凱迪日耶·玉蘇普 美合熱阿依·木臺(tái)力甫 周 茜

1.喀什大學(xué) 生命與地理科學(xué)學(xué)院，新疆 喀什 844006;2.新疆帕米爾高原生物資源與生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 喀什 844006

黃酮類化合物(flavonoids) 是一植物次生代謝產(chǎn)物之一，其具有多種結(jié)構(gòu)類型和廣泛的生物活性，由于毒副作用比較小、具有廣譜的藥理活性，近幾年廣泛引起科學(xué)家和研究者的關(guān)注[1]。黃酮類化合物主要由在不同位置帶有酚或多酚基團(tuán)的苯并吡喃酮環(huán)組成[2]，具有螯合金屬、減少脂質(zhì)過(guò)氧化、清除自由基和抗氧化等作用[3]。黃酮類化合物在自然界中存在非常廣泛，藥用植物、蔬菜、水果、堅(jiān)果、草本植物、谷物、種子中均可發(fā)現(xiàn)黃酮類化合物[4]，到目前為止，已分離鑒定出黃酮類化合物早已超過(guò)10000多種。作為天然化合物，黃酮類化合物已用于染料、化妝品和護(hù)膚品等領(lǐng)域中[5-6]。黃酮類化合物具有光譜的藥理活性，已經(jīng)廣泛用于抗腫瘤、抗菌、抗病毒、神經(jīng)保護(hù)、抗氧化、防止惡性細(xì)胞擴(kuò)散等[7]，因此對(duì)黃酮類化合物的研究已成為國(guó)內(nèi)外醫(yī)藥界研究的熱點(diǎn)話題，是一類天然藥物[8]。

沙棗(ElaeagnusangustifoliaL.)是胡頹子科胡頹子屬植物，適應(yīng)性強(qiáng)，在半干旱、干旱、半荒漠、荒漠等多種環(huán)境中夠成長(zhǎng)生存[9]，被稱為沙漠里的“寶樹(shù)”[10]。沙棗在我國(guó)新疆、青海、甘肅、內(nèi)蒙古西部和寧夏等西北省份生長(zhǎng)面積較大，產(chǎn)量高，河北、河南和東北的部分省份也有分布[11]。

沙棗新鮮或者干燥的果實(shí)富含多種維生素和礦物質(zhì)，比如生育酚、維生素E、C、B1和α-胡蘿卜素等，礦物質(zhì)包括鉀，鈉，和磷等，沙棗果實(shí)中鉀，鈉和磷含量依次為8504 mg/kg， 1731 mg/kg 和635 mg/kg[12]。沙棗在傳統(tǒng)民間醫(yī)學(xué)上具有止痛、解熱和利尿等功效，傳統(tǒng)民間醫(yī)學(xué)上沙棗的果實(shí)和花用于治療惡心、咳嗽、哮喘、發(fā)熱、黃疸、腹瀉等多種常見(jiàn)病[13]，而沙棗種子則用于提取多酚以及其他抗氧化分子[14]。以往研究[14]發(fā)現(xiàn)，沙棗果實(shí)提取物可有效減輕類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者的疼痛癥狀，同時(shí)能夠降低受傷人員的傷口愈合時(shí)間。沙棗花期在五至六月，芳香，呈黃白色，沙棗花可以作為蜜蜂的花蜜來(lái)源[15]。沙棗的水或者有機(jī)溶劑提取物中可以檢測(cè)到黃酮、維生素、礦物質(zhì)、糖類、固醇和生物堿等化合物[16]，這可以證明它們可作為食品或藥物制劑中的成分使用。

沙棗提取物含有黃酮、多糖、生物堿、不飽和脂肪酸、甾醇、萜類、皂苷類、胡蘿卜素、單寧類等活性物質(zhì)[17]，具有抗菌、抗炎、心臟保護(hù)、降血脂、抗腫瘤、抗氧化等作用，因此在食品、藥品、化妝品等方面有較大應(yīng)用價(jià)值[18]。在國(guó)外也有研究[19]闡述沙棗作為藥物材料的作用和成分。

