并2個(gè)疾病數(shù)據(jù)庫(kù)靶點(diǎn)后，刪除重復(fù)值得到MM靶點(diǎn)。

1.2.3 ?當(dāng)歸四逆湯成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 ?將當(dāng)歸四逆湯成分靶點(diǎn)與MM血管新生靶點(diǎn)取交集，獲得當(dāng)歸四逆湯抑制MM血管新生的作用靶點(diǎn)。根據(jù)交集靶點(diǎn)反向篩選當(dāng)歸四逆湯有效成分，構(gòu)建當(dāng)歸四逆湯成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，將其導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2軟件[13]，使用Network Analyzer功能進(jìn)一步分析當(dāng)歸四逆湯成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，根據(jù)成分與靶點(diǎn)連接情況篩選出當(dāng)歸四逆湯作用于MM的關(guān)鍵成分。

1.3 ?當(dāng)歸四逆湯干預(yù)外泌體抑制MM血管新生的機(jī)制研究

1.3.1 ?當(dāng)歸四逆湯-外泌體靶點(diǎn)基因網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建 ?將當(dāng)歸四逆湯抑制MM血管新生靶點(diǎn)基因與外泌體差異表達(dá)基因取交集，即獲得當(dāng)歸四逆湯干預(yù)外泌體抑制MM血管新生的作用靶點(diǎn)。利用STRING平臺(tái)[14]與Cytoscape軟件，對(duì)交集靶點(diǎn)進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?，并?gòu)建當(dāng)歸四逆湯-外泌體靶點(diǎn)基因網(wǎng)絡(luò)圖。

1.3.2 ?KEGG與GO分析 ?應(yīng)用Metascape數(shù)據(jù)平臺(tái)對(duì)當(dāng)歸四逆湯干預(yù)外泌體抑制MM血管新生的相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行富集分析，以P<0.01為篩選標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行GO和KEGG通路富集分析，并借助R語(yǔ)言對(duì)富集結(jié)果進(jìn)行可視化處理。

1.3.3 ?分子對(duì)接 ?篩選出當(dāng)歸四逆湯干預(yù)外泌體抑制MM血管新生的主要有效成分與靶點(diǎn)，利用RCSB PDB數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.rcsb.org/）獲得核心靶點(diǎn)蛋白晶體結(jié)構(gòu)的PDB格式文件，通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)獲得有效成分的Mol2格式文件，利用AutoDock Tools對(duì)核心靶點(diǎn)和有效成分進(jìn)行處理，獲得相應(yīng)的pdbqt格式文件，利用Vina進(jìn)行分子對(duì)接，并統(tǒng)計(jì)各模型的結(jié)合能，最后用PyMol對(duì)活性較高的對(duì)接模型進(jìn)行可視化。

2 結(jié)果

2.1 ?外泌體的鑒定

透射電鏡顯示直徑<100 nm的圓形外泌體（圖1A）。Western blot分析證實(shí)MM患者血清中非外體標(biāo)記Calnexin的低表達(dá)和特異性外體膜標(biāo)記CD63和TSG101（圖1B）的高水平。

2.2 ?外泌體測(cè)序結(jié)果

與健康志愿者相比，骨髓瘤患者外周血外泌體高通量測(cè)序共發(fā)現(xiàn)了20 309個(gè)差異表達(dá)的mRNA。為篩選表達(dá)差異顯著的外泌體mRNA，以FC值和P值（FC≥2.0和P<0.05）作為統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性標(biāo)準(zhǔn)，總共有6782個(gè)mRNA在MM患者和健康對(duì)照組中有顯著不同的表達(dá)，其中，5982個(gè)為上調(diào)mRNA，800個(gè)為下調(diào)mRNA。U266全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序共獲得13 629個(gè)mRNA。

2.3 ?當(dāng)歸四逆湯有效成分及靶點(diǎn)

