石維利，李 會(huì)，史勁松，許正宏

（1.江南大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 無(wú)錫214122；2.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫2141222；3.江南大學(xué) 糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫214122）

甾體激素類藥物是僅次于抗生素的第二大類藥物，被廣泛應(yīng)用于抗炎、利尿、合成代謝、避孕、抗雄激素、孕激素和抗癌等方面［1－3］。3β，7α，15α-三羥基雄甾-5-烯-17-酮（7α，15α-diOH-DHEA）是合成新一代女用口服避孕藥“優(yōu)思明”的活性成分屈螺酮的關(guān)鍵中間體，可以通過(guò)微生物產(chǎn)生的羥化酶對(duì)去氫表雄酮（DHEA）的雙羥化作用獲得［4－5］。一 些 真 菌，如 中 間 型 赤 霉 菌（Gibberella intermedia）［6］、尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）［7］和亞麻刺盤孢（Colletotrichum lini）［8］可以將DHEA轉(zhuǎn)化為7α，15α-diOH-DHEA。

生物體內(nèi)行使甾體羥化功能的是細(xì)胞色素P450酶（CYP450）［7］，因此CYP450表達(dá)量的高低是影響甾體底物羥化效率的關(guān)鍵因素［9］。胡東莉等［10］和Carballeira等［11］研究發(fā)現(xiàn)，包括甾體化合物、苯巴比妥鹽類和含氧化合物在內(nèi)的多種有機(jī)化合物可作為CYP450的誘導(dǎo)劑，這些誘導(dǎo)劑大多數(shù)是CYP450的底物或底物類似物，如DHEA可以使Colletotrichum liniST -1中細(xì)胞色素P450的含量以及雙羥產(chǎn)物7α，15α-diOH-DHEA的摩爾得率分別提高40%和26.9%［1］。其他誘導(dǎo)劑（如苯巴比妥、苯、己烷和乙醇等）對(duì)各種CYP450的誘導(dǎo)作用［12－14］也得到了廣泛的研究。

本課題組在前期研究中篩選獲得的一株絲狀真菌G.intermediaCA3-1［6］能夠雙羥化DHEA生成7α，15α-diOH-DHEA，當(dāng)DHEA質(zhì)量濃度為8 g／L時(shí)，7α，15α-diOH-DHEA的摩爾得率為45.3%。為了進(jìn)一步提高G.intermediaCA3-1對(duì)DHEA的雙羥化效率，本研究考察不同誘導(dǎo)劑對(duì)G.intermediaCA3-1轉(zhuǎn)化DHEA生成7α，15α-diOH-DHEA生物轉(zhuǎn)化過(guò)程的影響，并篩選確定最適誘導(dǎo)劑的添加濃度和誘導(dǎo)時(shí)間。在以上工作基礎(chǔ)上，在5 L發(fā)酵罐中比較添加苯的新工藝和不添加苯的傳統(tǒng)工藝對(duì)G.intermediaCA3-1雙羥化DHEA生成7α，15α-diOH -DHEA的影響，以期為7α，15α-diOHDHEA的工業(yè)化生產(chǎn)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

Gibberella intermediaCA3-1，中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心（CGMCC 4903）。

1.1.2 試劑

DHEA（純度為99%）、7α，15α-diOH-DHEA（純度為98.4%），浙江仙居君業(yè)藥業(yè)有限公司；乙醇、丙酮、己烷、苯、巴比妥和其他常用化學(xué)品，上海國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基（用于活化）（g／L）：葡萄糖10、酵母粉7.5、NaCl 1.5、KH2PO42.5、瓊脂20；pH 7.0～7.2。

種子培養(yǎng)基（g／L）：葡萄糖10、酵母粉7.5、NaCl 1.5、KH2PO42.5；pH7.0。

轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基（g／L）：葡萄糖15、酵母粉15、玉米漿2.0；pH 6.5。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)和轉(zhuǎn)化方法

