李磊 吳東良閻玥 史琦 司東旭李友林**

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029；2.中日友好醫(yī)院國(guó)家中醫(yī)藥管理局重點(diǎn)研究室,中醫(yī)藥防治過(guò)敏性疾病北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100029)

濕疹是一種受遺傳因素和環(huán)境因素影響的疾病，患病率日漸增長(zhǎng)，其病理機(jī)制涉及全身以及皮膚的免疫與表皮功能障礙[1]，多表現(xiàn)為皮損局部浸潤(rùn)肥厚、劇烈瘙癢、易反復(fù)發(fā)作等癥狀。中醫(yī)將濕疹歸屬于濕瘡范疇，認(rèn)為其發(fā)病與多種病因相關(guān)，稟賦不足，腠理不固而受外邪侵襲，加之飲食不節(jié)脾胃內(nèi)傷，內(nèi)外相合，精血不足，化風(fēng)化燥，繼而出現(xiàn)于機(jī)體不同部位，根據(jù)皮損形態(tài)不同，名稱(chēng)各異，如浸淫瘡、粟瘡、腎囊風(fēng)、四彎風(fēng)等。臨床上徐長(zhǎng)卿[2]、紫草[3]、地膚子[4]常用于濕疹的內(nèi)治法和外治法中，現(xiàn)代研究提示，三者均對(duì)濕疹具有抗炎、抗過(guò)敏、免疫調(diào)節(jié)等作用[5-7]，這與三者清熱祛風(fēng)止癢的傳統(tǒng)功效相吻合。但三者治療濕疹的有效成分、作用靶點(diǎn)及信號(hào)通路等研究尚不充分，有學(xué)者提出從生物網(wǎng)絡(luò)角度研究中藥及復(fù)方化學(xué)成分調(diào)控機(jī)體復(fù)雜系統(tǒng)的作用機(jī)制[8-9]。因此，本文借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)，從中藥成分-靶點(diǎn)-通路角度探討徐長(zhǎng)卿-紫草-地膚子治療濕疹可能的作用機(jī)制，以供參考。

1 材料與方法

1.1徐長(zhǎng)卿、紫草、地膚子活性成分的挖掘與篩選 中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)(TCMSP，https://tcmspw.com/tcmsp.php)是一個(gè)包含中藥成分信息及對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)信息的中草藥系統(tǒng)藥理平臺(tái)[10]。它包括中藥成分吸收、分布、代謝、排泄的關(guān)鍵參數(shù)，如口服生物利用度(OB)、藥物相似性(DL)、血腦屏障透過(guò)率等。本研究應(yīng)用TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)，挖掘徐長(zhǎng)卿、紫草、地膚子的所有成分，并得到各成分的關(guān)鍵參數(shù)，以O(shè)B≥30%，DL≥0.18作為篩選活性成分的依據(jù)。

1.2徐長(zhǎng)卿、紫草、地膚子活性成分作用靶點(diǎn)的預(yù)測(cè) 利用TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)獲取徐長(zhǎng)卿、紫草、地膚子中篩選出的每個(gè)活性成分對(duì)應(yīng)的潛在靶點(diǎn)信息，然后利用UniProt(https://www.uniprot.org)數(shù)據(jù)庫(kù)中的UniProtKB搜索功能對(duì)不同來(lái)源的靶點(diǎn)進(jìn)行檢索，限定研究物種為Homo sapiens，得到所有靶點(diǎn)的基因名，將用于后續(xù)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析。

1.3濕疹靶點(diǎn)的挖掘 以“eczema”為關(guān)鍵詞在以下4個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，獲取濕疹靶點(diǎn)的有效信息：①DrugBank數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.drugbank.ca，最后更新：2020年7月2日)；②OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.omim.org/，最后更新：2020年7月28日)；③GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.genecards.org，Version 5.0)；④TTD數(shù)據(jù)庫(kù)(http://db.idrblab.net/ttd/，最后更新：2020年6月1日)。

1.4核心靶點(diǎn)篩選 利用Venny 2.1(http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)在線(xiàn)工具繪制徐長(zhǎng)卿、紫草、地膚子有效活性成分靶點(diǎn)和濕疹靶點(diǎn)的韋恩圖，從而得到交集靶點(diǎn)。