在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中，初步檢索到7味中藥化學(xué)成分共1069種，經(jīng)ADME篩選后，得到有效成分155種，刪除25種無(wú)作用靶點(diǎn)的成分，即130種有效成分（見(jiàn)表1）。將130個(gè)有效成分與中藥構(gòu)建復(fù)方-成分網(wǎng)絡(luò)（見(jiàn)圖2），并對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治觯鶕?jù)“中介中心性”降序排列，前4位的有效成分分別是樺木酸、山柰酚、槲皮素、谷甾醇。

通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)篩選有效成分靶點(diǎn)信息，結(jié)合SwissTargetPrediction在線靶標(biāo)垂釣，并統(tǒng)一在UniProt蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)將化合物作用的蛋白質(zhì)靶點(diǎn)進(jìn)行規(guī)范。共收集到相關(guān)作用靶點(diǎn)共346個(gè)（已刪除重復(fù)值）。

2.4 ?MM血管新生靶點(diǎn)的獲取

從GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)獲得MM瘤血管新生靶點(diǎn)1770個(gè)。設(shè)定Score大于中位數(shù)的靶點(diǎn)為MM血管新生的潛在靶點(diǎn)，連續(xù)進(jìn)行2次篩選后，結(jié)合OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)補(bǔ)充相關(guān)靶點(diǎn)，合并后刪除重復(fù)值，得到MM相關(guān)靶點(diǎn)885個(gè)。

2.5 ?當(dāng)歸四逆湯成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將篩選的當(dāng)歸四逆湯活性成分靶點(diǎn)與MM血管新生靶點(diǎn)通過(guò)R語(yǔ)言取交集，并將交集靶點(diǎn)通過(guò)STRING平臺(tái)與Cytoscape軟件構(gòu)建靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)，最終獲得143個(gè)交集靶點(diǎn)（見(jiàn)表3）。根據(jù)交集靶點(diǎn)反向篩選當(dāng)歸四逆湯有效成分，得到作用于MM血管新生的相關(guān)活性成分117個(gè)，通過(guò)Cytoscape軟件的Network Analyzer功能構(gòu)建當(dāng)歸四逆湯成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，根據(jù)“度中心性”排序發(fā)現(xiàn)，前5位化合物為槲皮素、山柰酚、β-胡蘿卜素、甘草查爾酮A、柚皮素（見(jiàn)表2），推測(cè)可能為當(dāng)歸四逆湯抑制MM血管新生的關(guān)鍵成分。

2.6 ?當(dāng)歸四逆湯-外泌體靶點(diǎn)基因網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將人外周血外泌體差異上調(diào)基因與U266測(cè)序基因取交集，獲得3862個(gè)骨髓瘤細(xì)胞來(lái)源的差異基因（見(jiàn)圖3A），將其與當(dāng)歸四逆湯作用靶點(diǎn)匹配，獲得當(dāng)歸四逆湯干預(yù)外泌體抑制MM血管新生的可能作用靶點(diǎn)39個(gè)（見(jiàn)表3，圖3B）。借助STRING平臺(tái)與Cytoscape軟件制作當(dāng)歸四逆湯干預(yù)外泌體作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖（圖3C）。

2.7 ?KEGG與GO分析

應(yīng)用Metascape數(shù)據(jù)平臺(tái)對(duì)當(dāng)歸四逆湯干預(yù)外泌體抑制MM血管新生相關(guān)的39個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行富集分析，以P<0.01為篩選標(biāo)準(zhǔn)，獲得GO生物學(xué)過(guò)程條目587條、KEGG通路27條，運(yùn)用R語(yǔ)言對(duì)富集顯著的相關(guān)通路進(jìn)行可視化處理（圖4）。

GO生物學(xué)過(guò)程分析結(jié)果顯示，相關(guān)靶點(diǎn)基因富集在血管發(fā)育（blood vessel development）、血管形態(tài)發(fā)育（blood vessel morphogenesis）、激酶活性的調(diào)控（regulation of kinase activity）、細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)（regulation of cell cycle）等生物學(xué)過(guò)程。

