李天佑 薛朝金 陳 璐 何 羽 蔡遠(yuǎn)東

貴州省畢節(jié)市市場(chǎng)監(jiān)督管理局檢驗(yàn)檢測(cè)中心，貴州 畢節(jié) 551700

小兒生血糖漿處方由熟地黃、山藥、大棗、硫酸亞鐵組成，具有健脾養(yǎng)胃、補(bǔ)血生津的功效，用于治療小兒營(yíng)養(yǎng)不良性貧血和缺鐵性貧血[1]。熟地黃可補(bǔ)血、滋陰；大棗可益中生血、補(bǔ)脾和營(yíng)、養(yǎng)心安神；山藥可補(bǔ)血生精、養(yǎng)胃益肺。三味藥均具有補(bǔ)血的功效。由于原標(biāo)準(zhǔn)中沒(méi)有薄層色譜鑒別和含量測(cè)定，為更加全面有效控制藥品質(zhì)量，經(jīng)閱讀參考相關(guān)文獻(xiàn)后，對(duì)處方中大棗及山藥進(jìn)行薄層色譜法鑒別，對(duì)熟地黃所含成分毛蕊花糖苷進(jìn)行含量測(cè)定，以為后續(xù)藥品質(zhì)量研究、標(biāo)準(zhǔn)提升及藥品檢驗(yàn)提供一定的參考價(jià)值。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent 1260高效液相色譜儀(包括 Agilent LC工作站，1260 DAD VL檢測(cè)器，自動(dòng)進(jìn)樣器，四元梯度泵，柱溫箱)，PS-G60A型潔康超聲波清洗機(jī)(功率：360W；頻率：40KHz)；ATSmol 1850C型超純水機(jī)(重慶市安特生環(huán)保設(shè)備有限公司)，MSE3.6P-OCE-DM型電子天平(百萬(wàn)分之一)和AY120型電子天平(萬(wàn)分之一)。

1.2 試藥 小兒生血糖漿樣品為某藥品生產(chǎn)企業(yè)生產(chǎn)藥品(批號(hào)為:20190406， 20191103， 20200601)。陰性樣品自制所得(按小兒生血糖漿處方和制法分別制備缺熟地黃、山藥和大棗的陰性樣品)。大棗對(duì)照藥材(批號(hào):121040-201408)、齊墩果酸對(duì)照品(批號(hào):110709-201206)、白樺脂酸對(duì)照品(批號(hào):111802-201001)、山藥對(duì)照藥材(批號(hào):121137-201807)、毛蕊花糖苷對(duì)照品(批號(hào)：111530-201914、95.2%)均由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供。熟地黃、山藥及大棗藥材經(jīng)鑒定均為正品。乙腈為HPLC級(jí)(美國(guó)，Tedia試劑公司)；水為純凈水(娃哈哈)；硫酸亞鐵、乙醚、二氯甲烷、甲醇等均為分析純；硅膠G薄層板為預(yù)制板(青島海洋化工有限公司，批號(hào)：20170216)。

2 方法與結(jié)果

2.1 大棗薄層色譜鑒別 取上述三批樣品各5 mL，分別加乙醚30 mL，超聲處理30 min，置分液漏斗中，取乙醚層，蒸干，殘?jiān)右颐? mL使溶解，作為供試品溶液。取缺大棗陰性樣品5 mL，同法制成陰性對(duì)照溶液。另取大棗對(duì)照藥材2g，加乙醚30 mL，超聲30 min，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)右颐? mL使溶解，作為對(duì)照藥材溶液。再取白樺脂酸對(duì)照品和齊墩果酸對(duì)照品，加乙醚制成各含1 mg/ mL的混合對(duì)照品溶液。照薄層色譜法(2020年版中國(guó)藥典四部通則0502)試驗(yàn)，吸取供試品溶液、對(duì)照藥材溶液及陰性對(duì)照溶液各10 μL、混合對(duì)照品溶液5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以石油醚(60～90 ℃)-乙酸乙酯-冰醋酸(7∶2∶0.5)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，置105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色淸晰。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜和對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn),陰性對(duì)照溶液無(wú)干擾,如圖1 A所示。

