王文慶，國憲虎，方良艷，張 慶，萬 敏

(1.山東省醫(yī)療器械和藥品包裝檢驗研究院微生物室，山東 濟南 250101； 2.山東省醫(yī)療器械和藥品包裝檢驗研究院物理室，山東 濟南 250101； 3.山東省醫(yī)療器械和藥品包裝檢驗研究院，山東 濟南 250101； 4.國家藥品監(jiān)督管理局醫(yī)用衛(wèi)生材料及生物防護器械質(zhì)量評價重點實驗室，山東 濟南 250101)

靜脈輸液是臨床上常見的治療手段，研究[1]顯示，超過90%的住院患者需要靜脈輸液治療。靜脈輸液治療為患者帶來益處的同時，也存在細菌感染的風險及隱患[2]。研究[3]表明，部分輸液污染可來自空氣中的微生物，故為降低感染風險，GB 8368—2018《一次性使用輸液器 重力輸液式》國家標準提出，需要對輸液器的進氣器件增加空氣過濾器，阻止輸液環(huán)境中的微生物進入輸液瓶，從而阻止細菌進入人體內(nèi)[4]。盡管該標準提出增加空氣過濾器的要求，但目前并沒有提供空氣過濾器細菌截留能力的具體評價方法，在醫(yī)療器械行業(yè)中也鮮有相關評價方法的報道。

制藥行業(yè)中有評價空氣過濾器細菌截留能力的方法，包括液體細菌截留試驗、氣溶膠細菌截留試驗和氣溶膠病毒截留試驗[5]。由于輸液器中使用的空氣過濾器一般是有效過濾面積特別小的膜式過濾器，與制藥行業(yè)中的空氣過濾器在用途和結(jié)構上完全不一致，因此無法直接采用制藥行業(yè)空氣過濾器的評價方法。本研究借鑒制藥行業(yè)空氣過濾器的評價模式，模擬輸液器進氣器件的臨床使用情況，設計開發(fā)氣溶膠細菌截留試驗系統(tǒng)及其試驗方法，將金黃色葡萄球菌混懸液氣溶膠化對樣品進行氣溶膠挑戰(zhàn)，對可能穿透的細菌用收集液進行收集，并進行細菌計數(shù)分析，以此評價輸液器進氣器件的氣溶膠細菌截留能力，現(xiàn)將研究結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 主要材料包括預制胰酪大豆胨瓊脂(TSA，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司)培養(yǎng)基平板、胰酪大豆胨液體(TSB，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司)培養(yǎng)基、0.9%無菌氯化鈉溶液(山東華魯制藥有限公司)、分析薄膜(孔徑0.45 μm、直徑約47 mm)；儀器設備包括氣溶膠細菌截留試驗系統(tǒng)(見圖1)、生物安全柜(Nuaire NU-437-600S)、立式高壓蒸汽滅菌器(SYSTEC VE-75)、低溫培養(yǎng)箱(MMM FRIOCELL 400L)等；試驗菌種為金黃色葡萄球菌(ATCC 6538)。選取5個生產(chǎn)廠家(A～E)的空氣過濾器(分為一體式和分體式)，每個生產(chǎn)廠家選取3個批次，每批次選取5個樣品，共75個樣品進行測試。

1：微生物氣溶膠發(fā)生器；2：氣溶膠室；3：裝有空氣過濾器的通氣口；4：風扇；5：樣品挑戰(zhàn)組件；6：陽性對照支路(進氣管路)；7：液體撞擊采樣器；8：抽吸管路；9：終端過濾器；10：帶有調(diào)節(jié)閥的浮子流量計(用以調(diào)節(jié)和指示各路流量)；11：六支路管；12：負壓泵；13：氣體平衡管道；14：帶有調(diào)節(jié)閥的浮子流量計(用以調(diào)節(jié)總流量)。

1.2 方法

1.2.1 細菌挑戰(zhàn)混懸液制備 從TSA中挑取金黃色葡萄球菌ATCC 6538接種到TSB中，(36±1)℃下培養(yǎng)18～24 h。用0.9 %無菌氯化鈉溶液稀釋至108CFU/mL。

1.2.2 樣品挑戰(zhàn)試驗 挑戰(zhàn)試驗前，樣品挑戰(zhàn)組件及液體撞擊采樣器在121℃下滅菌15 min，并以無菌操作的方式連接試驗管路、裝入供試空氣過濾器、加入細菌挑戰(zhàn)混懸液等。啟動微生物氣溶膠發(fā)生器，向氣溶膠室內(nèi)噴射金黃色葡萄球菌氣溶膠，同時打開風扇。3 min后啟動負壓泵，調(diào)節(jié)各支路流量至50 mL/min，同時觀察各液體撞擊采樣器的氣泡逸出情況；3 min后關閉微生物氣溶膠發(fā)生器，27 min后關閉負壓泵。