目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)沙棗黃酮類研究大多集中在果實(shí)部分，沙棗葉黃酮研究較少[20-22]，沙棗種子黃酮研究至今未見(jiàn)報(bào)道。鑒于此，本研究采用超聲波法提取沙棗葉、種子、果肉、果皮不同部位總黃酮，紫外可見(jiàn)分光光度法測(cè)定其含量，對(duì)比分析了沙棗不同部位總黃酮含量以及之間的差異，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)沙棗黃酮類物質(zhì)提供了一定的實(shí)驗(yàn)參考依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 材料 選取大果沙棗不同部位作為供試材料，大果沙棗及葉片采集與新疆維吾爾自治區(qū)喀什市。分別取沙棗干燥的全果，果皮，果實(shí)，種子以及葉片，自然風(fēng)干，用粉碎機(jī)研碎，過(guò)0.45 mm篩，于室溫下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 儀器與試劑 LE403E電子天平(瑞士，梅特勒)；T6新世紀(jì)紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京普析通風(fēng)儀器有限責(zé)任公司)；DGG-9146A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海齊欣科學(xué)儀器有限公司)；SCIENTZ-ⅡD超聲波細(xì)胞破碎機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)；TDZ4K離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)儀器開(kāi)發(fā)有限公司)。

蕓香苷(蘆丁)標(biāo)準(zhǔn)品、無(wú)水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉均購(gòu)自綠葉生物科技有限公司，以上試劑均分析純(AR)。

2 方法

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 105 ℃烘干恒重的蕓香甙標(biāo)準(zhǔn)品適量，取一支干凈的250 mL棕色容量瓶，準(zhǔn)確稱量50.00 mg蕓香甙，加入適量的無(wú)水乙醇攪拌至完全溶解后，定容至2 mL，配制成濃度為 0.20 mg/mL的蕓香甙標(biāo)準(zhǔn)溶液。取10 mL干凈的棕色容量瓶，精確吸取 0.20 mg/mL蕓香甙對(duì)照品溶液 4.00 mL，分別加入5 mg/mL亞硝酸鈉溶液0.30 mL，充分搖勻，放置 6 min 加入 10 mg/mL硝酸鋁溶液0.30 mL，充分搖勻，放置6 min ，加入4 mg/mL氫氧化鈉溶液 4.00 mL，用蒸餾水定容至相應(yīng)的刻度，充分搖勻，室溫放置15 min，于400～600 nm波長(zhǎng)處掃描，結(jié)果在498 nm處有最大吸收。

準(zhǔn)確稱取50.00 mg蕓香甙，用無(wú)水乙醇溶解后，定容至100 mL棕色容量瓶中，配制成濃度為 0.20 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。取7個(gè)25 mL棕色容量瓶中分別加入標(biāo)準(zhǔn)溶液 0.0 mL，0.5 mL，1.0 mL，2.0 mL，3.0 mL，4.0 mL，5.0 mL，之后在每個(gè)容量瓶中按順序加入5 mg/mL的 NaNO2溶液 300 μL，搖勻，靜止6 min后加入 10 mg/mL的 Al- (NO3)3溶液300 μL，充分搖勻，靜止6 min，再加入4 mg/mL的 NaOH 溶液 4.0 mL搖勻，最后用60%的乙醇定容搖勻，靜止15 min后，設(shè)0號(hào)管為空白對(duì)照組，于498 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。3次測(cè)吸光度取平均值。用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定蕓香甙標(biāo)準(zhǔn)溶液吸光度值。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液吸光度

以498 nm吸光值為X軸，對(duì)應(yīng)的蕓香甙濃度值為Y軸制作蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1所示。 對(duì)蘆丁濃度和吸光度值數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析后，獲得的線性方程式為Y=76.125X+0.5318，R2=0.9980，在濃度為4.0～40.0 μg/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，此方法可以作為沙棗總黃酮含量的測(cè)定方法。

2.2 供試品的準(zhǔn)備 分別稱取適量沙棗樹(shù)葉、果肉、果皮和種子，按照料液比 1∶22 加入60%的乙醇溶液，在320 W功率下超聲處理15 min，之后在4000 r/min離心10 min，將上清液收集在容量瓶中，用蒸餾水定容至25 mL，以備用。

