程 赟，包玉花

(江蘇省腫瘤醫(yī)院,江蘇 南京 210000)

奧沙利鉑作為第3代鉑類(lèi)抗腫瘤化療藥物，臨床療效較順鉑和卡鉑更為突出，且具有毒副作用更少、抗癌譜更廣的優(yōu)勢(shì)，在肝癌、結(jié)腸癌等消化系統(tǒng)腫瘤的輔助和姑息治療中占據(jù)主要地位[1]。然而，奧沙利鉑外周神經(jīng)毒性(Oxaliplatin-induced neurotoxicity, OXIN)發(fā)生率高達(dá)85%～95%，且具有劑量相關(guān)性，常使化療方案被迫更換至二線而影響患者生存[2]。由于其發(fā)生機(jī)制尚未明晰，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)針對(duì)OXIN尚無(wú)公認(rèn)的有效藥物，目前臨床主要以抗氧化、提高疼痛閾值、營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)等作為治療思路[3]。在減輕化療不良反應(yīng)、緩解癥狀和延長(zhǎng)患者生存期等方面，中醫(yī)藥具有其特色優(yōu)勢(shì)。中醫(yī)理論中，OXIN屬于“痹證”范疇，以寒凝血瘀、氣血虧虛為病機(jī)特點(diǎn)，溫經(jīng)通脈法治以溫經(jīng)散寒、養(yǎng)血通脈、活血化瘀，臨床應(yīng)用可有效防治OXIN，緩解患者癥狀，但其作用機(jī)制不明。近年研究發(fā)現(xiàn)，奧沙利鉑可通過(guò)增加瞬時(shí)受體電位(TRP)通道的敏化作用引發(fā)OXIN，其相關(guān)拮抗劑可預(yù)防OXIN所致的炎癥和痛覺(jué)過(guò)敏，以TRPA1和TRPM8為主的5種TRP成為治療OXIN的新靶點(diǎn)[4-5]。本實(shí)驗(yàn)采用奧沙利鉑腹腔注射建立OXIN大鼠模型，以不同劑量溫經(jīng)通脈方灌胃干預(yù)，探討其對(duì)OXIN大鼠背根神經(jīng)節(jié)中TRP通道的影響，為其防治OXIN提供實(shí)驗(yàn)理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雄性Wistar大鼠60只，體重(180±20)g，由南京醫(yī)科大學(xué)提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SYXK(蘇)2021-0065。于相對(duì)恒溫(22±2)℃、恒濕(濕度75%)的SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房中飼養(yǎng)，室內(nèi)保持12 h照明與黑暗交替。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容經(jīng)江蘇省腫瘤醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審核通過(guò)(20210527015)。

1.2實(shí)驗(yàn)藥物及試劑 溫經(jīng)通脈法藥物組方：當(dāng)歸12 g、黃芪9 g、桂枝9 g、白芍9 g、川芎6 g、細(xì)辛3 g、大棗 9 g、通草6 g、生甘草6 g，換算大鼠灌胃等效劑量為6.21 g/kg，以此作為低劑量，高劑量為12.42 g/kg；奧沙利鉑購(gòu)自江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，用5%葡萄糖溶解為終濃度1 mg/mL的溶液，置于4 ℃冰箱待用；甲鈷胺注射液購(gòu)自海南斯達(dá)制藥有限公司。DMEM/F12 基礎(chǔ)培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶購(gòu)自Gibco公司；神經(jīng)元特異性烯醇化物酶(NSE)抗體、FITC熒光標(biāo)記IgG購(gòu)自Sigma 公司，Hochest 33342染料購(gòu)自Biosharp公司；TRPA1、TRPM8、TRPV1、TRPV2、TRPV4一抗購(gòu)自Abcam公司；RT-PCR試劑盒購(gòu)自ABI公司，引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司提供。