1.2.3 細菌計數(shù) 每次取下陽性對照支路上的液體撞擊采樣器，用0.9%無菌氯化鈉溶液對陽性對照支路收集液進行10倍梯度稀釋，采用薄膜過濾法過濾稀釋后的收集液，并將薄膜放置TSA培養(yǎng)基平板上，在(36±1)℃下培養(yǎng)18 ～24 h后觀察是否有菌生長并進行計數(shù)。每次取下5個樣品挑戰(zhàn)支路上的液體撞擊采樣器，采用薄膜過濾法過濾樣品挑戰(zhàn)支路收集液，并將薄膜放置TSA培養(yǎng)基平板上，在(36±1)℃下培養(yǎng)18～24 h后觀察是否有菌生長并進行計數(shù)。

1.2.4 結(jié)果判定 陽性對照支路金黃色葡萄球菌總數(shù)應>104CFU，否則試驗無效。每5個樣品挑戰(zhàn)支路收集液均無菌生長，判為符合要求，否則不符合要求。

2 結(jié)果

2.1 氣溶膠細菌截留能力情況 共選取5個生產(chǎn)廠家(A～E)15個批次75個樣品進行測試，結(jié)果顯示，生產(chǎn)廠家A～D 12個批次60個樣品的支路收集液均無菌生長，符合要求；生產(chǎn)廠家E 3個批次15個樣品的支路收集液菌落數(shù)均>100 CFU，不符合要求。見表1。

表1 空氣過濾器樣品氣溶膠挑戰(zhàn)試驗結(jié)果

2.2 樣品濾膜材質(zhì)與孔徑 生產(chǎn)廠家A～E的空氣過濾器的材質(zhì)分別為聚四氟乙烯、聚偏氟乙烯、聚丙烯、聚四氟乙烯、玻璃纖維，孔徑分別為0.22、0.22、2、2、5 μm。

3 討論

研究檢測5個生產(chǎn)廠家的典型空氣過濾器，結(jié)果顯示，生產(chǎn)廠家A～D的樣品均符合要求，而生產(chǎn)廠家E的樣品不符合要求，進一步分析發(fā)現(xiàn)廠家E的樣品濾膜材質(zhì)為玻璃纖維，孔徑為5 μm，不適用于輸液器進氣器件的空氣過濾器；A～D廠家樣品材質(zhì)種類各異，但其孔徑偏小(均<2.5 μm)，檢測符合要求，適合用于輸液器進氣器件的空氣過濾器。

試驗系統(tǒng)使用人工制備的氣溶膠而非自然污染的氣溶膠，增加了檢測條件的可控性和檢測結(jié)果的重復性和再現(xiàn)性。試驗系統(tǒng)采用的Collison 噴霧器激發(fā)的氣溶膠能模擬普通空氣環(huán)境中微生物狀態(tài)[6]。Collison 噴霧器是被廣泛認可的對液體或者混懸液進行氣溶膠化的技術，目前廣泛應用于空氣生物學[7]、氣溶膠研究[8]、生物安全柜測試[9]以及過濾器評價[10]等。 Collison 噴霧器激發(fā)的氣溶膠顆粒的質(zhì)量中值粒徑為2.5 μm。據(jù)報道，空氣中與疾病有關的帶菌粒子直徑一般為4～20 μm[11]。故認為進氣器件的空氣過濾器能攔截2.5 μm的氣溶膠顆粒，可以有效攔截空氣中的微生物氣溶膠。

本試驗中使用金黃色葡萄球菌作為挑戰(zhàn)微生物是基于以下考慮：(1)金黃色葡萄球菌是臨床血源性感染常見菌之一[12]；(2)在防護服、口罩、手套等細菌挑戰(zhàn)試驗中也普遍采用金黃色葡萄球菌[13-15]；(3)金黃色葡萄球菌容易獲得且有明顯的生長特征，易識別。

本次試驗方法設計采用高于臨床水平的試驗參數(shù)。首先，試驗方法規(guī)定50 mL/min的測試流量和30 min的測試時間，相應地，試樣共經(jīng)受1 500 mL的測試總氣流量，三項挑戰(zhàn)參數(shù)均嚴于臨床；其次，由于試驗方法規(guī)定的挑戰(zhàn)水平為不低于104CFU，也就是說，1 500 mL的挑戰(zhàn)總氣流量中含有不低于104CFU的微生物數(shù)量，相當于每1 m3環(huán)境空氣中含有不低于107CFU的微生物數(shù)量，遠高于普通臨床輸液環(huán)境中的微生物濃度[16-17]。

為保證試驗的有效性，本試驗系統(tǒng)在使用前應進行試驗系統(tǒng)確認，保證挑戰(zhàn)水平達到104CFU,并保證6個支路挑戰(zhàn)水平具有一致性。經(jīng)過多次試驗研究，發(fā)現(xiàn)菌懸液的濃度達到108CFU/mL時，試驗系統(tǒng)每個支路的挑戰(zhàn)水平均能達到104CFU,6個支路檢測結(jié)果的變異系數(shù)為3.5%～12.7%。

本試驗方法和試驗系統(tǒng)適用于評價輸液、輸血器具中一體式和分體式進氣器件的空氣過濾器。由于本試驗方法設計為定性試驗，無法給出定量的過濾效率數(shù)據(jù)，故本方法僅作為評價空氣過濾器是否適合作為輸液、輸血器具進氣器件的基準要求，不能對空氣過濾器的細菌截留能力進行分級、分類。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。