張璟譞，高兵兵，何冰芳，

（1.南京工業(yè)大學 生物與制藥工程學院，江蘇 南京211800；2.南京工業(yè)大學 藥學院，江蘇 南京211800）

酶催化劑在食品、化學和制藥等不同領域均發(fā)揮著重要作用［1－5］，促進了大宗化學品、食品添加劑以及藥物的可持續(xù)生產。我國通過“十一五”［6］和“十二五”［7］期間相關國家科技計劃的部署實施，成功實現(xiàn)了部分重大化工產品生物制造的產業(yè)化應用。當前，生物催化由于其優(yōu)秀的反應選擇性已成為低碳經濟發(fā)展趨勢下新一輪技術革新和產業(yè)改革中的焦點［8］。工業(yè)化催化反應中，通常使用有機疏水相反應體系［9］，游離酶由于在較高的反應溫度或極端不穩(wěn)定的pH范圍內的弱穩(wěn)定性和對疏水溶劑的低適應性，使其無法在工業(yè)化生產中被大規(guī)模使用。此外，游離酶通常難以與反應系統(tǒng)分離并且難以重復使用［10－11］。

因 此，在20世 紀60年 代，固 定 化 酶（immobilized enzyme）這個專業(yè)用語被首次提出并采用［12］。其定義如下：使用某種方法將酶和載體結合在一起，使之不溶于含有底物的反應相中，以控制酶解反應發(fā)生在一定的空間范圍內［13］。酶的固定化有助于實現(xiàn)其回收后的重復使用并提高其穩(wěn)定性［14］。固定化酶相較于游離酶在工業(yè)化連續(xù)生產中表現(xiàn)出很多不可或缺的優(yōu)點，固定化酶表面微環(huán)境和酶之間的作用力，可以適當維持活性中心結構的剛性，從而使酶維持在一個穩(wěn)定的高活性狀態(tài)，從而有效增加產物收率；而且將酶固定在合適的載體上，簡化了反應液中回收酶的步驟，同時增強了酶的力學性能和熱穩(wěn)定性。更重要的是，由于固定化后的酶不會發(fā)生嚴重的團聚作用，反應體系中沒有酶液的殘留，從而簡化了后續(xù)的提純工藝，反應過程變得可控且更適合多酶反應體系，尤其是在可以提高使用微流體反應器進行連續(xù)流動反應時酶自身的可操作性和力學性能以及熱穩(wěn)定性［15－16］。然而，較高的生產成本和較低的蛋白質載量以及固定化效率都限制了固定化載體的商業(yè)應用［17］。隨著現(xiàn)代生物技術的不斷發(fā)展以及學科間的相互滲透，相較于基于普適性思維設計的傳統(tǒng)固定化酶策略，根據(jù)酶的特性以及應用需求研發(fā)的新型固定化方法［18］以及具有理想比表面積的微／納米結構材料［19］，使得酶往往具有更高的擔載量，因而有效提高了酶的固定化效率。為順應綠色制造和精細化工技術時代的要求，酶固定化技術越來越多地被應用于化工生產、食品、醫(yī)藥、環(huán)境治理和生物能源等領域。筆者重點綜述了傳統(tǒng)和新興的酶固定化方法，以期為研究者提供相關參考。

1 傳統(tǒng)的酶固定化技術

傳統(tǒng)的酶固定化方法可粗分為4種：吸附法、共價結合固定法、包埋及衍生微囊法和交聯(lián)法［20］。

1.1 吸附法

吸附法［21］是最早發(fā)展起來的酶固定化方法之一，也是固定化酶具有可操作性的重要理論依據(jù)，它通過載體和酶分子自身結構之間產生的非特異性的物理吸附［22］、離子吸附［23］、生物特異性吸附、親和吸附和疏水作用等，將酶分子固定在載體周圍，從而成功制備了種類豐富的固定化酶。吸附法制備固定化酶的操作比較簡便，無需經過化學反應，不采用有毒試劑，條件相對溫和，酶活回收率較為理想，但吸附特異性較低。因此，常作為基礎方法與其他方法聯(lián)用，從而衍生出特異性更強的酶固定化策略。