將保藏的G.intermediaCA3-1菌株進(jìn)行活化培養(yǎng)后，將菌種接種至裝有50 mL種子培養(yǎng)液的500 mL三角瓶中，在30℃、200 r／min的恒溫?fù)u床上培養(yǎng)。待菌體進(jìn)入快速生長(zhǎng)期（接種后24 h），將種子液以體積分?jǐn)?shù)為10%的接種量接種至裝有30 mL轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，在相同條件下進(jìn)行轉(zhuǎn)化培養(yǎng)。準(zhǔn)確稱取8 g／L的DHEA添加到已轉(zhuǎn)化培養(yǎng)24 h的菌液中，在相同條件下繼續(xù)轉(zhuǎn)化72 h。

1.2.2 誘導(dǎo)劑對(duì)G.intermediaCA3-1生物轉(zhuǎn)化的影響

G.intermediaCA3-1轉(zhuǎn)化培養(yǎng)12 h后，分別將不同誘導(dǎo)劑（己烷、苯、丙酮、無(wú)水乙醇、DHEA和巴比妥）添加至培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)。其中，己烷、苯、丙酮和乙醇的添加體積分?jǐn)?shù)為0.6%，DHEA和巴比妥的添加體積分?jǐn)?shù)為0.2%，同時(shí)以不添加誘導(dǎo)劑時(shí)的生物轉(zhuǎn)化過(guò)程作為對(duì)照。

1.2.3 分析方法

CYP450的含量用Guengerich等［15］研究的CO差異光譜法測(cè)定，具體計(jì)算見(jiàn)式（1）。

式中：ΔA450為通入CO后添加連二亞硫酸鈉的樣品在450 nm處的吸光度之差；ΔA490為只添加連二亞硫酸鈉的樣品在490 nm處的吸光度之差；ε450為CYP450酶的摩爾吸光系數(shù)（91 mmol／（L·cm））。分別比較添加最佳誘導(dǎo)劑和對(duì)照組的CYP450含量。

采用干質(zhì)量法測(cè)定菌體生物量。將發(fā)酵液以12 000 r／min的轉(zhuǎn)速離心10 min，然后收集沉淀的菌絲體用蒸餾水洗滌2次，將洗滌過(guò)的菌絲體樣品在80℃下干燥至恒質(zhì)量。

采用高效液相色譜法（HPLC）分析轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。測(cè)試條件：色譜柱為Agilent C18柱；流動(dòng)相V（乙腈）∶V（水）＝70∶30；流速為0.5 mL／min；進(jìn)樣量為10 μL；柱溫為30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為206 nm。產(chǎn)物7α，15α-diOH-DHEA摩爾得率的計(jì)算見(jiàn)式（2）。

式中：ρP為產(chǎn)物7α，15αdiOHDHEA的質(zhì)量濃度（g／L）；ρS為投加底物質(zhì)量濃度（8 g／L）；MS為底物DHEA的 摩 爾 質(zhì) 量（288 g／mol）；MP為 產(chǎn) 物7α，15α-diOH-DHEA的摩爾質(zhì)量（320 g／mol）。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

本研究中的數(shù)據(jù)均采用SPSS軟件進(jìn)行分析，利用ANOVA來(lái)驗(yàn)證統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果，用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的方式（mean±SD）來(lái)顯示統(tǒng)計(jì)結(jié)果的處理，當(dāng)結(jié)果中的P＜0.05時(shí)，表示數(shù)據(jù)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同誘導(dǎo)劑對(duì)G.intermedia CA3-1生物轉(zhuǎn)化DHEA的影響

DHEA的羥化與微生物體內(nèi)的CYP450有關(guān)，而CYP450可以通過(guò)DHEA、己烷、巴比妥等化合物進(jìn)行誘導(dǎo)［1，12－14］。因此，考察6種已被證實(shí)可作為CYP450誘導(dǎo)劑的有機(jī)化合物（己烷、苯、丙酮、乙醇、DHEA和巴比妥）對(duì)G.intermediaCA3-1生物轉(zhuǎn)化DHEA的影響，結(jié)果如表1所示。

表1 不同誘導(dǎo)劑對(duì)G.intermedia CA3-1生物轉(zhuǎn)化DHEA的影響Table 1 Effects of different inducers on the DHEA bioconversion by G.intermedia CA3-1