1.5蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系分析 蛋白質(zhì)功能的執(zhí)行需要借助不同蛋白質(zhì)之間的相互作用來(lái)實(shí)現(xiàn)，String (https://string-db.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)囊括了預(yù)測(cè)和已知的蛋白質(zhì)相互作用的數(shù)據(jù)庫(kù)[11]，故將篩選得到的徐長(zhǎng)卿-紫草-地膚子治療濕疹的交集靶點(diǎn)蛋白以基因名的形式上傳到該數(shù)據(jù)庫(kù)，研究物種設(shè)置為Homo sapiens，進(jìn)行蛋白與蛋白相互作用分析，得到蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖。

1.6KEGG信號(hào)通路富集分析 利用DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫(kù)(https://david.ncifcrf.gov)對(duì)交集靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行KEGG信號(hào)通路富集分析和GO通路富集分析。在DAVID下屬Functional Annotation工具中的列表中粘貼目標(biāo)基因，類(lèi)型選擇Gene List，Select Identifier選擇official gene symbol，物種和背景均選擇Homo sapiens，提交后獲取KEGG數(shù)據(jù)及GO數(shù)據(jù)。通過(guò)后續(xù)從生物過(guò)程及信號(hào)通路程角度探討徐長(zhǎng)卿-紫草-地膚子治療濕疹可能的作用機(jī)制，繼而繪制KEGG通路富集氣泡圖和GO細(xì)胞組分、分子功能、生物過(guò)程三合一圖。

2 結(jié)果

2.1徐長(zhǎng)卿、紫草、地膚子活性成分 中藥常以口服方式給藥，故以O(shè)B、DL值篩選，共得到20個(gè)化合物，徐長(zhǎng)卿、紫草、地膚子各包括6、12、2個(gè)活性成分，徐長(zhǎng)卿包含cynatratoside B、cynapanoside C、tomentogenin等成分，紫草包含acetylshikonin、Isoarnebin 4、lithospermidin A等成分，地膚子包含11,14-eicosadienoic acid、Stigmasterol(表1)。

表1 徐長(zhǎng)卿、紫草、地膚子活性成分

2.2濕疹活性成分的靶點(diǎn)預(yù)測(cè)及濕疹靶點(diǎn)挖掘 檢索TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)得到徐長(zhǎng)卿、紫草、地膚子活性成分的靶點(diǎn)共49個(gè)。然后，通過(guò)主題詞檢索DrugBank、GeneCards、OMIM、TTD四個(gè)在線(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)共得到1702個(gè)濕疹的相關(guān)靶點(diǎn)。將上述兩個(gè)數(shù)據(jù)集取交集得到19個(gè)交集靶點(diǎn)(圖1)，主要包括PGR、PTGS1、PTGS2、ESR1、AR、NR3C1等(表2)，用于后續(xù)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析。

2.3活性成分-靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析 利用Cytoscape3.7.1軟件構(gòu)建活性成分-靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)，得到了一個(gè)包含30個(gè)點(diǎn)和36條邊的網(wǎng)絡(luò)(圖2)。圖中藍(lán)色部分XCQ、ZC、DFZ分別代表徐長(zhǎng)卿、紫草、地膚子，綠色部分代表有效成分MOL ID，紫色部分代表靶點(diǎn)名稱(chēng)。依據(jù)Degree值由大到小排名，分別為13、5、4、4、3、3、2、2，對(duì)應(yīng)的有效成分依次是豆甾醇(MOL000449)、毛紅厚殼內(nèi)酯A(MOL005619)、谷甾醇(MOL000359)、1-甲氧基乙酰紫草素(MOL007714)、[(1R)-1-(5,8-dihydroxy-1,4-dioxo-2-naphthyl)-4-methyl-pent-3-enyl](MOL007715)、亞油酸乙酯(MOL001494)、徐長(zhǎng)卿苷C(MOL005625)、cynapanoside CEthyl oleate(MOL002883)。

圖1 靶點(diǎn)基因篩選圖

2.4蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系分析 將半徐長(zhǎng)卿、紫草、地膚子治療濕疹相關(guān)的19個(gè)交集靶點(diǎn)輸入String數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行分析，去除沒(méi)有連接的靶點(diǎn)蛋白，得到蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖(圖3)。結(jié)果顯示，該網(wǎng)絡(luò)圖包含17個(gè)點(diǎn)，34個(gè)邊，平均degree值為3.58，平均局部聚類(lèi)系數(shù)0.663，P<0.01。圖中各靶點(diǎn)之間不同顏色的線(xiàn)代表不同的證據(jù)，主要是綠色代表相鄰基因，紅色代表融合基因，藍(lán)色代表共現(xiàn)基因，連接線(xiàn)越粗，蛋白之間相互作用越強(qiáng)。

