胡小品，袁國航，吳瑤瑤，劉維佳，楊 斌，韓 婧，陳 琳，歐陽瑤，劉 琳

(1. 貴州大學醫(yī)學院，貴州 貴陽 550000； 2. 貴州省人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科，貴州 貴陽 550000； 3. 貴州省人民醫(yī)院中心實驗室， 貴州 貴陽 550000； 4. 四川省人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科， 四川 成都 610072； 5. 遵義醫(yī)科大學附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科，貴州 遵義 563006)

耐碳青霉烯類腸桿菌目細菌(carbapenem-resistantEnterobacterales, CRE)的耐藥性是醫(yī)療面臨的緊迫問題之一，其菌株毒力強，感染患者病情重，治療藥物選擇有限，目前全球已發(fā)表的研究中CRE感染已經(jīng)達到近60%的病死率[1-3]。美國國家醫(yī)療保健安全網(wǎng)(National Healthcare Safety Network, NHSN)和醫(yī)院感染監(jiān)測系統(tǒng)(National No-socomial Infection Surveillance System, NNIS)監(jiān)測數(shù)據(jù)顯示，CRE在醫(yī)療保健相關(guān)感染中的比率已從2001年1.2%增加到2011年的4.2%，其中感染率的增加主要集中在克雷伯菌屬(Klebsiellaspp.)，從1.6%增加至10.4%。中國已有研究關(guān)注耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌(carbapenem-resistantKlebsiellapneumoniae, CRKP)在國內(nèi)的分子流行病學特征和分布[4-9]。2007年中國首次報道CRKP，至此之后幾乎每個省都已發(fā)現(xiàn)CRE[4-5]。中國一項多中心研究收集了2014—2015年來自全國27個省市999株CRE，其中CRKP以70%位居首位，遠高于大腸埃希菌(16%)和其他腸桿菌目細菌(13%)[5]。中國CRKP對碳青霉烯類的耐藥率在2014年攀升至13.4%[6-7]，已經(jīng)成為導致臨床嚴重感染和治療失敗的最重要耐藥菌。因此，本研究以中國西南地區(qū)3所三級甲等醫(yī)院收集的CRKP為研究對象，比較CRKP感染患者的臨床特征、實驗室檢查和轉(zhuǎn)歸等信息，檢測CRKP的流行病學特征及耐藥性，為CRKP感染的預(yù)防與治療提供實驗室數(shù)據(jù)和臨床信息。

1 資料與方法

1.1 菌株收集與鑒定 收集2019年1—12月來自貴州省人民醫(yī)院、四川省人民醫(yī)院和遵義醫(yī)科大學附屬醫(yī)院等3所三級甲等醫(yī)院共159株對碳青霉烯類不敏感的KP菌株(排除來源于同一患者的菌株)，按照全自動微生物分析系統(tǒng)(Phoenixtm-100，BD，美國)及CRKP菌株基因組DNA為模板擴增 RNA聚合酶β亞單位基因(rpoB)進行細菌鑒定后[10]，參照2019年美國臨床實驗室標準化協(xié)會(Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI)應(yīng)用改良 Hodge 試驗進行表型驗證。159株KP均確定為CRKP并納入本研究，ATCC 700603為質(zhì)控菌株。

1.2 臨床數(shù)據(jù)采集 根據(jù)美國疾病控制與預(yù)防中心(CDC)和NHSN標準，收集CRKP感染患者的臨床和流行病學資料，包括CRKP菌株標本來源(痰、血、腹腔積液、尿、傷口分泌物和其他類型標本)、患者基礎(chǔ)資料(性別、年齡、基礎(chǔ)疾病)、CRKP陽性培養(yǎng)30天前侵入性操作及留置導管情況(深靜脈置管、氣管插管/氣管造瘺、導尿管、透析)、CRKP陽性培養(yǎng)30天前抗菌藥物使用(抗菌藥物單藥治療、聯(lián)合治療、使用第三/四代頭孢菌素、使用碳青霉烯類抗生素)、實驗室檢查(外周血白細胞計數(shù)、C反應(yīng)蛋白、降鈣素原)和臨床轉(zhuǎn)歸(痊愈、好轉(zhuǎn)/轉(zhuǎn)院、死亡)。該研究由貴州省人民醫(yī)院研究倫理委員會審核批準(No.2015022)。

1.3 藥敏試驗 采用微量肉湯稀釋法檢測美羅培南、亞胺培南、慶大霉素、阿米卡星、左氧氟沙星、頭孢曲松、頭孢他啶、頭孢西丁、氨曲南、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢哌酮/舒巴坦11種抗菌藥物對CRKP的最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)。

1.4 碳青霉烯酶基因檢測 利用聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction, PCR)，以CRKP細菌基因組DNA為模板，擴增CRKP菌株中碳青霉烯酶基因KPC、GES、IMP、VIM、NDM和OXA-48，引物見表1[11-12]。擴增產(chǎn)物雙向測序后與 GenBank 數(shù)據(jù)庫進行比對，確定CRKP菌株攜帶的碳青霉烯酶基因。