2.2 山藥薄層色譜鑒別 取上述三批樣品各15 mL，分別加二氯甲烷50 mL，加熱回流提取1 h，置分液漏斗中，取二氯甲烷層，蒸干，殘?jiān)佣燃淄? mL使溶解，作為供試品溶液。取缺山藥陰性樣品15 mL，同法制成陰性對(duì)照溶液。另取山藥對(duì)照藥材3 g，加二氯甲烷50 mL，加熱回流提取1 h，過(guò)濾，濾液蒸干，殘?jiān)佣燃淄? mL使溶解，作為對(duì)照藥材溶液。照薄層色譜法(2020年版中國(guó)藥典四部通則0502)試驗(yàn)，吸取供試品溶液、對(duì)照藥材溶液及陰性對(duì)照溶液各10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-甲醇-濃氨試液(18∶2∶1)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以10%磷鉬酸乙醇溶液，置105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色淸晰。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn),陰性對(duì)照溶液無(wú)干擾，如圖1B所示。

2.3 毛蕊花糖苷含量測(cè)定

2.3.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 色譜柱為:MedJenBond HPLC Column Camasil C18(250 mm×4.6 mm 5 μm)；以乙腈-0.1%冰醋酸(16∶84)為流動(dòng)相；流速為1 mL· min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)為334 nm；柱溫為35 ℃；進(jìn)樣量為10 μL。理論塔板數(shù)按毛蕊花糖苷峰計(jì)算，應(yīng)不低于5000。

2.3.2 溶液的制備 對(duì)照品溶液的制備：取毛蕊花糖苷，精密稱(chēng)取6.272 mg，置50 mL容量瓶中，加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為備用液。精密量取備用液1 mL，置10 mL容量瓶中，加流動(dòng)相溶液稀釋至刻度，搖勻，即得對(duì)照品溶液。

供試品溶液的制備：精密吸取小兒生血糖漿樣品(批號(hào)為:20200601)5 mL，加甲醇50 mL，水浴加熱回流提取50 min，過(guò)濾，濾液蒸干，殘?jiān)恿鲃?dòng)相溶液溶解，轉(zhuǎn)移至20 mL量瓶中，稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

陰性對(duì)照溶液的制備：取缺熟地黃陰性樣品5 mL，按2.3.2項(xiàng)下供試品溶液的制備方法，制備得陰性對(duì)照溶液。

2.3.3 方法特異性試驗(yàn) 將對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性對(duì)照溶液按照2.3.1項(xiàng)下的色譜條件分別進(jìn)樣分析。結(jié)果如圖2所示，對(duì)照品溶液毛蕊花糖苷成分色譜峰與供試品溶液毛蕊花糖苷成分色譜峰相應(yīng)保留時(shí)間一致，供試品溶液毛蕊花糖苷成分分離度大于1.5，并且陰性對(duì)照溶液無(wú)干擾。

2.3.4 線性關(guān)系的考察 精密量取2.3.2項(xiàng)下的對(duì)照品備用溶液0.2、1.0、2.0、3.0、5.0、7.0 mL，分別置10 mL量瓶中，加流動(dòng)相溶液稀釋至刻度，搖勻，按照2.3.1項(xiàng)下的色譜條件，每份平行進(jìn)樣2次，以平均峰面積(y)為縱坐標(biāo)，以毛蕊花糖苷的質(zhì)量(x)為橫坐標(biāo)進(jìn)行加權(quán)線性回歸，得到線性回歸方程為：y=15075x-4.6136，r=0.9994(n=6)。結(jié)果表明毛蕊花糖苷在2.42～84.91 μg質(zhì)量范圍內(nèi)與峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.3.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取2.3.2項(xiàng)下的對(duì)照品溶液，按照2.3.1項(xiàng)下的色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，得出毛蕊花糖苷峰面積值的RSD值為0.29%(n=6)。結(jié)果表明儀器的精密度良好。

2.3.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取2.3.2項(xiàng)下的供試品溶液，按照2.3.1項(xiàng)下的色譜條件，分別于0、4、6、8、12、16、24 h時(shí)進(jìn)樣分析，得出毛蕊花糖苷峰面積值的RSD值為1.43%(n=7)。結(jié)果表明供試品溶液中毛蕊花糖苷成分在室溫下24 h內(nèi)比較穩(wěn)定。