由表1可知：與對(duì)照組相比，在添加水溶性誘導(dǎo)劑丙酮、乙醇和巴比妥后，7α，15α-diOH-DHEA的摩爾得率降低；而在添加脂溶性誘導(dǎo)劑己烷、苯和DHEA后，7α，15α-diOH-DHEA的摩爾得率與對(duì)照組相比分別提高了8.5%、17.8%和14.2%。其中，在苯的誘導(dǎo)下，7α，15α-diOH-DHEA的最高摩爾產(chǎn)率達(dá)到54.0%±1.43%，因此選擇苯作為最佳誘導(dǎo)劑。

2.2 苯的添加量對(duì)G.intermedia CA3-1生物轉(zhuǎn)化DHEA的影響

誘導(dǎo)劑的添加量對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)及產(chǎn)品的產(chǎn)量是至關(guān)重要的，如果誘導(dǎo)的用量過(guò)低起不到誘導(dǎo)作用，若用量過(guò)高則會(huì)抑制菌體的生長(zhǎng)和代謝。因此，考察不同體積分?jǐn)?shù)的苯對(duì)菌株生物量和7α，15α-diOH-DHEA摩爾得率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1。圖1可知：當(dāng)苯的體積分?jǐn)?shù)＞1.0%時(shí)，細(xì)胞的生長(zhǎng)受到顯著抑制，導(dǎo)致產(chǎn)物7α，15α-diOH-DHEA的摩爾得率較低；當(dāng)苯的體積分?jǐn)?shù)為0.2%～0.8%時(shí)，苯對(duì)細(xì)胞幾乎沒(méi)有毒性，特別是當(dāng)苯的體積分?jǐn)?shù)為0.8%時(shí)，7α，15α-diOH-DHEA的摩爾得率達(dá)到最高（57%±1.24%），比對(duì)照組提高了24%。因此，確定苯的最佳添加體積分?jǐn)?shù)為0.8%。

圖1 苯體積分?jǐn)?shù)對(duì)G.intermedia CA3-1生物轉(zhuǎn)化DHEA的影響。Fig.1 Effects of benzene concentrations on the DHEA bioconversion by G.intermedia CA3-1

2.3 苯的添加時(shí)間對(duì)G.intermedia CA3-1生物轉(zhuǎn)化DHEA的影響

由于酶的活性隨細(xì)胞的生長(zhǎng)期變化而變化，所以誘導(dǎo)劑的添加時(shí)間通常在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期［16］。本研究前期對(duì)G.intermediaCA3-1的生長(zhǎng)曲線進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，G.intermediaCA3-1接種后0～12 h為菌體生長(zhǎng)的延滯期，16～28 h為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，28 h進(jìn)入穩(wěn)定期。在此基礎(chǔ)上，為了確定苯誘導(dǎo)CYP450轉(zhuǎn)化生成7α，15α-diOH-DHEA的最佳添加時(shí)間，在G.intermedia生長(zhǎng)不同時(shí)期（接種后0、4、8、12、16和20 h）添加體積分?jǐn)?shù)0.8%苯進(jìn)行誘導(dǎo)，在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)結(jié)束時(shí)（轉(zhuǎn)化24 h）添加8 g／L DHEA進(jìn)行轉(zhuǎn)化，結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知：當(dāng)苯的添加時(shí)間為接種后12 h時(shí)，7α，15α-diOH-DHEA的摩爾得率達(dá)到最高（59%±0.97%），這可能是這時(shí)菌體開(kāi)始進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，生長(zhǎng)速度快，因此誘導(dǎo)效果較好；當(dāng)苯的添加時(shí)間晚于12 h時(shí)，7α，15α-diOH-DHEA的摩爾得率明顯下降。因此，對(duì)于苯誘導(dǎo)生物轉(zhuǎn)化過(guò)程的最適條件：在接種后第12小時(shí)后添加0.8%苯，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期結(jié)束時(shí)（轉(zhuǎn)化24 h）添加8 g／L DHEA進(jìn)行轉(zhuǎn)化。