1.2 共價結合固定法

共價結合固定法是指將酶蛋白分子上可反應的官能團與載體表面已有的活性基團間形成化學共價鍵，從而將載體和酶進行有效銜接［24］。這種方法由于有穩(wěn)固的共價鍵結合，使得酶不易從載體上脫落，易從反應體系中被回收，且重復使用次數(shù)較多，但載體激活方法易產生毒廢料且化學鍵結合易使酶的構型發(fā)生不可控的改變，繼而導致部分酶失活。

1.3 包埋及衍生微囊法

包埋法，即通過將高分子材料分散到流體介質中形成格子結構或者微囊結構，以達到將酶或者其他生物催化劑約束在載體中以及阻止蛋白流失的目的［25］。底物能夠通過孔隙進入不溶性載體中與酶接觸，此法操作條件溫和簡單，但對底物和產物的尺寸有一定要求，較適合兩者均為小分子的酶類。

酶的微囊固定化法實質上屬于包埋固定化的一種衍生方法，是指將水溶性或凍干酶、細胞通過界面沉淀聚合法以及二級乳化法，將酶包埋在直徑為1～100 μm的半透性高分子膜內的固定方法［26］。

1.4 交聯(lián)法

交聯(lián)法是指利用雙功能試劑作為鏈接臂對酶蛋白進行分子間的交聯(lián)反應，該法通過化學反應產生共價鍵連接，形成疏水性三維共價鍵網架結構后，再從親水性溶液中被析出［27］。由于交聯(lián)反應的無序性，可能在酶的活性中心發(fā)生交聯(lián)而使酶活降低或失活，從而明顯降低固定化酶的酶活回收率。同時，由簡單交聯(lián)形成的固定化酶交聯(lián)體的力學性能較差，因此交聯(lián)法很少被單獨應用于酶的固定化中，通常與其他固定化方法結合，以鞏固或提高原有固定化策略的效果。

2 新興的酶固定化方法

2.1 交聯(lián)酶聚集體技術

以交聯(lián)酶聚集體法（mCLEAs）為代表的無載體固定化技術是指先采用物理方法將酶蛋白聚集，之后采用交聯(lián)劑對酶進行交聯(lián)。相較于傳統(tǒng)的交聯(lián)法，該法在固定化過程中通常串聯(lián)或者并聯(lián)多個酶，有更高的酶活性和可控性以及更低的生產成本，因而能夠在同體系催化多級級聯(lián)或非級聯(lián)的生物轉化。該固定化技術中常用的雙功能交聯(lián)劑為半縮醛和半縮醛寡聚體形式的戊二醛。Pervez等［28］通 過 在 酶 溶 液 中 加 入 質 量 分 數(shù)40%（NH4）2SO4和1.5%戊二醛，在4 h內制備出具有94%聚集率的交聯(lián)淀粉葡糖苷酶聚集體（CLAA）。脂肪酶和多種復合酶蛋白存在著界面激活效應，酶的自固定化概念也由此被提出，即將酶的水溶液與含表面活性劑的非水相溶液混合，同時加入雙功能交聯(lián)劑，借助物理方法，從而形成微乳化體系。由于自身結構特點，酶傾向于向油水界面靠近，交聯(lián)劑使微乳球表面附近的酶聚集而表現(xiàn)出高度的疏水性，除去有機試劑后，獲得的固定化酶通常處于利于反應的激活態(tài)。隨后，Arastoo等［29］將Km12脂肪酶的交聯(lián)酶聚集體進一步與氨基包覆的磁鐵礦納米顆粒耦聯(lián)，得到磁性納米mCLEAs- 脂肪酶（mCLEAs-lip），該固定化酶在6個循環(huán)后，仍能保持其原始酶活，且在4℃低溫環(huán)境中被封存24 d后仍能檢測到60%的原始酶活。