2.3.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品(批號(hào):20200601)5份，每份精密量取5 mL，按2.3.2項(xiàng)下供試品溶液的制備方法，制備得供試品溶液，按照2.3.1項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣分析，得出毛蕊花糖苷峰面積的RSD為 0.21%。結(jié)果表明此方法的重復(fù)性良好。

2.3.8 加樣回收率試驗(yàn) 取已知毛蕊花糖苷含量的同一批樣品(批號(hào):20200601)9份，每份精密量取5 mL，分別精密加入定量的毛蕊花糖苷，按2.3.2項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備，按照2.3.1項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣分析，結(jié)果得出平均回收率為97.1%, RSD為0.56%，結(jié)果說(shuō)明此方法具有良好的回收率。見(jiàn)表1。

表1 小兒生血糖漿中毛蕊花糖苷成分的加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果 (n=9)

2.3.9 小兒生血糖漿樣品中毛蕊花糖苷的含量測(cè)定 取上述3批小兒生血糖漿樣品，每批取樣2份，按2.3.2項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備溶液，按照2.3.1項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算毛蕊花糖苷的含量。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 HPLC法測(cè)定小兒生血糖漿中毛蕊花糖苷有效成分的量 /mg/mL

3 討論

大棗薄層色譜鑒別[2-4]曾考察甲苯-乙酸乙酯-冰醋酸(7∶2∶0.5)與石油醚(60～90 ℃)-乙酸乙酯-冰醋酸(7∶2∶0.5)的展開(kāi)效果。因考慮到甲苯毒性強(qiáng)，環(huán)境污染大，故選擇石油醚(60～90 ℃)替代甲苯進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果表明，其展開(kāi)后斑點(diǎn)清晰、分離效果好、陰性無(wú)干擾。

山藥薄層色譜鑒別[5-7]曾用酸水解法[8]提取供試品中薯蕷皂苷元進(jìn)行薄層色譜鑒別[9]，但發(fā)現(xiàn)在陰性中干擾較大，后參考了2015版《中國(guó)藥典》中“山藥”和“九味肝泰膠囊”中山藥薄層鑒別方法，結(jié)果斑點(diǎn)較多、分離效果好、陰性無(wú)干擾。

毛蕊花糖苷含量測(cè)定[10-12]2010版《中國(guó)藥典》一部和2015版《中國(guó)藥典》一部均對(duì)熟地黃藥材中指標(biāo)成分毛蕊花糖苷進(jìn)行含量測(cè)定，為加強(qiáng)該制劑中熟地黃藥材的質(zhì)量控制，故參考了2015版《中國(guó)藥典》中“熟地黃”中含量測(cè)定方法。曾考察提取溶劑水、甲醇、乙醇，發(fā)現(xiàn)水為提取溶劑時(shí)粘度太大，不易過(guò)濾，提取溶劑為乙醇時(shí)，樣品容易結(jié)塊，提取效率不高。甲醇為提取溶劑超聲提取、回流提取及時(shí)間的比較，相同提取時(shí)間內(nèi)水浴回流提取效率高，且水浴回流提取在40 min后提取量無(wú)明顯增加，為保證提取充分性，故最終選擇以甲醇為提取溶劑，水浴加熱回流50 min。曾考察流動(dòng)相體系(水-乙腈、0.1%磷酸溶液-乙腈、0.1%冰醋酸溶液-乙腈)，結(jié)果流動(dòng)相為乙腈-0.1%冰醋酸溶液時(shí)毛蕊花糖苷成分峰型及分離度最好。

本研究在原標(biāo)準(zhǔn)基礎(chǔ)上增加了山藥、大棗薄層色譜定性鑒別和毛蕊花糖苷高效液相色譜法定量測(cè)定；其定性方法準(zhǔn)確，操作簡(jiǎn)便，斑點(diǎn)清晰且分離效果好，陰性對(duì)照無(wú)干擾，專(zhuān)屬性強(qiáng)。其定量方法精密度高，峰形好，重復(fù)性高，方法特異性及穩(wěn)定性均能達(dá)到要求。結(jié)果表明，所建立方法能有效的控制小兒生血糖漿處方中大棗、山藥及熟地黃藥材的質(zhì)量，適用于小兒生血糖漿的質(zhì)量控制，提升了小兒生血糖漿的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。