紀(jì)璐璐，馬小軍，高教琪，周雍進(jìn)

（1.中國(guó)科學(xué)院 大連化學(xué)物理研究所，遼寧 大連116023；2.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京100049）

資源短缺和環(huán)境惡化迫切需要我們探索新型能源以滿足日益增長(zhǎng)的生物煉制需求。甲醇是結(jié)構(gòu)最為簡(jiǎn)單的飽和一元醇，主要來自煤化工行業(yè)的副產(chǎn)物或由天然氣催化合成［1－2］，生產(chǎn)工藝成熟，是一種來源廣泛、價(jià)格低廉的可替代原料［3］。與常用的發(fā)酵底物糖類相比，甲醇具有更強(qiáng)的還原力，能夠?yàn)楫愒串a(chǎn)物合成提供更多驅(qū)動(dòng)力［4］。由于我國(guó)“缺油、少氣、富煤”的能源結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，近年來國(guó)內(nèi)的甲醇產(chǎn)能和產(chǎn)量大幅增長(zhǎng)，因此低價(jià)格、高能效的甲醇有望成為潛在的理想細(xì)胞工廠能夠利用的底物［5］。

自然界中，存在一類天然甲醇代謝微生物——甲基營(yíng)養(yǎng)型微生物，它們能夠利用各種還原碳化合物（如甲醇等）作為碳源和能量來源［6］，主要包括甲基營(yíng)養(yǎng)型細(xì)菌和甲醇酵母。目前，已鑒定出四類甲醇酵母，包括巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris）、白色念珠菌（Candida albicans）、多形漢遜酵母（Ogataea polymorpha）和甲醇畢赤酵母（P.methanolica）［7］，其中，多形漢遜酵母以其獨(dú)特的甲醇吸收特性［7］、較短的發(fā)酵周期、較高的發(fā)酵菌體密度以及耐高溫的優(yōu)良特性，成為外源基因表達(dá)及細(xì)胞工廠構(gòu)建的優(yōu)良宿主。

首先，漢遜酵母作為一種耐熱微生物，其最適生長(zhǎng)溫度為37～43℃，最高生長(zhǎng)溫度可達(dá)48℃［8－9］，在45～50℃的條件下可將葡萄糖和木糖轉(zhuǎn)化為乙醇［10］。其次，作為異源蛋白生產(chǎn)的優(yōu)良宿主，漢遜酵母能夠避免分泌高度糖基化的蛋白，而且少量的內(nèi)源蛋白分泌也有利于分泌產(chǎn)物的下游加工過程［11－13］。最后，多形漢遜酵母還被廣泛用于過氧化物酶體改造的基礎(chǔ)研究［9］。過氧化物酶體是由一層單位膜包裹的囊泡，在甲醇代謝過程中發(fā)揮重要作用。在葡萄糖代謝與甲醇代謝的轉(zhuǎn)換過程中，漢遜酵母細(xì)胞內(nèi)過氧化物酶體的數(shù)量、大小、形態(tài)以及合成與降解均受到較為嚴(yán)謹(jǐn)?shù)恼{(diào)控［14－16］，使其成為極具吸引力的模型生物，用以研究過氧化物酶體形成和降解的分子機(jī)制。

因此，無論是作為高附加值產(chǎn)物和蛋白的異源生產(chǎn)宿主，還是用于研究甲醇與過氧化物酶體代謝的相關(guān)機(jī)制，漢遜酵母均需要進(jìn)行不同程度的分子改造。特別是在代謝工程改造中，代謝通路基因的簡(jiǎn)單共表達(dá)并不能實(shí)現(xiàn)目標(biāo)產(chǎn)物的高產(chǎn)，所以需要優(yōu)化目標(biāo)產(chǎn)物通路的通量來消除動(dòng)力學(xué)瓶頸［17－18］。同樣，復(fù)雜的合成生物學(xué)也需要多個(gè)基因協(xié)調(diào)、平衡共表達(dá)［19－21］。為了滿足這些需求，需要多種不同強(qiáng)度、不同特性的啟動(dòng)子來協(xié)調(diào)多基因的表達(dá)。在漢遜酵母表達(dá)系統(tǒng)中應(yīng)用最多的內(nèi)源啟動(dòng)子是漢遜酵母甲醇氧化酶（methanol oxidase）基因啟動(dòng)子PMOX（PAOX）和組成型強(qiáng)啟動(dòng)子——甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）基因啟動(dòng)子PGAP［22］，質(zhì)膜H＋－ATP酶（plasma membrane H（＋）-ATPase）基因啟動(dòng)子PPMA1也在多形漢遜酵母中成功應(yīng)用于異源蛋白的表達(dá)［13，23］。但是，總體來說，在漢遜酵母中，可用的內(nèi)源啟動(dòng)子相對(duì)匱乏，無法滿足高效遺傳改造的需求。