2.2 柔性長鏈技術

酶的柔性固定化是指將一些有足夠碳鏈長度且具有一定親水性的分子鏈，通過化學法接枝在固定化載體上的技術。帶有柔性鏈的載體在制備固定化酶的過程中，緩解了固定化過程中酶與載體之間的剛性碰撞，從而避免了因構象改變而損失的部分酶活；另外，柔性鏈既能使酶蛋白構象因受微環(huán)境的改變而發(fā)生恰當?shù)恼郫B或改變，又可以部分保留固定化酶在游離態(tài)時的構態(tài)柔性，從而增加酶的自恢復能力，以降低操作中的不穩(wěn)定性。Qu等［30］通過原子轉移自由基聚合反應，制備了具有環(huán)氧基的親水性梳狀聚合物（丙烯酰胺-共甲基丙烯酸縮水甘油酯，acryl-amide-co-glycidyl methacrylate），該載體可用于脂肪酶的共價柔性固定。固定在該載體上的脂肪酶擔載量為16.6 U／g，在有效提高了pH和溫度穩(wěn)定性的同時，使用7個循環(huán)后，固定化脂肪酶的酶活仍為原始酶活的73.5%。

2.3 定向技術

定向技術克服了傳統(tǒng)固定化技術中酶分子與載體表面位點連接的無序性，通過融合標簽等方法實現(xiàn)了酶蛋白特定位點的定向結合，以避免活性位點被隨機破壞。載體表面形成的有序二維陣列活性位點，通常被設計成面向載體表面外側，以便于底物分子與活性中心結合，從而有效提高反應效率。定向固定化技術可細分為氨基酸置換法、抗體耦聯(lián)法、生物素-親和素親合法，疏水定向固定化［31－33］和生物酶介導法等。增強的綠色熒光蛋白（EGFP）和谷胱甘肽轉移酶（GST）可作為生物酶介導修飾策略的代表模型。Tanaka等［34］將EGFP模型蛋白的C末端用谷氨酰胺（Gln）供體底物肽標簽進行標記后，通過轉谷氨酰胺酶（MTG）酶促反應，定向地與含有酪蛋白涂層的聚苯乙烯表面親和結合，該方法只需要廉價的蛋白質吸附劑，且具有很高的特異性。另一類標簽蛋白固定化策略以DNA烷基轉移酶標簽（SNAP- tag）為代表［35－36］，將目標酶與SNAP標簽蛋白共表達，再利用標簽與載體表面的特定殘基形成穩(wěn)定的共價結合。這一類固定化技術本質上是通過蛋白融合而實現(xiàn)的定向共價固定，例如Noba等［37］首先采用特定殘基的芐基鳥嘌呤衍生物修飾磷脂成分后，再使用該成分制得脂質體以包裹β-葡萄糖醛酸酶（GUS），隨后將其與帶有SNAP融合標簽的黏附性細菌纖維蛋白AtaA形成穩(wěn)定的共價結合，而AtaA蛋白的黏附性末端可以被固定在疏水性和親水性固體表面上。該固定化策略設計性較強且選擇性理想，但操作細節(jié)較為復雜，目前僅被應用于對靈敏度和精確度要求較高的生物傳感器［36］和人工細胞系統(tǒng)的制備方面［37］，而關于各類生物酶的普適性催化應用還有待進一步的深入研究。此外，借助輔基-脫輔酶的親和作用也可以構建出定向共固定化酶體系，例如許永娟［38］將辣根過氧化物酶（HRP）的輔基血紅素和葡萄糖氧化酶（GOx）的輔基黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）固定在功能化的氧化石墨烯上制得改性輔基后，將去輔基的酶與改性輔基重組得到氧化石墨烯固定化酶。該研究發(fā)現(xiàn)［38］：相較于原始酶的電化學活性，氧化石墨烯改性后的HRP活性提高了將近4倍，而改性后的GOx的活性也提高了將近3倍。