表1 擴增碳青霉烯酶基因的引物序列、退火溫度及產(chǎn)物大小

1.5 多位點序列分型(multilocus sequence typing, MLST) 根據(jù)巴斯德研究所MLST網(wǎng)站(http://bigsdb.pasteur.fr/klebsiella/klebsiella.html)，分別以159株CRKP菌株基因組DNA為模板，擴增7個管家基因(gapA、infB、mdh、pgi、phoE、rpoB、tonB)后進行MLST[13]。

1.6 統(tǒng)計學方法 應(yīng)用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。計數(shù)資料采用例數(shù)和百分比表示，無序分類計數(shù)資料組間比較采用Fisher確切概率法，等級分類計數(shù)資料比較采用秩和檢驗。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 患者基礎(chǔ)情況 159例CRKP感染患者中男性占59.1%(94例)，年齡[M(P25，P75)：64(52～78)]歲，其中≥65歲患者占50.3%(80例)，77.4%(123例)患有2種和/或2種以上基礎(chǔ)疾病。見表2。

表2 159例CRKP感染患者基本特征

2.2 CRKP感染患者臨床特征、實驗室檢查及轉(zhuǎn)歸94.3%患者在獲得CRKP培養(yǎng)陽性前都接受過侵入性操作，其中標本來源為痰和血的兩組患者比率高于尿和腹腔積液組(均P<0.05)。傷口分泌物組患者實施氣管插管/氣管造瘺的比率高于痰、尿、腹腔積液組(P<0.05)。痰、血、傷口分泌物組患者使用導尿管的比率高于腹腔積液組(均P<0.05)?？咕幬锸褂梅矫?，腹腔積液組的單藥治療比率高于其他各組(均P<0.05)；傷口分泌物組患者使用第三/四代頭孢菌素的比率高于痰、尿來源患者(P<0.05)；血、傷口分泌物組患者使用碳青霉烯類高于其余各組(均P<0.05)。各組患者的C反應(yīng)蛋白和降鈣素原比較，差異無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。標本來源為血患者的轉(zhuǎn)歸最差，病死率較高，為66.7%。見表3。

表3 CRKP不同標本來源患者的臨床特征、實驗室檢查及轉(zhuǎn)歸[例(%)]

2.3 藥敏試驗結(jié)果 159株CRKP均為多重耐藥菌(multidrug-resistant organism, MDRO)，對頭孢他啶、頭孢西丁、頭孢哌酮/舒巴坦、亞胺培南、美羅培南、氨曲南和慶大霉素的耐藥率均為100%，對其他抗菌藥物的耐藥率為81.1%～96.9%。見表4。

表4 159株CRKP對11種抗菌藥物的耐藥情況

2.4 碳青霉烯類基因檢測 159株CRKP菌株均檢測出碳青霉烯酶基因，其中129株(81.1%)只攜帶KPC-2，21株(13.2%)只攜帶NDM-1，9株(5.7%)同時攜帶KPC-2和NDM-1。9株同時攜帶KPC-2和NDM-1的菌株中，6株(66.7%)來自血培養(yǎng)。未檢測出GES、IMP、VIM和OXA-48基因。見圖1。

A：KPC-2擴增產(chǎn)物電泳圖；B：NDM-1擴增產(chǎn)物電泳圖。

2.5 MLST結(jié)果 159株CRKP共檢測出8種序列型，其中最流行的序列類型為ST11(64.2%)。不同來源醫(yī)院的CRKP菌株MLST構(gòu)成比較，差異有統(tǒng)計學差異(χ2=28.927，P=0.002)，其中ST244分型的菌株全部來源于遵義醫(yī)科大學附屬醫(yī)院。見表5。

表5 不同來源醫(yī)院的CRKP菌株MLST構(gòu)成情況[株(%)]

3 討論

本項目收集來自中國西南地區(qū)3所三級甲等醫(yī)院臨床標本分離的159株CRKP，檢測CRKP菌株的耐藥性、攜帶的耐藥基因及MLST，結(jié)合患者臨床特征、實驗室檢查和轉(zhuǎn)歸，分析中國西南地區(qū)流行的CRKP菌株分子流行病學特征，研究結(jié)果是對國內(nèi)CRKP菌株多中心流行病學調(diào)查的有力補充。