1.3實(shí)驗(yàn)方法 60只Wistar大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，按體重隨機(jī)分為空白組、模型組、甲鈷胺組、溫經(jīng)通脈低劑量組、溫經(jīng)通脈高劑量組，每組10只。模型組、甲鈷胺組及溫經(jīng)通脈低、高劑量組大鼠均給予奧沙利鉑4 mg/kg腹腔注射，每周的前2 d每天注射1次，連續(xù)注射4周，空白組大鼠給予等體積5%葡萄糖溶液腹腔注射。實(shí)驗(yàn)期間，甲鈷胺組同時(shí)給予甲鈷胺注射液0.135 mg/kg腹腔注射，2次/周(每周的前2 d)，連續(xù)4周；溫經(jīng)通脈低、高劑量組分別給予溫經(jīng)通脈湯劑6.21 g/kg、12.42 g/kg灌胃，1次/d，連續(xù)4周。

1.4觀察指標(biāo)

1.4.1大鼠一般情況及體重 實(shí)驗(yàn)期間每日觀察各組大鼠飲食飲水、大小便、活動(dòng)等情況，測(cè)定各組大鼠實(shí)驗(yàn)前及實(shí)驗(yàn)第7,14,21,28天的體重。

1.4.2大鼠機(jī)械性縮足閾值(MWT) 采用動(dòng)態(tài)足底觸覺(jué)儀分別于實(shí)驗(yàn)前及實(shí)驗(yàn)第7,14,21,28天測(cè)定各組大鼠MWT：將大鼠單獨(dú)放置于有金屬網(wǎng)格的透明測(cè)試籠，適應(yīng)15 min待大鼠探究活動(dòng)消失后，使用Von Frey纖維細(xì)絲刺激大鼠后肢雙足足底中心，刺激壓力從2 g開(kāi)始逐漸增加，以200 g作為切斷壓力，大鼠出現(xiàn)抬足、舔足等動(dòng)作為有反應(yīng)，每只重復(fù)測(cè)量5次，每次刺激間隔5 min，5次中有3次及以上出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)則為有機(jī)械性痛敏，取測(cè)定力度的平均值即為大鼠MWT。

1.4.3大鼠背根神經(jīng)節(jié)中TRPA1、TRPM8陽(yáng)性表達(dá)情況 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后各組隨機(jī)選5只大鼠，經(jīng)腹腔注射麻醉后采用10%福爾馬林溶液行腹主動(dòng)脈灌注，大鼠頸部僵硬后取L4～5段背根神經(jīng)節(jié)，于10%福爾馬林溶液中固定48 h，經(jīng)乙醇脫水，二甲苯透明后制備5 μm石蠟切片。切片進(jìn)行脫蠟，二甲苯透明，梯度酒精脫水，0.3%過(guò)氧化氫孵育20 min，再經(jīng)抗原熱修復(fù)，BSA封閉20 min，一抗4 ℃孵育過(guò)夜，二抗37 ℃孵育20 min，SABC 37 ℃孵育20 min，DAB顯色，倒置光學(xué)顯微鏡于400倍下觀察拍照。TRPA1和TRPM8陽(yáng)性表達(dá)分布于胞質(zhì)，呈棕黃色，采用Image J軟件隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)TRPA1和TRPM8陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量，取平均值。

1.4.4大鼠背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞提取及鑒定 各組剩余5只大鼠同法取出L4～5段背根神經(jīng)節(jié)后，放入含有1%青鏈霉素的PBS 緩沖液中，清洗表面血漬和多余組織后，用顯微鑷逐一摘取椎間孔中的神經(jīng)節(jié)，放入預(yù)冷的DMEM/F12 常規(guī)培養(yǎng)基中，更換培養(yǎng)基，洗滌3遍后收集放入離心管，于1 400 r/min下離心5 min，小心棄去上清，加入0.25%胰蛋白酶于水浴鍋中37 ℃消化20 min，每隔5 min晃動(dòng)1次，隨后于冰上輕柔吹打20 min，滴加胎牛血清以終止消化，1 400 r/min下離心5 min，棄去消化液后加入DMEM/F 12培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液，以2×105個(gè)/mL密度接種，于5%CO2、37 ℃恒溫的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取空白組大鼠背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，采用NSE免疫熒光法鑒定細(xì)胞：取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞接種于事先放入無(wú)菌蓋玻片的6孔板中，培養(yǎng)至貼壁后按NSE試劑盒步驟避光染色，同時(shí)加入Hochest 33342 熒光染料染細(xì)胞核，甘油封片后于熒光顯微鏡下觀察染色情況，NSE標(biāo)記的細(xì)胞發(fā)綠色熒光，細(xì)胞核發(fā)藍(lán)色熒光。