2.4 化學修飾介導技術

化學修飾介導的固定化技術轉變了傳統(tǒng)的固定化思路，將酶分子氨基酸殘基或載體表面通過化學法修飾，從而引入特定基團，使酶與載體間發(fā)生特定的化學反應，形成穩(wěn)定的定向化學共價鍵吸附［39－40］。該法涉及可參與各種化學反應的氨基、硫醇［41］、羧基、羥基、環(huán)氧基、醛基、疊氮和炔烴等各種活性官能團。Li等［42］在聚丙烯腈（PAN）中的空膜表面使用腈點擊化學法（Nitrile- click chemistry）進行修飾后，引入藻酸鈉（SA），之后用CaCl2對膜進行后處理。制得的PAN -PEI -SA-CaCl2載體用于脂肪酶固定化時，蛋白擔載量可達36.90 mg／g，酶活性為54.47 U／g，是Novozym?435的2.5倍。Gossl等［43］將乙炔官能化的碳酸酐酶（CA）和HRP通過Cu（I）催化的點擊化學1，3-偶極環(huán)加成反應（CuAAC）固定在疊氮化物官能化的介孔SiO2納米顆粒表面，分別得到99和103 mg／g的擔載量。Wei等［44］采用二硫鍵還原劑（TCEP）使胰蛋白酶帶上巰基，隨后通過硫醇—烯鍵產生化學反應，使其與三甲基丙烯酸酯（TRIM）整料表面存在的雙鍵成功鍵合，使用2個月后的酶活性僅下降13.8%。該化學修飾固定化策略的出現(xiàn)，填補了由于自身缺乏共價結合能力的酶無法進行固定化技術的空白，但該方法的修飾過程中有較多不可控因素，并有改變酶蛋白結構使其酶活降低的可能性。目前有通過生物信息學對修飾位點進行突變的報道［45］，以及預測或選取條件較溫和的生物相容性無銅點擊反應法等［46］，以達到降低固定化酶催化活性損失的目的。

2.5 界面聚合技術

界面聚合技術是指發(fā)生在兩種互不相容或性質差異明顯的界面之間的縮聚反應，具有不可逆性，最早被用于化學合成研究中［47］。隨著科技的發(fā)展，衍生自乳液體系研究的界面聚合微囊技術為固定化提供了一種新的思路：即將目的酶溶解在相應的體系中，通過復雜的界面相互作用縮聚形成的微型囊泡，或水滴狀顆粒將酶蛋白包裹，再分離出體系。2015年，Qu等［48］在Pickering乳液的油／水界面處進行多巴胺的選擇性聚合后，與脂肪酶通過共價鍵結合。由于脂肪酶的界面激活效應，固定化脂肪酶的比活性較游離態(tài)的酶和包封于膠體水核中的酶分別高出了8和1.4倍，且具有出色的操作穩(wěn)定性和可回收性，15個循環(huán)后仍保留了86.6%的原始酶活。之后，Qu等［49］首次將疏水性Fe3O4@SiO2納米顆粒（NPs）用于油包水磁性Pickering乳液體系的包埋固定化，發(fā)現(xiàn)其比活力最大可得24.17 U／mL。乳液液滴較高的比表面積和底物通過液滴界面時的有效傳質系數(shù)以及合理設計的疏水性載體，使酶在具有較高的生物催化活性的同時，兼?zhèn)淞己玫目苫厥招院涂裳h(huán)性。Qi等［50］在全新的界面生物催化系統(tǒng)中結合金屬有機骨（MOFs）ZIF -8和Pickering界面體系，利用脂肪酶負載的ZIF -8（質量分數(shù)為1%）對聚苯乙烯為芯材的Pickering乳液油滴進行固化。相較于游離酶和ZIF -8固定化酶，該油滴狀固定化酶的催化活性分別高出了2.51和1.6倍，在6批次反應后仍剩余80%的原始酶活，且能夠通過調整水油比例以及油滴大小，使其能參與更多種類的催化反應。