2.3 沙棗不同部位總黃酮含量 取2 mL樣液至50 mL棕色容量瓶中，重復(fù)3次，按照2.1的方法在498 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，計(jì)算沙棗枝葉、種子、果肉和果皮不同部位總黃酮含量。以測(cè)定樣品的吸光度值為基礎(chǔ)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程計(jì)算大果沙棗不同部位總黃酮含量，如圖2所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明沙棗葉、種子、果肉、果皮中總黃酮含量分別為(8.27±0.04)、(20.56±0.17)、(5.91±0.05)和(2.52±0.07)mg/g(n=3)。試驗(yàn)結(jié)果表明，沙棗種子中黃酮含量最高，果皮中總黃酮含量最低，大果沙棗不同部位總黃酮含量次序?yàn)榉N子>葉>果肉>果皮。圖2中可以得出，與果皮相比，棗葉、種子、果肉總黃酮含量有極顯著差異(P<0.01)。

黃酮含量(mg/g)=(黃酮濃度×稀釋倍數(shù)×提取液體積) /樣品重量

2.4 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液各3份，2 mL置50 mL容量瓶中，按照2.1的方法在498 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。結(jié)果表明枝葉、種子、果肉和果皮樣品吸收度RSD分別為0.45%，0.75%，1.19%，2.22%(n=3) 對(duì)照品吸收度RSD=2.23%(n=3)，說(shuō)明精密度較好。結(jié)果見(jiàn)表2。

2. 5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 精密稱定同一批沙棗葉、果肉、果皮和種子5份，按照2.2方法制得供試品溶液，按照2.1的方法在498 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。在498 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。結(jié)果表明枝葉、種子、果肉和果皮樣品吸收度RSD分別為0.45%，0.396%，1.19%，1.33% (n=3)，說(shuō)明重復(fù)性較好。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2. 6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液各2 mL置50 mL容量瓶中容量瓶，按照2.1的方法分別在 5，10，20，30，40，60 min 測(cè)定498 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。結(jié)果表明，結(jié)果表明枝葉、種子、果肉和果皮樣品吸收度RSD分別為0.46%，0.28%，0.865%，1.13%(n=3)，樣品吸收度 RSD=0.46%(n=3)，說(shuō)明穩(wěn)定性較好。結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.7 加樣回收實(shí)驗(yàn) 取已知總黃酮含量沙棗種子粉末1 g，按照2.2方法制備供試品，同時(shí)分別加入已知濃度的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液1 mL，2 mL，3 mL依照上述樣品測(cè)定的方法測(cè)定，求出回收率結(jié)果。結(jié)果表明，3次測(cè)定的平均回收率為 100.19 % ，(RSD=0.314%，n=3)。說(shuō)明該測(cè)定方法測(cè)得的結(jié)果準(zhǔn)確。結(jié)果見(jiàn)表 5。

表5 加樣回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論

總黃酮是植物生長(zhǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物，植物體內(nèi)次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生和積累與植物的生長(zhǎng)發(fā)育程度及外界環(huán)境因素密切相關(guān)[23]。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，大果沙棗種子總黃酮含量最高，其次為沙棗枝葉和果肉，沙棗果皮中最低。本研究采用超聲波提取法提取大果沙棗不同部位總黃酮以及比較所含總黃酮含量差異。由于超聲波能夠?qū)е轮参锛?xì)胞壁的破壞，從而溶劑滲透細(xì)胞的速度進(jìn)一步加快，有效成分迅速溶解到有機(jī)溶劑里，從而提高了有效成分的提取效果，減少提取時(shí)間，降低了高溫對(duì)提取成分的影響[24]。超聲波提取不僅提取時(shí)間相對(duì)短，節(jié)約所用的有機(jī)溶劑，同時(shí)能提高提取速率，提取工藝相對(duì)不復(fù)雜，可以作為提取黃酮、多糖等活性物的首選的提取方法[25]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為 60%，320W功率下超聲提取15 min，料液比為 1∶22提取工藝條件下，大果沙棗種子的總黃酮含量可達(dá)(20.56±0.17)mg/g(n=3)。沙棗目前作為中藥的常用材料，其活性成分的提取，研究抗氧化、抗菌活性等是非常有必要的[26]。綜上，沙棗的種子、枝葉和果肉中總黃酮含量豐富，可為今后大果沙棗資源的開(kāi)發(fā)，醫(yī)藥成分的研究等提供了一定的實(shí)驗(yàn)參考依據(jù)。