KEGG通路包括PI3K-AKT信號(hào)通路、p53信號(hào)通路、VEGF信號(hào)通路、NF-kappa B信號(hào)、MAPK信號(hào)通路、AGE-RAGE信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路等。選取P值在前10位的通路建立靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)（見(jiàn)圖3D）進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)多個(gè)靶點(diǎn)顯著富集在PI3K-AKT信號(hào)通路，同時(shí)多條信號(hào)通路與血管新生有關(guān)，如VEGF信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路等。這提示當(dāng)歸四逆湯可以通過(guò)多條通路干預(yù)外泌體從而抑制MM血管新生。

2.8 ?分子對(duì)接

通過(guò)KEGG分析并進(jìn)一步查閱文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)當(dāng)歸四逆湯抑制MM血管新生中的多條通路均有PI3K-AKT信號(hào)通路的參與，而AKT1是該通路上的關(guān)鍵靶點(diǎn)，而AKT1同時(shí)為當(dāng)歸四逆湯發(fā)揮作用的關(guān)鍵靶點(diǎn)，因此，選取2種主要有效成分（槲皮素、山柰酚）與AKT1結(jié)合模式進(jìn)行展示（見(jiàn)圖5）。由圖5可見(jiàn)槲皮素和山柰酚與JUN、MAPK1、AKT1靶點(diǎn)蛋白均形成氫鍵，表明具有良好的結(jié)合性。

3 討論

腫瘤細(xì)胞分泌的外泌體對(duì)血管新生具有重要影響，腫瘤細(xì)胞來(lái)源的外泌體能夠通過(guò)Hh-GLI信號(hào)通路促進(jìn)VEGF的表達(dá)[15]，也可通過(guò)分泌EGFR誘導(dǎo)血管新生[16]。本研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)對(duì)U266細(xì)胞外泌體進(jìn)行測(cè)序，并將高表達(dá)基因與當(dāng)歸四逆湯抑制MM血管新生的靶點(diǎn)進(jìn)行匹配，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，U266細(xì)胞外泌體差異表達(dá)的mRNA中存在VEGF等血管新生相關(guān)的mRNA高表達(dá)。KEGG通路富集分析顯示，主要富集于PI3K-AKT、AGE-RAGE、VEGF、HIF-1等信號(hào)通路，揭示了當(dāng)歸四逆湯干預(yù)U266外泌體抑制血管新生的主要機(jī)制。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，樺木酸、山柰酚、槲皮素、谷甾醇可能是本方發(fā)揮作用的重要成分。樺木酸可抑制HIF-1α的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而抑制HIF-1α和STAT3與VEGF基因啟動(dòng)子的結(jié)合來(lái)減少新生血管形成[17];山柰酚能夠通過(guò)調(diào)節(jié)VEGF/VEGF-2及其下游信號(hào)級(jí)聯(lián)，從而起到抑制血管新生的作用[18];槲皮素為黃酮類化合物，有研究表明槲皮素能夠下調(diào)VEGF-A的表達(dá)，能夠很好的抑制血管新生[19-20]。以上3種成分在當(dāng)歸四逆湯成分中“中介中心性”排序?yàn)榍?位，提示樺木酸、山柰酚、槲皮素可能是當(dāng)歸四逆湯發(fā)揮抗血管新生的重要成分，而通過(guò)分子對(duì)接技術(shù)，驗(yàn)證了槲皮素、山柰酚與相關(guān)靶點(diǎn)具有良好的結(jié)合性。從而推測(cè)當(dāng)歸四逆湯主要通過(guò)以下機(jī)制干預(yù)外泌體抑制骨髓瘤血管新生：（1）槲皮素通過(guò)抑制VEGF的表達(dá)水平抑制腫瘤血管新生[21];（2）槲皮素可以抑制HIF-1α的轉(zhuǎn)錄活性從而抑制腫瘤血管新生[22];（3）槲皮素與山柰酚一同抑制AKT的表達(dá)[22]，從而抑制MM血管新生。