2.6 單酶納米顆粒技術

單酶納米顆粒技術（SENs），區(qū)別于酶蛋白固定化方法，是將每個酶分子用一種納米級的有機或無機多孔網狀聚合物包圍，從而形成的納米級酶顆粒。2003年單粒酶的概念被首次提出，Kim等［51］將兩種胰蛋白酶包埋固定于一種多孔有機-無機材料中，每個酶分子如同被單獨封鎖于一個四壁非常薄的納米級的集裝箱中。由于其具有的多孔性結構，且尺寸為納米級別，因此溶劑分散性良好，單粒酶（SENs）與反應底物之間的傳質阻力也很小，固定化酶的催化活性得到了有效提升，但其納米單體尺寸較小，因而不易從反應體系中被回收分離，實際應用中考慮與特殊屬性的材料聯(lián)合使用，以簡化其回收和循環(huán)使用的相關操作。例如Yang等［52］通過表面改性和原位水聚合，制備了被導電聚合物Fe3O4復合材料外殼包裹著的超順磁性SENs，在pH為9.0時，相較于游離酶約20%的剩余酶活，仍可保留大約85%的原始活性。此外，多孔的金屬有機骨架材料（MOFs）［53］也是單酶固定化的有效策略，如2013年，He等［54］在轉化酶、GOx和HRP周圍成功形成丙烯酰胺納米凝膠復合體，使級聯(lián)反應的周轉率提高了10倍以上。2014年，Chapman等［55］成功將ZIF -8和ZIF-10與細胞色素C共同沉淀，之后成功整合了溶菌酶、HRP、脲酶和脂肪酶。隨著單粒酶制作工藝被更深層的研究，Cai等［56］通過兩步操作，合成了模擬過氧化物酶活性的Cu（OH）23D籠狀（SCs）結 構 納 米 顆 粒，以H2O2為 底 物 時，Cu（OH）2SCs的米氏常數(shù)值（Km＝0.199）比HRP的低約20倍。由于CuOH2SCs中較高的表面積與體積比，該新型納米人工酶明顯對H2O2具有更好的親和力，且比先前報道的不規(guī)則形狀的SENs的催化參數(shù)值高大約2倍［57］。隨后Beloqui等［58］通過添加少量蔗糖，建立了無需對酶預處理的一步合成SENs的方法，其凝膠層厚度和孔徑大小等重要參數(shù)可以通過改變合成方法的反應條件來進行微調，且對于來自Aspergillus niger的GOx，13.9 nm孔徑的SEN8相較于9.0 nm的SEN11，催化常數(shù)（kcat）從（32.2±3.8）s－1提高到（98.1±10.9）s－1，而隨著GOx－SEN外殼厚度的增加，最佳pH從5.5變?yōu)楦鼘挼姆秶╬H 4～8）。

2.7 其他新型固定化技術

由于科技發(fā)展的日新月異，固定化酶被應用于更加復雜多樣的生產環(huán)境，更多類型的固定化策略也亟待被開發(fā)。隨著學科間的相互滲透，在遵守固定化酶制備原則的基礎上，研究者們將磁性、金屬［59］、光、等離子體和輻射等新興技術引入修飾方法中，制得了各種高活力的固定化酶。例如，Maria等［59］將脂肪酶固定在檸檬酸修飾的磁鐵礦納米粒子上，催化醇酯交換反應24 h后，即可實現(xiàn)94%的最大轉化率，使用10批次后的酶活性沒有明顯降低。在光催化方面，Zhu等［60］在紫外光輻照下通過奪氫-耦合反應，將異丙基硫氧蒽酮半蒎醇（ITXSP）休眠基接枝到低密度聚乙烯（LDPE）表面。隨后，該休眠基在可見光催化下生成的碳自由基再次引發(fā)雙官能單體聚乙二醇雙丙烯酸酯（PEGDA）的接枝聚合，將脂肪酶原位固定在高度交聯(lián)且厚度可調的水凝膠網絡層中。該固定化酶催化葡萄糖與棕櫚酸的酯化反應時，7個循環(huán)后的酯轉化率僅降低了不到2%，仍高于45%。而Wang等［61］通過可見光引發(fā)的接枝聚合反應，首先在低密度聚乙烯（LDPE）薄膜上將β-葡萄糖苷酶（BG）原位包裹在較薄的聚乙二醇（PEG）水凝膠內層，隨后在PEG內層上重新引發(fā)接枝聚合，使得纖維素酶共價附著在外層刷狀聚丙烯酸鈉（PAANa）表面。BG作為纖維素酶的補充與其分層共固定后，兩者酶活力相較于游離酶分別增加了82%和20%，雙酶系統(tǒng)在6次循環(huán)后，仍可維持89%的總原始活性。此外，大部分載體和酶自身的水油雙親性、溶解度等物化性質均有很大不同，尤其多孔性載體材料與游離酶之間由于各種作用力所引起的接觸性障礙，使得固定化過程中體系分散程度不佳，而微波輻射輔助的固定化技術可以在固定化反應原液的準備和固定化反應過程中，借助其對溶液或酶結構的產生影響，促進反應溶液的均勻分散，例如Holyavka等［62］通過研究發(fā)現(xiàn)：在151 J／m外輻射強度下，游離態(tài)的菠蘿蛋白酶的催化活性（0.52 U／mL）有明顯增加，且對殼聚糖基質固定化效果并無任何影響。