因此，本研究中，筆者挖掘漢遜酵母糖酵解途徑及活性氧（ROS）防御途徑相關(guān)基因啟動(dòng)子，通過報(bào)告基因GFPuv檢測(cè)啟動(dòng)子的表達(dá)強(qiáng)度，分析其對(duì)不同碳源（葡萄糖和甲醇）響應(yīng)情況，確定啟動(dòng)子的表達(dá)類型與強(qiáng)度，從而拓寬漢遜酵母代謝改造過程中啟動(dòng)子的選擇范圍，為漢遜酵母利用不同碳源（葡萄糖和甲醇）進(jìn)行代謝工程改造以及基礎(chǔ)應(yīng)用研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

高保真PCR酶、2×Taq Master Mix（Dye Plus）和一步克隆酶（ClonExpressⅡOne Step Cloning Kit）等，南京諾唯贊生物科技有限公司；T4 DNA連接酶等，TaKaRa公司；質(zhì)粒提取試劑盒、PCR純化試劑盒以及膠回收試劑盒，Omega公司；甲醇、葡萄糖、瓊脂粉、無水KH2PO4、各種氨基酸試劑以及各種維他命試劑等，生工生物工程（上海）股份有限公司；（NH4）2SO4、MgSO4以及痕量金屬（trace metal）溶液中的各種試劑，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；蛋白胨、酵母粉，Oxoid公司。

ZQZY-CF8型三層組合全溫振蕩培養(yǎng)箱，上海知楚儀器有限公司；Heraeus Multifuge X1R型離心機(jī)，賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；1-15PK型高速冷凍離心機(jī)，Sigma公司；Eppendorf 5425型離心機(jī)，Eppendorf公司；HPX -9052 MBE型電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療儀器設(shè)備廠；DW-86L626型超低溫保存箱，Haier公司；超純水系統(tǒng)，美國(guó)Millipore公司；TECAN SPARK酶標(biāo)儀，帝肯（上海）貿(mào)易有限公司；TaKaRa PCR儀，寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 菌株及培養(yǎng)條件

大腸桿菌DH5α菌株用于質(zhì)粒構(gòu)建與培養(yǎng)。多形漢遜酵母野生型菌株NCYC 495-3購(gòu)于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心（CGMCC 2.2412），作為宿主表達(dá)GFPuv。

DH5α菌株在LB培養(yǎng)基（5 g／L酵 母 粉、10 g／L胰蛋白胨、10 g／L NaCl）中培養(yǎng)。漢遜酵母菌株在SD培養(yǎng)基（20 g／L葡萄糖、6.7 g／L YNB）或基礎(chǔ)鹽離子培養(yǎng)基（20 g／L葡萄糖或10 g／L甲醇、14.4 g／L KH2PO4、2.5 g／L（NH4）2SO4、0.5 g／L MgSO4·7H2O）中進(jìn)行培養(yǎng)，必要時(shí)補(bǔ)充響應(yīng)的氨基酸成分。細(xì)胞均在37℃、220 r／min條件下振蕩培養(yǎng)。

1.3 啟動(dòng)子-GFPuv表達(dá)菌株的構(gòu)建

篩選基因起始密碼子上游1 000 bp的序列作為啟動(dòng)子序列，使用諾唯贊高保真酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所需引物及序列如表1所示。以PAOX啟動(dòng)子作為對(duì)照組。表達(dá)載體構(gòu)建流程如圖1所示。