圖2 苯的添加時(shí)間對(duì)G.intermedia CA3-1生物轉(zhuǎn)化DHEA的影響Fig.2 Effect of the time point of addition of benzene on the DHEA bioconversion by G.intermedia CA3-1

2.4 5 L發(fā)酵罐中苯誘導(dǎo)生物轉(zhuǎn)化過(guò)程

在5 L發(fā)酵罐中進(jìn)一步研究苯誘導(dǎo)G.intermediaCA3-1的生物轉(zhuǎn)化過(guò)程，結(jié)果如圖3所示。

圖3 苯誘導(dǎo)G.intermedia CA3-1生物轉(zhuǎn)化DHEA的時(shí)間曲線Fig.3 Time curves of benzene induction process from DHEA by G.intermedia CA3-1

由圖3可知：在苯誘導(dǎo)的生物轉(zhuǎn)化過(guò)程中，G.intermediaCA3-1的雙羥化效率顯著提高，7α，15α-diOH-DHEA的摩爾得率在88 h時(shí)達(dá)到最高（68.7%±1.37%），比對(duì)照組提高了29.6%。此外，轉(zhuǎn)化周期比對(duì)照組的（96 h）縮短了8 h。

2.5 苯的誘導(dǎo)對(duì)CYP450表達(dá)的影響

雖然Gut等［17］研究發(fā)現(xiàn)，苯對(duì)動(dòng)物細(xì)胞的CYP450有誘導(dǎo)作用，但苯對(duì)微生物的CYP450誘導(dǎo)作用的研究較少，因此考察苯對(duì)絲狀真菌CYP450的誘導(dǎo)作用。為了確認(rèn)苯是否會(huì)影響G.intermediaCA3-1中CYP450的濃度，所以分別測(cè)定對(duì)照組以及苯誘導(dǎo)過(guò)程中CYP450的濃度，結(jié)果見(jiàn)圖4。

由圖4可知：在苯誘導(dǎo)的生物轉(zhuǎn)化過(guò)程中，CYP450的含量顯著提高，并且在80 h時(shí)達(dá)到最高（263 pmol／L），比對(duì)照組的提高了43%。研究證實(shí)，苯對(duì)CYP450的誘導(dǎo)表現(xiàn)為自誘導(dǎo)作用，即苯為所誘導(dǎo)產(chǎn)物CYP450的底物［18］。因此推測(cè)，苯可作為CYP450的底物誘導(dǎo)CYP450的表達(dá)進(jìn)而提高CYP450的濃度。

圖4 苯誘導(dǎo)生物轉(zhuǎn)化過(guò)程對(duì)CYP450濃度的影響Fig.4 Effects of the benzene induction biotransformation process on the concentration of CYP450

3 結(jié)論

將苯作為絲狀真菌G.intermediaCA3-1中CYP450的誘導(dǎo)劑并研究其對(duì)G.intermediaCA3-1雙羥化DHEA的影響。通過(guò)單因素試驗(yàn)確定基于苯誘導(dǎo)的新型生物轉(zhuǎn)化工藝的最適條件：接種量為10%（體積分?jǐn)?shù)）、苯的添加體積分?jǐn)?shù)為0.8%、苯的添加時(shí)間為接種后12 h、底物的添加時(shí)間為轉(zhuǎn)化24 h后，此時(shí)產(chǎn)物摩爾得率達(dá)到最高的59%±0.97%?；谝陨瞎ぷ骰A(chǔ)，在5 L發(fā)酵罐上進(jìn)行放大研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在苯誘導(dǎo)下，CYP450的濃度比對(duì)照組的提高43%，7α，15α-diOH-DHEA的摩爾得率提高到68.7%±1.37%，同時(shí)轉(zhuǎn)化期縮短8 h。本研究為工業(yè)化生產(chǎn)7α，15α-diOH-DHEA奠定了良好的基礎(chǔ)。然而，對(duì)于苯誘導(dǎo)CYP450表達(dá)的具體機(jī)制還有待進(jìn)一步明確，這將是我們今后研究的方向。