2.8 基于3D打印技術的酶固定化方法

增材制造（通常稱為3D打?。┦且环N新興的自下而上的制造技術，可以快速實現(xiàn)復雜幾何形狀的原型設計［63］。它已被廣泛用于工業(yè)設計、建筑、組織工程和其他領域［64－68］。3D打印的主要優(yōu)勢在于它可以直接構建成本低廉的復雜結構［69］，尤其是一些內部結構參數(shù)復雜，具有多孔或者復雜孔道的結構，不會造成材料損失［70］。打印的組件是可調的（圖1），僅通過更改原始設計圖形，即可實現(xiàn)完全或部分修改組件［71－72］。

圖1 用于酶固定化的不同三維結構3D打印支架的數(shù)字圖像［71］Fig.1 Digital images of different 3D structural scaffolds printed for enzyme immobilization［71］

工程技術的進步和減小的打印設備成本為采用3D打印創(chuàng)建的功能性設備（如生物反應器，組織工程支架和檢測器）提供了操作基礎［14，72－73］。熔融沉積建模（FDM）技術［74－75］采用可擠出的熱塑性塑料，例如丙烯腈-丁二烯-苯乙烯（ABS）［76］和聚乳酸（PLA）［77］，按照擠壓、燒結、熔融、光固化和噴射等方式逐層堆積制造出三維實體，具有簡單且成本低的優(yōu)點［78］。數(shù)十年來，用于3D打印的新型材料不斷地被研發(fā)出來，包括混入纖維素納米晶體［79］的PLA，碳纖維增強的PLA（C-PLA）［80］，石墨烯［81］和二維過渡金屬碳氮化合物［82］。此外，印刷材料的化學修飾［83－86］也引起了越來越多的關注：因其具有高效［87－88］，低成本及可操作性強等特點，有潛力成為低成本的固定化載體，既而通用制造平臺被應用于在生物催化領域［89］。例如Cesar等［14］設計了一種將酶固定在3D打印的連續(xù)流設備上的方法（圖2）。Manfred等［90］將來自芽孢桿菌屬微生物的酯酶（Est）和醇脫氫酶（ADH）添加到瓊脂糖基油墨中，用于溫度可控的簡單3D打印過程，在60℃條件下經歷15 min打印過程后，酯酶（EstⅡ）和醇脫氫酶（ADH）分別保留有（96±12）%和（85±9）%的原始酶活。

圖2 FDM打印機打印尼龍材料的過程及功能化修飾后的3D打印反應器［14］Fig.2 Printing process of nylon employing an FDM printer and ustration of the post-functionalisation of the printed reactor［14］

此外，Kennedy等［13］將葡萄糖氧化酶和乳酸氧化酶固定在采用FDM技術制成的檢測系統(tǒng)中，通過酶促氧化反應，可在線監(jiān)測大鼠腦細胞外葡萄糖和乳酸濃度。該ABS流式反應器進樣量為20 μL，其檢測限對葡萄糖低至0.060 mmol／L，而對乳酸低至0.059 mmol／L，適用于對精準度要求較高的活體大鼠的體內動態(tài)監(jiān)測；Ye等［91］報告了一種利用增材制造技術的新型酶固定化策略，經食人魚溶液，過氧乙酸和硅烷偶聯(lián)劑修飾后，比表面積增加了3.63倍（2.2 m2／g），實驗證明：可對青霉素G?；D移酶（PGA），蛋白酶，糖苷酶和脂肪酶進行有效固定。其中PGA催化反應的最終產量可達185.6 mmol／L，乳糖苷酶催化反應的最終乳糖產量為142 g／L，10次循環(huán)使用后，PGA的酶活性保留率為88%，糖苷酶的保留率為92.8%。