該項目中CRKP感染的死亡患者主要來自血流感染(66.7%)。既往薈萃分析和系統(tǒng)回顧分析表明，CRKP感染病死率在北美、南美、歐洲和亞洲分別為33.24%、46.71%、50.06%、44.82%，其中血流感染病死率和入住ICU患者的病死率較高，分別為54.30%、48.9%[14]。首先，本項目大多數(shù)血流感染患者在CRKP培養(yǎng)陽性前接受了深靜脈置管和氣管插管/機械通氣等侵入性操作。國內(nèi)一項報道收集了來自上海地區(qū)的100株CRKP，發(fā)現(xiàn)有創(chuàng)機械通氣會導致更高的CRKP感染率[15]。其次本研究中全部血流感染患者在培養(yǎng)出CRKP前接受了多種抗菌藥物治療，81.8%的患者接觸了第三/四代頭孢菌素或碳青霉烯類抗生素。住院治療和累積抗菌藥物使用史，尤其是既往使用β-內(nèi)酰胺類和碳青霉烯類抗生素被認為是與CRE感染相關(guān)的獨立危險因素[16-17]。盡管從傷口分泌物分離出CRKP的患者實施氣管插管/氣管造瘺、使用第三/四代頭孢菌素/碳青霉酶烯類和外周血白細胞升高的比率較高，但這部分患者大多數(shù)為外傷和外科手術(shù)后患者，在外科主要疾病得到控制后，并沒有導致較差的預(yù)后。本研究中未觀察到尿路感染患者的死亡，盡管我國另外14個省三級甲等醫(yī)院的數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)CRKP尿路感染的病死率高達30.3%[9]，但是從全球流行病學數(shù)據(jù)來看，常常與高病死率風險相關(guān)的是CRKP導致的血流感染，尿路感染未顯示出過高的病死率[18]。

本研究提示產(chǎn)碳青霉烯酶是中國西南地區(qū)CRKP耐藥的重要原因，KPC-2是該地區(qū)最流行的耐藥基因。CRKP攜帶的碳青霉烯酶基因具有地域差異，如我國陜西省分離的76株CRE攜帶率最高的基因是NDM(97%)[5]，國內(nèi)另兩項研究也分別發(fā)現(xiàn)在湖南和重慶地區(qū)流行的CRKP也是以攜帶NDM為主[9, 19]。除了產(chǎn)碳青霉烯酶以外，超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)和/或AmpC頭孢菌素酶(AmpC)同時兼具膜通透性的改變也會使肺炎克雷伯菌對碳青霉烯類抗生素耐藥[20]。但產(chǎn)碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌與非產(chǎn)碳青霉烯酶的菌株相比具有更高的毒力，對美羅培南的MIC更高，14天病死率也有顯著上升[21]，是CRKP最主要的耐藥機制。目前認為在中國出現(xiàn)新的CRKP菌株主要途徑是現(xiàn)有耐藥菌株的克隆傳播和特定動力元件的傳遞，提示未來控制CRKP的策略應(yīng)該集中于抑制關(guān)鍵耐藥菌株中碳青霉烯酶編碼基因的傳遞[9]。

本研究中所有CRKP均為MDRO，對慶大霉素和阿米卡星的耐藥率分別達到100%、81.1%，對左氧氟沙星耐藥率為85.5%，高于國外和國內(nèi)其他省份報道的耐藥率[22-23]。本研究中大多數(shù)菌株(86.8%)攜帶KPC-2基因，國內(nèi)一項新生兒CRKP醫(yī)院感染暴發(fā)回顧性研究[24]發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)KPC-2的CRKP菌株對部分抗菌藥物的MIC值比產(chǎn)NDM-1的菌株更高。另外，本項目中一半以上的患者在65歲以上，且來自ICU，病情重，既往也有多次使用抗菌藥物的病史。目前對CRKP的治療仍然非常棘手，體外藥敏試驗并不能完全反映CRKP在體內(nèi)對藥物的治療反應(yīng)。即使對阿米卡星和多粘菌素敏感的CRKP感染患者，腎毒性仍然是臨床醫(yī)生需要重視的問題[25]。對于CRKP血流感染的患者，接受以高劑量碳青霉烯類抗生素為基礎(chǔ)的聯(lián)合治療，似乎能帶來更好的臨床收益[26]。也有報道新型抗菌藥物如頭孢他啶/阿維巴坦的使用可能會與更好的臨床預(yù)后和生存率有關(guān)[23]。

本研究所收集的CRKP菌株在遺傳上相對保守，大多數(shù)屬于ST11型(64.2%)，與國內(nèi)CRKP的主流克隆型一致[9]，但是3所醫(yī)院的序列分型構(gòu)成比仍然有差異。ST244分型的菌株沒有在位于貴陽的2所醫(yī)院檢出，全部來源于遵義醫(yī)科大學附屬醫(yī)院。歐美國家主要流行的CRKP是ST258型，與國內(nèi)流行的ST11同屬于克隆復(fù)合體258 (clonal complex，CC)，主要與KPC型和NDM型碳青霉烯酶流行相關(guān)[27-28]。本課題組在既往研究中比較了37株ST11型及非ST11型CRKP菌株在患者年齡、性別、感染途徑、抗菌藥物使用情況等，雖然未發(fā)現(xiàn)有統(tǒng)計學差異[29]，但是CRKP分離菌株的分子生物學分型對CRKP傳染現(xiàn)狀監(jiān)測、傳染源追蹤、傳播途徑調(diào)查和暴發(fā)識別仍具有重要意義。

本研究的不足之處是住院患者CRKP感染率的信息缺失。但是可以明確的是，中國西南地區(qū)流行的CRKP菌株耐藥性強，尤其血流感染患者預(yù)后差，病死率高，迫切需要加強感染控制措施和提高預(yù)防意識，這將對中國西南地區(qū)臨床控制CRKP的傳播和感染具有重要意義。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。