圖1 重組質(zhì)粒構(gòu)建策略Fig.1 Map of recombinant plasmid construction strategy

表1 構(gòu)建表達(dá)載體的引物Table 1 Primer list for expression vector construction

續(xù)表

將PCR擴(kuò)增得到的啟動(dòng)子及GFPuv片段進(jìn)行 融合PCR得到啟動(dòng)子GFPuv片段，通過T4 DNA連接酶或一步克隆酶進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)入大腸桿菌進(jìn)行篩選與培養(yǎng)，采用相應(yīng)抗生素（博來霉素及氨芐青霉素）篩選，得到的克隆轉(zhuǎn)化子經(jīng)驗(yàn)證后，提取質(zhì)粒酶切再驗(yàn)證后，陽性克隆送生工生物工程（上海）股份有限公司基因測(cè)序；最終將測(cè)序結(jié)果正確的質(zhì)粒通過電轉(zhuǎn)化［24］的方法轉(zhuǎn)化至漢遜酵母NCYC 495-3中進(jìn)行篩選。

1.4 報(bào)告基因活性檢測(cè)

漢遜酵母GFPuv表達(dá)菌株在基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基（葡萄糖為碳源）37℃預(yù)培養(yǎng)48 h，以不含碳源的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞2次，初始OD600為0.1轉(zhuǎn)接至20 mL以葡萄糖為碳源的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基（初始OD600為0.2轉(zhuǎn)接至20 mL以甲醇為碳源的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基）。綠色熒光蛋白的熒光值一般在16～18 h時(shí)達(dá)到最大［25］，但考慮到漢遜酵母在甲醇培養(yǎng)基中生長(zhǎng)較為緩慢，因此在葡萄糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)24、48及72 h取樣檢測(cè)生物量OD600及熒光值，在甲醇培養(yǎng)基中培養(yǎng)72 h取樣檢測(cè)生物量OD600及熒光值。取稀釋至OD為0.2～0.8的細(xì)胞培養(yǎng)液2 mL，使用紫外分光光度計(jì)在600 nm處檢測(cè)吸光度；細(xì)胞洗滌1次且稀釋至OD600約為1.0，取200 μL至96孔板，使用酶標(biāo)儀（TECAN SPARK）進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果與討論

2.1 糖酵解及活性氧（ROS）防御途徑啟動(dòng)子的挖掘

漢遜酵母菌株DL -1和菌株NCYC 495均進(jìn)行了全基因組測(cè)序與分析［15，26］，根據(jù)基因組序列信息，通過BLAST比對(duì)得到漢遜酵母中目標(biāo)基因的序列信息。酵母啟動(dòng)子長(zhǎng)度可能存在較大差異。釀酒酵母啟動(dòng)子長(zhǎng)度的中位數(shù)為455 bp，也有其他長(zhǎng)度如800和1 000 bp等的例子，啟動(dòng)子長(zhǎng)度因基因種類、功能不同而存在差異［27］。畢赤酵母使用1 000 bp長(zhǎng)度或者從起始密碼子與上游基因之間的序列作為啟動(dòng)子［18，28］。本研究使用起始密碼子上游1 000 bp序列作為漢遜酵母啟動(dòng)子，并利用SnapGene軟件設(shè)計(jì)相應(yīng)目標(biāo)啟動(dòng)子的上下游引物。

本研究中，筆者篩選漢遜酵母糖酵解途徑及ROS防御途徑啟動(dòng)子，以GFPuv為報(bào)告基因，構(gòu)建不同啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的表達(dá)載體，以不同碳源（葡萄糖與甲醇）為底物搖瓶培養(yǎng)，以熒光值大小評(píng)價(jià)啟動(dòng)子表達(dá)強(qiáng)度，具體流程如圖2所示。

圖2 實(shí)驗(yàn)流程示意Fig.2 Overview of experimental flow

2.2 GFPuv激發(fā)光譜與發(fā)射光譜

GFPuv是綠色熒光蛋白GFP的一種變體，本研究中，使用GFPuv作為報(bào)告基因用以啟動(dòng)子表達(dá)水平的檢測(cè)，因此，有必要對(duì)報(bào)告基因GFPuv的激發(fā)光譜與發(fā)射光譜進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，以確定GFPuv的最大激發(fā)波長(zhǎng)與發(fā)射波長(zhǎng)。