在傳統(tǒng)方法基礎上拓展思路，結合新興技術衍生出的新型固定化策略，雖然部分固定化策略的工藝略顯復雜且單體造價稍高，但是通過各種修飾方法創(chuàng)造的表面微環(huán)境明顯增強了載體與酶之間的特異性吸附，以及酶與底物之間的專一性。此外，新技術不僅能有效降低雜酶的吸附量，提高初始酶活，而且在反應過程中可以最大程度地維持較高的催化活性。以上優(yōu)勢使其普遍具有較高的重復利用率，從而大大降低了工業(yè)化生產成本，因此，新型方法不僅適用于各種對靈敏度要求嚴苛的反應器，在工業(yè)化應用方面同樣具有較高的性價比和潛力。為方便比較傳統(tǒng)酶固定化方法和新型酶固定化方法的優(yōu)劣，將新型酶固定化策略與傳統(tǒng)策略的各項性質比較歸納于表1。

表1 酶固定化策略優(yōu)劣比較Table 1 The characteristics and examples of various immobilized methods

3 固定化酶的應用

生物酶制劑具有高度的區(qū)域性和立體選擇性，其催化效率高、副產物少，可催化類型多樣且無需引入大量有毒試劑，因此，對環(huán)境十分友好。而新型固定化技術進一步提高了酶制劑的催化活力和操作穩(wěn)定性，簡化了回收過程，有效減少了其在實際工業(yè)應用中的使用成本。酶的各種優(yōu)良特性已經被有針對性地應用于各個領域的實際生產中，其中食品行業(yè)由于對安全要求嚴苛，較早使用無毒的酶催化劑進行生產。固定化脂肪酶作為廣泛使用的催化劑之一，由于界面激活效應而最早被用于長鏈脂肪酸的選擇性合成中［92］，隨后酸解和酯化催化特性被分別應用于高酸醬油渣油的脫酸［93］和風味酯的合成［94］中。另外，β-半乳糖苷酶也是最早被應用于乳品生產的典型案例，可有效降低鮮奶中的乳糖含量，避免乳糖不耐癥患者飲用鮮奶后產生不適癥狀，以及解決低溫乳制品因乳糖結晶所導致的口感問題［95］。此外，固定化酶在靈敏度要求較高的傳感器以及醫(yī)藥行業(yè)、環(huán)境治理和生物能源等領域也有著大量的應用案例。納米多孔材料優(yōu)化了生物傳感器的靈敏度和反應時間，由于其簡單、專一且成本較低，已成為目前傳感器領域的研發(fā)熱點［96］。

高純度藥物中間體是醫(yī)藥行業(yè)關注的熱點之一，Di等［97］首次通過離子液體強化的酶法在水性介質中由衣康酸（IA）合成生物質來源中間體衣康酸二甲酯（DI）。該研究表明：采用離子液體1-氟-3-丁基咪唑鎓六氟磷酸鹽（［bmim］［PF6］）進行預處理，可以在不影響其酯化活性的前提下，使得脂肪酶的水解活性受到很大程度的抑制，產物DI的產率可達64.3%。在醫(yī)療領域，由于具有3D交聯(lián)網絡和可調節(jié)的理化特性，采用環(huán)保、高效的氧化還原酶引發(fā)的自由基聚合反應制備的水凝膠和微／納米凝膠，被廣泛應用于組織工程和藥物輸送系統(tǒng)中［98］。Attieh等［99］將HRP固定在玻璃微珠上，加入H2O2和乙酰基丙酮（ACAC），形成催化循環(huán)，繼而引發(fā)聚合反應，可制得尺寸為50～300 nm且具有良好的結合性，印跡效應和選擇性的分子印跡聚合物（MIPs）。該反應以4-乙烯基吡啶（4-VP）為功能單體，2，4-二氯苯氧基乙酸（2，4-D）為印跡分子，形成可逆復合物，使用1，4-雙丙烯酰哌嗪（PDA）作為交聯(lián)劑，使得功能單體以印跡分子為模板進行聚合。