1.4.5大鼠背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中TRP通道蛋白表達(dá)檢測(cè) 取各組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，接種于6孔板，培養(yǎng)48 h后，加入裂解液于冰上裂解，提取細(xì)胞總蛋白，BCA 法測(cè)定蛋白濃度，蛋白樣本于水浴鍋中煮沸變性，經(jīng)蛋白上樣，凝膠電泳，PVDF轉(zhuǎn)膜，5%封閉液封閉后，滴加一抗于4 ℃冰箱過(guò)夜，TBST 清洗，加入二抗，室溫孵育2 h，洗膜，滴加ECL，化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)曝光，以GAPDH為內(nèi)參，用Image J 軟件分析條帶灰度值，計(jì)算TRPA1、TRPM8、TRPV1、TRPV2、TRPV4蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.4.6大鼠背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中TRP通道m(xù)RNA表達(dá)檢測(cè) 取各組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，接種于6孔板，培養(yǎng)48 h后提取細(xì)胞總RNA，紫外分光光度儀測(cè)定總RNA 濃度，將RNA反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，以cDNA為模板，按RT-PCR試劑盒步驟檢測(cè)TRPA1、TRPM8、TRPV1、TRPV2、TRPV4 mRNA表達(dá)情況。反應(yīng)體系為20 μL，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸15 s，共40個(gè)循環(huán)。以 GAPDH 作為內(nèi)參，mRNA相對(duì)表達(dá)量采用2ΔΔCt方法計(jì)算。TRP通道各基因引物序列見(jiàn)表1。

表1 瞬時(shí)受體電位(TRP)通道各基因引物序列

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠一般情況及體重比較 大鼠在注射奧沙利鉑后出現(xiàn)行動(dòng)遲緩、腹瀉、進(jìn)食減少、舔足、抬足活動(dòng)等現(xiàn)象；各藥物干預(yù)組灌胃后，大鼠行動(dòng)較前活躍，進(jìn)食、腹瀉等情況逐漸恢復(fù)。模型組大鼠實(shí)驗(yàn)第14，21,28天的體重均明顯低于同期空白組(P均<0.05)；溫經(jīng)通脈低、高劑量組和甲鈷胺組大鼠實(shí)驗(yàn)第21,28天的體重均明顯高于同期模型組(P均<0.05)，各藥物組間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 空白組和奧沙利鉑外周神經(jīng)毒性造模各組大鼠體重比較

2.2各組大鼠MWT比較 空白組大鼠MWT較穩(wěn)定，模型組大鼠實(shí)驗(yàn)第14,21,28天的MWT均明顯低于同期空白組(P均<0.05)；溫經(jīng)通脈低、高劑量組和甲鈷胺組大鼠相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的MWT均明顯高于同期模型組(P均<0.05)，各藥物組間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見(jiàn)表3。

表3 空白組和奧沙利鉑外周神經(jīng)毒性造模各組大鼠機(jī)械性縮足閾值比較

2.3各組大鼠背根神經(jīng)節(jié)TRPA1、TRPM8表達(dá)情況 免疫組化檢測(cè)顯示，空白組大鼠背根神經(jīng)節(jié)中僅見(jiàn)少量TRPA1、TRPM8陽(yáng)性表達(dá)；模型組大鼠背根神經(jīng)節(jié)中TRPA1、TRPM8陽(yáng)性表達(dá)增多，陽(yáng)性表達(dá)量均明顯高于空白組(P均<0.05)；溫經(jīng)通脈低、高劑量組和甲鈷胺組大鼠背根神經(jīng)節(jié)中TRPA1、TRPM8陽(yáng)性表達(dá)減少，陽(yáng)性表達(dá)量均明顯低于模型組(P均<0.05)。見(jiàn)圖1及圖2。

圖1 空白組和奧沙利鉑外周神經(jīng)毒性造模各組大鼠背根神經(jīng)節(jié)中TRPA1、TRPM8陽(yáng)性表達(dá)情況(免疫組化染色，×400)