2.5KEGG 信號(hào)通路和GO富集分析 使用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)徐長(zhǎng)卿、紫草、地膚子治療濕疹所涉及的交集靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行KEGG信號(hào)通路富集分析，最終確定10條通路，包括Phenylalanine metabolism、Arachidonic acid metabolism、Serotonergic synapse等(表3)。同時(shí)，利用KEGG富集得到的數(shù)據(jù)，繪制富集氣泡圖(圖4)。

表2 徐長(zhǎng)卿、紫草、地膚子治療濕疹相關(guān)靶點(diǎn)

圖2 徐長(zhǎng)卿、紫草、地膚子治療濕疹藥效成分-靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

圖3 徐長(zhǎng)卿-紫草-地膚子與治療濕疹藥效靶點(diǎn)蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

表3 KEGG 通路富集

圖4 KEGG 通路富集氣泡圖

GO富集分析：Biological process分析主要包括多巴胺分解代謝過(guò)程、對(duì)寒冷的反應(yīng)、平滑肌收縮的正調(diào)控、褐色脂肪細(xì)胞分化、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。Cellular component分析主要包括質(zhì)膜。Molecular function分析主要包括類(lèi)固醇激素受體活性、類(lèi)固醇結(jié)合、酶結(jié)合、前列腺素-過(guò)氧化物合酶活性、ATP酶結(jié)合、藥物結(jié)合、去甲腎上腺素結(jié)合、受體結(jié)合、鋅離子結(jié)合、腎上腺素結(jié)合、伯胺氧化酶活性(圖5)。

圖5 GO分析：富集BP、CC、MF

3 討論

濕疹是由多種內(nèi)外因素，如食物、吸入物、內(nèi)分泌及代謝改變等相互作用導(dǎo)致的一種具有明顯滲出傾向的急慢性皮膚炎性反應(yīng)[12]，其病理機(jī)制復(fù)雜，現(xiàn)代研究認(rèn)為多與遺傳易感性、免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)失調(diào)、皮膚微生物群改變有關(guān)[13]，常與支氣管哮喘、過(guò)敏性鼻炎合并發(fā)生[14-16]。中醫(yī)認(rèn)為，濕疹多因稟賦不耐，脾虛濕戀，氣血運(yùn)行不暢，膚失所養(yǎng)而發(fā)病，臨床多于辨治方中配伍徐長(zhǎng)卿、紫草、地膚子等。徐長(zhǎng)卿辛溫，歸肝、胃經(jīng)，在《神農(nóng)本草經(jīng)》中被列為上品，多用于濕瘡[17]，濕疹久發(fā)難愈，衛(wèi)氣已虛，瘙癢難忍，徐長(zhǎng)卿不僅祛風(fēng)，還能鎮(zhèn)靜和抗過(guò)敏止癢[18]；紫草甘寒，歸心、肝經(jīng)，屬清熱涼血藥，能夠清熱涼血，活血解毒。文獻(xiàn)研究[19]發(fā)現(xiàn)濕疹用藥以此類(lèi)藥最多。《仁齋直指方》中紫草膏及現(xiàn)代紫草油[3,20]用于濕疹效佳，這可能與其抗菌抗炎作用相關(guān)[21]；地膚子苦寒，歸腎、膀胱經(jīng)，擅除皮膚中之風(fēng)邪濕熱，既往研究[22-23]均以本藥為濕疹必用藥，對(duì)頑固性濕疹亦可配伍此藥[24]。為了系統(tǒng)探討徐長(zhǎng)卿、紫草、地膚子治療濕疹的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及潛在生物學(xué)機(jī)制，本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，通過(guò)篩選三種中藥的活性成分，收集濕疹相關(guān)靶點(diǎn)，預(yù)測(cè)分析藥靶關(guān)系及對(duì)應(yīng)通路。