圖3為GFPuv激發(fā)與發(fā)射光譜。由圖3可知，GFPuv激發(fā)和發(fā)射光譜的最大峰分別在396和510 nm處，與文獻(xiàn)［29］的結(jié)果一致。因此，選擇396 nm作為激發(fā)波長(zhǎng)，510 nm作為發(fā)射波長(zhǎng)。

圖3 報(bào)告基因GFPuv激發(fā)光譜與發(fā)射光譜Fig.3 Excitation and emission spectra of reporter gene GFPuv

2.3 糖酵解途徑啟動(dòng)子篩選

多形漢遜酵母糖代謝途徑啟動(dòng)子及其表達(dá)水平如圖4所示。

圖4（a）為多形漢遜酵母糖代謝途徑。根據(jù)圖4（a）篩選出代謝過程中所涉及部分基因的啟動(dòng)子，構(gòu)建不同的質(zhì)粒表達(dá)載體，通過檢測(cè)其熒光值，即可得到不同啟動(dòng)子的表達(dá)強(qiáng)度，為漢遜酵母代謝工程改造提供更多調(diào)控元件。

2.3.1 單一葡萄糖培養(yǎng)條件下啟動(dòng)子的表達(dá)

通過報(bào)告基因GFPuv表達(dá)檢測(cè)啟動(dòng)子的強(qiáng)度，菌株以葡萄糖作為碳源，在基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，用酶標(biāo)儀檢測(cè)24、48及72 h時(shí)的熒光強(qiáng)度。糖代謝途徑涉及的啟動(dòng)子表達(dá)GFPuv的強(qiáng)度如圖4（b）～（d）所示。

由圖4（b）～（d）可知：在單一葡萄糖條件下，啟動(dòng)子PADH2-1與PGAP驅(qū)動(dòng)的GFPuv熒光強(qiáng)度較高，且表達(dá)強(qiáng)度分別是相同條件下PAOX的9倍（圖4（d））和7倍（圖4（b））；其中，啟動(dòng)子PADH2-1在48 h時(shí)表達(dá)水平最高，啟動(dòng)子PGAP在72 h時(shí)表達(dá)水平略高于48 h時(shí)的表達(dá)水平。啟動(dòng)子PAOX與PPFK2驅(qū)動(dòng)的報(bào)告基因表達(dá)相當(dāng)，都不足PGAP表達(dá)強(qiáng)度的20%。啟動(dòng)子PGPI與PPGM1表達(dá)強(qiáng)度則更弱，并且啟動(dòng)子PPGM1的表達(dá)強(qiáng)度隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而減弱。

2.3.2 單一甲醇培養(yǎng)條件下啟動(dòng)子的表達(dá)

將選定的糖酵解途徑啟動(dòng)子克隆到綠色熒光蛋白GFPuv，并以甲醇為碳源培養(yǎng)菌株，并檢測(cè)培養(yǎng)72 h報(bào)告基因熒光強(qiáng)度，結(jié)果如圖4（c）所示。

由圖4（c）可知：以甲醇為唯一碳源培養(yǎng)72 h，啟動(dòng)子PADH2-1與PGAP驅(qū)動(dòng)的GFPuv表達(dá)量與葡萄糖條件下的相比基本相當(dāng)，無明顯差異且表達(dá)水平高，與PAOX在甲醇條件下的表達(dá)強(qiáng)度相當(dāng)，啟動(dòng)子PADH2-1與PGAP表現(xiàn)為強(qiáng)組成型表達(dá)；啟動(dòng)子PAOX在甲醇條件下驅(qū)動(dòng)GFPuv表達(dá)量遠(yuǎn)高于葡萄糖條件（約10倍）下的，表現(xiàn)出明顯的強(qiáng)甲醇誘導(dǎo)型；啟動(dòng)子PPGM2在甲醇條件下的表達(dá)水平約為葡萄糖條件下的4倍，同樣表現(xiàn)為甲醇誘導(dǎo)型，但其表達(dá)強(qiáng)度遠(yuǎn)低于PAOX啟動(dòng)子。啟動(dòng)子PPFK2及PGPI在2種碳源（葡萄糖和甲醇）條件下，表達(dá)水平無明顯差異，為組成型表達(dá)，但表達(dá)強(qiáng)度分別為PGAP啟動(dòng)子的20%和10%。