通路富集結(jié)果顯示，當(dāng)歸四逆湯干預(yù)外泌體抑制血管新生相關(guān)的通路主要集中在以下幾條：（1）PI3K/AKT信號(hào)通路：PI3K為兩個(gè)亞基構(gòu)成的異二聚體，包括催化亞基和調(diào)節(jié)亞基[23]，其活化后能夠?qū)?，4-二磷酸磷脂酰肌醇（PIP2）轉(zhuǎn)化為3，4，5-三磷酸磷脂酰肌醇（PIP3）[24]。AKT是PI3K的下游信號(hào)分子，能夠與PIP3相結(jié)合，從而激活Ser473位點(diǎn)，進(jìn)而調(diào)控腫瘤細(xì)胞的凋亡。VEGF啟動(dòng)子包含多種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，如SP1/SP3的結(jié)合位點(diǎn)[25]，在受到刺激時(shí)，PI3K的調(diào)節(jié)亞基會(huì)磷酸化，AKT上Ser473也磷酸化，從而使PI3K/AKT激活，SP1上的Thr453與Thr739被磷酸化，啟動(dòng)VEGF的轉(zhuǎn)錄[26]。AKT活化可啟動(dòng)下游信號(hào)分子mTOR，mTOR能夠促進(jìn)VEGF的上調(diào)，促進(jìn)血管新生[27]。此外，mTOR還可調(diào)節(jié)STAT3的活化，而STAT3在腫瘤缺氧環(huán)境下，能夠和HIF-1α與VEGF啟動(dòng)子結(jié)合，從而促進(jìn)血管新生[28];同時(shí)能夠促進(jìn)其下游目標(biāo)如BFGF、HGF的表達(dá)，從而導(dǎo)致新生血管形成。（2）VEGF相關(guān)通路：VEGF是血管新生過(guò)程中最重要的調(diào)節(jié)因子之一[29]，其介導(dǎo)的各信號(hào)級(jí)聯(lián)幾乎參與血管新生的各個(gè)過(guò)程[30]。VEGF的表達(dá)水平與骨髓瘤血管新生關(guān)系密切，已經(jīng)有學(xué)者將其作為其評(píng)價(jià)療效及危險(xiǎn)度指標(biāo)之一[31]。（3）HIF-1α相關(guān)通路：HIF-1α為缺氧情況下誘導(dǎo)產(chǎn)生的特異結(jié)合蛋白，其與HIF-1β構(gòu)成活性HIF-1異二聚體，參與缺氧反應(yīng)基因調(diào)節(jié)，從而使細(xì)胞適應(yīng)低氧環(huán)境，促進(jìn)血管新生，有研究顯示[32-33]，HIF-1α可能通過(guò)上調(diào)Ang-2表達(dá)，進(jìn)一步上調(diào)多種促血管生成因子的表達(dá)從而導(dǎo)致腫瘤血管新生。而且在HIF-1α調(diào)節(jié)其下游基因VEGF的過(guò)程中，PI3K/AKT通路也會(huì)起重要調(diào)節(jié)作用[34]。因此，HIF-1α在腫瘤血管新生中具有重要的意義。

綜上所述，本研究通過(guò)對(duì)U266及外周血清外泌體進(jìn)行高通量測(cè)序并結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，系統(tǒng)分析了當(dāng)歸四逆湯干預(yù)外泌體抑制MM血管新生的作用機(jī)制，并通過(guò)分子對(duì)接技術(shù)驗(yàn)證了有效成分與核心靶點(diǎn)之間具有良好的結(jié)合活性，從而證實(shí)了本研究團(tuán)隊(duì)的假說(shuō)：溫陽(yáng)化瘀中藥可以通過(guò)干預(yù)腫瘤細(xì)胞分泌外泌體介導(dǎo)血管新生抑制腫瘤發(fā)展，腫瘤所處寒凝血瘀狀態(tài)與血管新生存在一定的聯(lián)系。當(dāng)歸四逆湯抑制MM血管新生具有多靶點(diǎn)、多通路的特點(diǎn)，為當(dāng)歸四逆湯的進(jìn)一步研究提供理論基礎(chǔ)。

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