考慮到藥物的相似性及吸收率，應(yīng)用TCMSP平臺(tái)設(shè)置OB≥30%，DL≥0.18的篩選標(biāo)準(zhǔn)，共挖掘到徐長(zhǎng)卿、紫草、地膚子的有效成分分別為6、12、2個(gè)。并在DrugBank、OMIM、GeneCards和TTD數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索到濕疹的有效靶點(diǎn)1 702個(gè)，兩者交集獲得19個(gè)共同靶點(diǎn)。這些治療濕疹靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)的藥效成分組屬于徐長(zhǎng)卿的有3個(gè)，紫草的5個(gè)，地膚子1個(gè)。而所得的治療濕疹的靶點(diǎn)中，徐長(zhǎng)卿的有6個(gè)，紫草的9個(gè)，地膚子12個(gè)。本研究發(fā)現(xiàn)，三味中藥均存在一個(gè)藥效成分對(duì)應(yīng)兩個(gè)或多個(gè)靶點(diǎn)的情況，地膚子的藥效成分僅1個(gè)，但其對(duì)應(yīng)的治療濕疹的靶點(diǎn)卻有12個(gè)，故應(yīng)重視其治療濕疹的作用。通過(guò)String平臺(tái)數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)發(fā)現(xiàn)，ADRB2、NR3C1、PGR、PTGS2等位于網(wǎng)絡(luò)圖的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)處，且這些蛋白之間存在著非單線(xiàn)單向作用的復(fù)雜聯(lián)系，根據(jù)combined_score，排名前五的蛋白組合分別是ESR1-PGR、MAOB-MAOA、AR-NR3C1、ADRB1-ADRB2、ESR1-NR3C1，因此靶點(diǎn)之間的相互作用與調(diào)節(jié)可能是徐長(zhǎng)卿、紫草、地膚子治療濕疹的潛在機(jī)制之一。

借助DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)徐長(zhǎng)卿、紫草、地膚子靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行KEGG信號(hào)通路富集分析發(fā)現(xiàn)10條重要通路，但花生四烯酸代謝信號(hào)通路引起了筆者關(guān)注?；ㄉ南┧崾且环N人體必需的不飽和脂肪酸，當(dāng)受到多種刺激時(shí)，可轉(zhuǎn)變成具有生物活性的代謝產(chǎn)物，如白三烯、前列腺素、血栓素等[25]，這些代謝產(chǎn)物可參與濕疹的發(fā)病[26]。如白三烯既能以效應(yīng)因子和趨化因子身份直接參與炎癥反應(yīng)，還能促進(jìn)γ干擾素與白介素2等細(xì)胞因子的合成、釋放，放大炎癥反應(yīng)[27]。前列腺素可能通過(guò)擴(kuò)張血管及增加血管通透性造成濕疹患者皰疹、紅斑及滲出等表現(xiàn)[28]。在此通路中，PTGS2、PTGS1、LTA4H通過(guò)影響前列腺素和白三烯的生成而調(diào)節(jié)花生四烯酸代謝過(guò)程；通過(guò)GO功能富集分析也發(fā)現(xiàn)，前列腺素-內(nèi)過(guò)氧化物合酶活性通路參與了徐長(zhǎng)卿、紫草、地膚子治療濕疹的過(guò)程，進(jìn)一步佐證了前列腺素在濕疹中的重要作用，以及通過(guò)下調(diào)其生成釋放可能是治療濕疹的一種方法。綜上，可能表明徐長(zhǎng)卿、紫草、地膚子通過(guò)調(diào)控這些酶的生成或釋放以調(diào)節(jié)花生四烯酸代謝，減少炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，干預(yù)濕疹的發(fā)病過(guò)程，從而減輕濕疹癥狀或改善患者的主觀(guān)感受，為病情的發(fā)展變化帶來(lái)一定益處，但仍有待于進(jìn)一步深入研究。

總之，濕疹是一種內(nèi)外因素共同導(dǎo)致的疾病，現(xiàn)存治療手段仍存不足，中藥以其多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的特點(diǎn)在改善濕疹方面顯示一定優(yōu)勢(shì)。本文基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)初探徐長(zhǎng)卿、紫草、地膚子治療濕疹可能的作用機(jī)制，具備一定的合理性，初步展示了中藥治療疾病的整體性和全面性，為相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究做鋪墊，也為研究中醫(yī)藥治療疾病的藥效機(jī)理提供新思路。