圖4 漢遜酵母糖代謝途徑啟動(dòng)子及其表達(dá)水平Fig.4 Promoters of sugar metabolism pathway in O.palymorpha and its expression level

2.4 ROS防御途徑啟動(dòng)子篩選

甲基營(yíng)養(yǎng)酵母在甲醇氧化、氧化磷酸化及其他代謝過程中會(huì)產(chǎn)生過氧化氫（H2O2）和ROS，為防止其對(duì)細(xì)胞成分造成不可逆氧化損傷［15］，細(xì)胞自身會(huì)啟動(dòng)ROS防御機(jī)制，以消除其影響。

2.4.1 單一葡萄糖條件下培養(yǎng)ROS防御途徑的啟動(dòng)子表達(dá)

以ROS途徑（圖5（a））涉及啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)報(bào)告基因GFPuv的表達(dá)，單一葡萄糖條件下熒光檢測(cè)結(jié)果如圖5（b）所示。由圖5（b）可知：以葡萄糖為碳源對(duì)漢遜酵母進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，4種超氧化物歧化酶驅(qū)動(dòng)的報(bào)告基因均有表達(dá)，只是表達(dá)強(qiáng)度存在明顯差異，其中以PSOD1表達(dá)強(qiáng)度最高，比同條件下PAOX驅(qū)動(dòng)的基因表達(dá)量高約2倍；而PSOD2、PSOD3和PSOD4啟動(dòng)的GFPuv表達(dá)量則明顯弱于PAOX驅(qū)動(dòng)的基因表達(dá)量，約為PAOX的50%，且PSOD3隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，其表達(dá)強(qiáng)度呈下降趨勢(shì)；啟動(dòng)子PGLR、PMSR在葡萄糖條件下基本無熒光表達(dá)。

2.4.2 單一甲醇條件下培養(yǎng)ROS防御途徑的啟動(dòng)子表達(dá)

以ROS防御途徑涉及啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)報(bào)告基因GFPuv的表達(dá)，單一甲醇條件下的熒光檢測(cè)結(jié)果如圖5（c）所示。由圖5（c）可知：除啟動(dòng)子PGLR外，ROS防御途徑涉及的啟動(dòng)子在以甲醇為唯一碳源時(shí)，啟動(dòng)子均可以啟動(dòng)報(bào)告基因的表達(dá)，并顯示出差異，其中，以PSOD1為啟動(dòng)子，表達(dá)強(qiáng)度最高，約為PAOX的1.5倍，是葡萄糖條件表達(dá)強(qiáng)度的5倍多，表現(xiàn)出明顯的甲醇誘導(dǎo)作用，屬于強(qiáng)甲醇誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，與之前的研究結(jié)果［15］一致，但與巴斯德畢赤酵母［18］中超氧化物歧化酶（SOD）啟動(dòng)子的表達(dá)強(qiáng)度則明顯不同。啟動(dòng)子PSOD3也表現(xiàn)為明顯的甲醇誘導(dǎo)特性，但表達(dá)強(qiáng)度弱，約為PAOX的20%。PSOD2和PMSR的表達(dá)則更弱。啟動(dòng)子PSOD4的表達(dá)也較弱，但在2種碳源（葡萄糖和甲醇）條件下的表達(dá)相當(dāng)，為組成型表達(dá)。

圖5 漢遜酵母ROS防御機(jī)制啟動(dòng)子及其表達(dá)水平Fig.5 Promoters of ROS defense pathway in O.polymorpha and expression level

ROS防御途徑主要的生化功能是解除ROS的毒性，因?yàn)榧?xì)胞在葡萄糖消耗過程中產(chǎn)生的ROS及在甲醇氧化過程中產(chǎn)生的H2O2對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生壓力與毒性，這促進(jìn)了途徑中的相關(guān)基因表達(dá)。因此，細(xì)胞中的ROS可作為PSOD1的激活劑，在各種脅迫條件下激活相應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子從而促進(jìn)基因的表達(dá)。