圖2 空白組和奧沙利鉑外周神經(jīng)毒性造模各組大鼠背根神經(jīng)節(jié)中TRPA1、TRPM8陽(yáng)性表達(dá)量

2.4大鼠背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞鑒定情況 NSE免疫熒光染色顯示，NSE在背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞胞漿中表達(dá)，染色呈綠色熒光，Hochest染在細(xì)胞核中呈現(xiàn)藍(lán)色熒光，兩者融合后，計(jì)算出背根神經(jīng)節(jié)純度大于90%。見(jiàn)圖3。

圖3 免疫熒光染色鑒定大鼠背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(×400)

2.5各組大鼠背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中TRP通道相關(guān)蛋白表達(dá)情況 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，模型組大鼠背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中TRPA1、TRPM8、TRPV1、TRPV2、TRPV4蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯高于空白組(P均<0.05)，溫經(jīng)通脈低、高劑量組和甲鈷胺組大鼠各指標(biāo)均明顯低于模型組(P均<0.05)，各藥物組間各指標(biāo)比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見(jiàn)圖4。

圖4 空白組和奧沙利鉑外周神經(jīng)毒性造模各組大鼠背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中TRP通道相關(guān)蛋白表達(dá)情況

2.6各組大鼠背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞TRP通道相關(guān)mRNA表達(dá)情況 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，模型組大鼠背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中TRPA1、TRPM8、TRPV1、TRPV2、TRPV4 mRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯高于空白組(P均<0.05)，溫經(jīng)通脈低、高劑量組和甲鈷胺組大鼠各指標(biāo)均明顯低于模型組(P均<0.05)，各藥物組間各指標(biāo)比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見(jiàn)表4。

表4 空白組和奧沙利鉑外周神經(jīng)毒性造模各組大鼠背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中TRP通道相關(guān)mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

3 討 論

奧沙利鉑作為惡性腫瘤一線化療中的關(guān)鍵藥物，所引起的周?chē)窠?jīng)病變也愈加受到關(guān)注。奧沙利鉑致神經(jīng)毒性分為急性和慢性?xún)煞N形式，急性多為短暫、可逆的肌肉痙攣，感覺(jué)遲鈍或異常；慢性則為持續(xù)的肢端對(duì)稱(chēng)性麻木，“手套、襪套樣分布”，感覺(jué)障礙，肌力減弱，可伴有肌肉痛性痙攣、萎縮，自主神經(jīng)損傷等，常導(dǎo)致治療中斷，影響患者生活質(zhì)量和臨床獲益[6-7]。國(guó)內(nèi)外針對(duì)此類(lèi)不良反應(yīng)已開(kāi)展相關(guān)研究，但目前尚無(wú)明確有效藥物。近年來(lái)，中醫(yī)藥的神經(jīng)保護(hù)作用逐漸受到許多研究者的關(guān)注，應(yīng)用中藥復(fù)方可有效緩解化療患者外周神經(jīng)毒性，縮短癥狀持續(xù)時(shí)間，顯示出中醫(yī)療法的特色與優(yōu)勢(shì)[8-9]。