通過動植物油與短鏈醇之間酶催化的酯交換反應，獲得的脂肪酸烷基酯混合物被認為是可以直接使用或與衍生自石油的柴油混合使用的環(huán)境友好型可再生柴油能源。相比于傳統(tǒng)固定化策略，F(xiàn)an等［100］將米赫根毛霉脂肪酶定向固定在磁化的樹狀分子上，使得固定化酶穩(wěn)定性增強且兼具磁性，通過載體自帶的磁性將固定化酶從反應體系中快速分離，有效解決了傳統(tǒng)固定化載體從反應器中分離難的應用障礙。Marta等［101］使用了3種具有不同特異性和酒精耐受性的商品酶Lipozyme?RM IM，Lipozyme?TL IM和Novozym?435，以乙醇為?；荏w，催化低品質魚油的酯交換反應，其中使用Novozym 435和過量的乙醇（質量比為1∶1.82）可獲得最高產量（82.91%），在連續(xù)使用10個周期后，其最大活性損失僅為16%。

在環(huán)境工程領域，多銅氧化酶家族中的漆酶被廣泛應用于降解工業(yè)廢水和有毒化合物中。20世紀80年代，漆酶的降解能力被首次發(fā)現(xiàn)后，早期采用凝膠雜化等方法結合傳統(tǒng)材料海藻酸鈉對漆酶進行固定化，但其操作穩(wěn)定性和重復使用率并不理想。龐仕龍［102］將帶有羧酸基團的Cu -MOF和Zr-MOF金屬有機骨架介孔材料與石墨烯氣凝膠合成的復合材料用于漆酶的吸附固定化，經此法固定化后的酶具有良好的操作穩(wěn)定性和重復性，且酶活的回收率在水相中被封存3周后，仍能達到55%以上。Chauhan等［103］將漆酶固定在電荷可切換的pH響應型銀納米顆粒上，并使用普朗尼克（Pluronic）表面活性劑穩(wěn)定其表面微環(huán)境，有效降低了活化能，并擴大了其反應溫度的范圍。

4 總結和展望

近年來，眾多領域的科研人員在對新型生物酶的固定化策略研發(fā)過程中，不斷尋找具有創(chuàng)新性的突破口，使大量研究成果不斷涌現(xiàn)，同時越來越多的科研理論成果被投入到實際工業(yè)化生產中，有效緩解了傳統(tǒng)化工對生態(tài)環(huán)境的壓力。雖然新型固定化載體以及其方法在一定程度上克服了傳統(tǒng)固定化方法中出現(xiàn)的弊端，但在工業(yè)化應用方面仍存在諸多問題，例如材料參數(shù)缺乏普適性，對于不同類型的酶和反應體系，其最佳固定化方法都不盡相同，無法修改其中的細節(jié)性參數(shù)，在一定程度上增加了酶被應用于不同化工生產中的初期試錯成本。另一方面，研究人員對固定化參數(shù)影響酶催化效率的深層機制仍缺乏理解，大部分采用虛擬環(huán)境下的模擬無法完全還原反應的實時動態(tài)，因此，對于材料研發(fā)較為宏觀，缺乏基于反應過程進行預判的細節(jié)性設計。因此，筆者建議嘗試建立更全面準確的固定化酶載體和策略數(shù)據(jù)庫，使研究人員通過該數(shù)據(jù)庫可以全方位地獲得某種酶分子在實際操作中遇到的操作問題，從而使得設計出的固定化策略能夠對所參與的各類反應和反應器類型具有更強的普適性。并且注重生物信息學、材料、物理和化學等相關學科更深層次的相互滲透，例如：在化學修飾介導的固定化策略中，可以尋找生物相容性更高或者對環(huán)境更為友好的催化劑類型；不斷完善酶的生物信息數(shù)據(jù)庫，從而為開發(fā)還原度更高的動態(tài)模擬分析軟件提供更為堅實的理論基礎。同時，結合更多物理化學方面的材料表征方法，從酶和載體兩方面探究固定化酶各項參數(shù)在真實反應體系中影響酶促反應的機制，以期加強固定化技術前期研發(fā)設計對載體細節(jié)的把控性和對結果的可預判性。隨著生物技術和材料、化工、機械和計算機等相關學科之間的滲透發(fā)展，固定化技術的研發(fā)正逐步向精細化方向發(fā)展，對固定化策略效果的要求從粗略定性轉向追求精確量化，從隨機無序轉向定性可控。為獲得種類功能更加豐富和全面的高品質固定化酶，采用新興技術增強固定化策略的目的性、設計性以及經濟性，并將其有效應用于連續(xù)化工業(yè)生產，仍是生物工程領域研究人員為之不懈努力的方向。