綜上所述，在挖掘鑒定的系列糖酵解途徑和ROS防御途徑中的相關(guān)啟動(dòng)子，根據(jù)各啟動(dòng)子啟動(dòng)表達(dá)的GFPuv熒光強(qiáng)度與空白對(duì)照的倍數(shù)差異，定義了強(qiáng)、中弱型啟動(dòng)子。同時(shí)，依據(jù)啟動(dòng)子在葡萄糖或甲醇條件下的熒光強(qiáng)度差異，以區(qū)分組成型和甲醇誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，以方便后續(xù)改造過程中應(yīng)用。

通過挖掘糖酵解途徑和ROS防御途徑關(guān)鍵基因啟動(dòng)子，鑒定了系列可用于代謝工程改造的不同強(qiáng)度啟動(dòng)子，結(jié)果見表2。

由表2可知：在甲醇誘導(dǎo)型表達(dá)的系列啟動(dòng)子PPGM2、PSOD1、PSOD2、PSOD3、PGSH和PMSR中，以PSOD1表達(dá)強(qiáng)度最高，PSOD3、PPGM2次之，其他啟動(dòng)子表達(dá)強(qiáng)度則很弱；在組成型表達(dá)啟動(dòng)子PPFK2、PGPI、PPGM1、PADH2-1、PADH2-2、PGAP、PGPX和PSOD4中，PADH2-1和PGAP表達(dá)水平最高，其余啟動(dòng)子表達(dá)水平均較弱。強(qiáng)啟動(dòng)子對(duì)于蛋白以及異源代謝途徑酶的表達(dá)具有重要作用。同時(shí)，弱啟動(dòng)子可用于合成生物學(xué)應(yīng)用中多基因共表達(dá)的平衡，代謝途徑過程中轉(zhuǎn)錄水平的精細(xì)調(diào)節(jié)以及代謝改造工程中旁路基因的弱化表達(dá)。

表2 漢遜酵母糖酵解和ROS防御途徑啟動(dòng)子分類Table 2 Grouping of O.polyporpha glycolysis and ROS defense promoters

3 結(jié)論與展望

啟動(dòng)子長(zhǎng)度對(duì)于代謝途徑的組裝及表達(dá)尤為重要，直接決定了基因表達(dá)盒的大小，從而影響了酵母轉(zhuǎn)化效率與整合效率。選用1 000 bp長(zhǎng)度的啟動(dòng)子進(jìn)行活性檢測(cè)，初步篩選獲得了若干可用于后續(xù)代謝工程改造的啟動(dòng)子種類。但為了減少PCR擴(kuò)增的突變概率和盡可能縮短基因表達(dá)盒大小，后續(xù)研究需要借助啟動(dòng)子分析軟件對(duì)其功能區(qū)進(jìn)行分析與預(yù)測(cè)，指導(dǎo)啟動(dòng)子的截短實(shí)驗(yàn)，期望得到最短序列啟動(dòng)子而使得基因表達(dá)水平較高。同時(shí)，在對(duì)短序列啟動(dòng)子表達(dá)強(qiáng)度檢測(cè)時(shí)，將報(bào)告基因的表達(dá)與酵母的生長(zhǎng)相耦聯(lián)，得到不同啟動(dòng)子在細(xì)胞生長(zhǎng)不同時(shí)期的表達(dá)情況。

綜上所述，作為重要的甲醇酵母，多形漢遜酵母能夠天然利用葡萄糖、木糖和甲醇等多種碳源，為其成為理想細(xì)胞工廠的底盤細(xì)胞奠定了良好基礎(chǔ)。特別是它在以甲醇作為碳源生產(chǎn)高附加值化學(xué)品的過程中，甲醇誘導(dǎo)型的啟動(dòng)子對(duì)基因在甲醇條件下的表達(dá)具有重要的指導(dǎo)作用。因此，本研究的結(jié)果將為促進(jìn)漢遜酵母葡萄糖代謝與甲醇代謝轉(zhuǎn)換奠定理論基礎(chǔ)，拓展了漢遜酵母代謝工程應(yīng)用的底物譜，也為實(shí)現(xiàn)甲醇生物轉(zhuǎn)化以及甲醇代謝基礎(chǔ)研究提供參考和應(yīng)用工具。