結(jié)合OXIN手足麻木或疼痛，遇冷加重的臨床特征，可將其歸屬于中醫(yī)學(xué)“痹證”范疇。疾病本質(zhì)為本虛標(biāo)實(shí)，以氣血虧虛為本，寒凝血瘀為標(biāo)。惡性腫瘤患者機(jī)體功能較為低下，化療后氣血受阻，四末不榮，而致手足末端麻木、感覺(jué)異常；正氣虛敗，寒邪乘虛侵入則加重，更有血虛而筋肉不榮，以致肢體功能障礙[10]。溫經(jīng)通脈法方藥組成中當(dāng)歸性甘溫而入肝，其氣輕而辛，既能溫補(bǔ)肝經(jīng)，養(yǎng)血和血，又可行血通經(jīng)，使行中有補(bǔ)，補(bǔ)而不滯；黃芪甘溫補(bǔ)益脾肺，固體表之衛(wèi)氣；桂枝辛溫通經(jīng)，散寒通痹；白芍養(yǎng)血和營(yíng)，和血通經(jīng)，既助當(dāng)歸調(diào)補(bǔ)營(yíng)血，又與桂枝相和以調(diào)和營(yíng)衛(wèi)；川芎祛風(fēng)活血，行氣止痛；細(xì)辛辛溫散寒，通達(dá)表里，內(nèi)溫臟而外溫經(jīng)，與桂枝同用以溫陽(yáng)除寒邪，暢通血脈；通草通經(jīng)脈而暢血行；大棗、甘草健脾益氣，調(diào)和諸藥，重用大棗以助黃芪、當(dāng)歸、白芍益氣補(bǔ)血之效，又可防桂枝、細(xì)辛燥烈傷及陰血；全方合用，使陰血充養(yǎng)，經(jīng)脈通暢，手足溫而客寒除。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)奧沙利鉑腹腔注射建立OXIN大鼠模型，觀察了溫經(jīng)通脈方灌胃干預(yù)的作用。結(jié)果顯示，大鼠給予奧沙利鉑后體重明顯下降，出現(xiàn)腹瀉等癥狀，MWT降低，而溫經(jīng)通脈法可增加大鼠體重及改善腹瀉癥狀，提高大鼠MWT。提示溫經(jīng)通脈法可促進(jìn)OXIN大鼠消化功能恢復(fù)和體重的增加，能有效提高OXIN大鼠的疼痛閾值。現(xiàn)代研究表明，Ca2+的超負(fù)荷在慢性O(shè)XIN發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮重要作用，作為鈣離子滲透性的TRP通道成為OXIN治療的新靶點(diǎn)[11]。其中3種熱敏TRP通道(TRPV1、TRPV2、TRPV4)和2種冷敏TRP通道(TRPA1、TRPM8)已確定在化療所引起的神經(jīng)性疼痛背根神經(jīng)節(jié)中呈現(xiàn)高表達(dá)[12-13]。TRPA1和TRPM8可作為“冷傳感器”導(dǎo)致機(jī)械痛增加，是誘發(fā)OXIN的主要因素[14]。相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究表明，奧沙利鉑可上調(diào)大鼠背根神經(jīng)節(jié)中TRPA1和TRPM8的表達(dá)水平，通過(guò)敲除TRPA1和TRPM8基因或應(yīng)用拮抗劑可減輕或消除OXIN所致的冷痛和痛覺(jué)過(guò)敏[15-17]；在大鼠背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元中，奧沙利鉑可通過(guò)激活TRPV1破壞神經(jīng)元結(jié)構(gòu)，從而增加外周神經(jīng)敏感性[18]。此外，TRPV1和TRPA1在背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元中有30%～50%共定位，二者在背根神經(jīng)節(jié)通道的激活中發(fā)揮協(xié)同作用[19]。高溫所誘導(dǎo)的外周神經(jīng)元痛覺(jué)敏感中可見(jiàn)TRPV2 蛋白表達(dá)增多，在順鉑作用的背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元中亦可見(jiàn)TRPV2 表達(dá)升高[20-21]。本實(shí)驗(yàn)免疫組化結(jié)果顯示，OXIN大鼠背根神經(jīng)節(jié)中可見(jiàn)TRPA1和TRPM8陽(yáng)性表達(dá)明顯增多，溫經(jīng)通脈法干預(yù)后二者陽(yáng)性表達(dá)明顯減少，提示溫經(jīng)通脈法可通過(guò)抑制TRPA1和TRPM8通道減輕OXIN。進(jìn)一步檢測(cè)大鼠背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中TRP通道的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，OXIN大鼠背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中TRPA1、TRPM8、TRPV1、TRPV2、TRPV4蛋白和mRNA表達(dá)均明顯增加，溫經(jīng)通脈法干預(yù)后均明顯降低，表明溫經(jīng)通脈法可抑制OXIN大鼠背根神經(jīng)節(jié)中TRP通道的激活。綜上所述，溫經(jīng)通脈法可明顯提高OXIN大鼠疼痛閾值，改善大鼠行為學(xué)改變，其作用機(jī)制可能與抑制大鼠背根神經(jīng)節(jié)及背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元中TRP通道的激活相關(guān)。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。