曹 祁，葉 天，李文惠，武紅麗，曹 飛，韋 萍

（南京工業(yè)大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，江蘇 南京211800）

生物質(zhì)在有機(jī)溶劑中經(jīng)酸催化降解，特別是在 極性非質(zhì)子溶劑中降解，具有降解速率快和降解產(chǎn)物價(jià)值高的特征［1－4］。這是因?yàn)闃O性非質(zhì)子溶劑自身接受氫質(zhì)子的傾向較弱，游離了酸電離出的氫質(zhì)子，強(qiáng)化了催化效果以及無水環(huán)境抑制水解反應(yīng)的發(fā)生，表現(xiàn)出與水中降解不同的產(chǎn)物分布［5－7］。特別是酸的氫質(zhì)子電離強(qiáng)度變化對(duì)極性非質(zhì)子溶劑中生物質(zhì)轉(zhuǎn)化效率會(huì)產(chǎn)生明顯影響。Mellmer等［8］以木糖脫水制備糠醛為模型，研究不同強(qiáng)度酸在水和γ-戊內(nèi)酯中對(duì)反應(yīng)速率的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，無論何種強(qiáng)度的酸催化劑在γ-戊內(nèi)酯中的催化活性均高于水中的，而且pKa越小則二者差別越明顯。這主要是由于在γ-戊內(nèi)酯中，減少了水分子對(duì)酸電離出的氫質(zhì)子的溶劑化作用，使得游離氫質(zhì)子濃度提高，從而增強(qiáng)了其反應(yīng)活性。Walker等［6］以左旋葡聚糖、纖維二糖等在極性非質(zhì)子溶劑（γ-戊內(nèi)酯、1，4-二氧六環(huán)和四氫呋喃）中酸催化轉(zhuǎn)化的反應(yīng)速率來判斷水含量對(duì)酸催化劑活性的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著溶劑中水含量的降低，催化脫水反應(yīng)的效率可顯著提高。

與水相中纖維素水解制備葡萄糖不同，纖維素在極性非質(zhì)子溶劑中的降解往往形成脫水糖，包括左旋葡聚糖（1，6-脫水-β-D-吡喃葡萄糖，LGA）和左旋葡糖酮（1，6-脫水-3，4-二脫氧-β-D -吡喃糖烯-2-酮，LGO）在內(nèi)的一系列脫水產(chǎn)物。這些脫水糖，不僅可以作為新的糖源用于微生物發(fā)酵［9－10］，也可利用其自身的手性中心來合成稀有糖、手性配體和手性藥物中間體［11－13］。在極性非質(zhì)子溶劑中纖維素降解制備脫水糖的產(chǎn)物分布上，酸催化劑也起到了重要作用［14－15］。He等［16］計(jì)算了不同的質(zhì)子酸催化劑對(duì)纖維素降解獲得LGO和5-羥甲基糠醛（HMF）的比率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LGO／HMF的比率隨著酸催化劑強(qiáng)度的增加而增加。但除此之外，文獻(xiàn)中涉及酸強(qiáng)度對(duì)生物質(zhì)在極性非質(zhì)子溶劑中降解影響的研究非常少。

在纖維素制備脫水糖LGA、LGO的過程中，通?？梢苑譃閮蓚€(gè)階段：一是纖維素降解形成LGA，二是LGA再脫水形成LGO（圖1中路徑①和③）。這兩步反應(yīng)往往同時(shí)發(fā)生，無法準(zhǔn)確判斷不同反應(yīng)所需的酸強(qiáng)度。為了闡明酸強(qiáng)度對(duì)纖維素降解制備脫水糖LGA、LGO的影響，考察11種不同強(qiáng)度的酸催化劑，包括：三氟甲磺酸（pKa＝－14）、氫溴酸（pKa＝－9）、濃鹽酸（pKa＝－8）、對(duì)甲苯磺酸（pKa＝－2.8）、甲磺酸（pKa＝－2.6）、濃硫酸（pKa＝－2）、三氟乙酸（pKa＝0.23）、乙二胺四乙酸（pKa＝0.9）、馬來酸（pKa＝1.92）、磷酸（pKa＝2.12）、富馬酸（pKa＝3.02）的性能。以纖維素（圖1中路徑①）或纖維素模型化合物-纖維二糖（圖1中路徑②）為原料來考察在不同強(qiáng)度酸催化降解制備LGA的催化效率；同時(shí)以LGA為原料考察不同強(qiáng)度酸催化脫水獲得LGO（圖1中路徑③）的效率以及LGA水解副反應(yīng)生成葡萄糖（圖1中路徑④）對(duì)脫水反應(yīng)的影響，為其他生物質(zhì)在極性非質(zhì)子溶劑中酸催化降解反應(yīng)提供借鑒。

圖1 纖維素或纖維二糖降解制備脫水糖及LGA水解副反應(yīng)Fig.1 Degradation of cellulose or cellobiose into LGA and LGO，LGA hydrolysis side reaction

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑

微晶纖維素（Avicel?PH -101，粒徑～50 μm）、1，4-二氧六環(huán)（無水級(jí)，含量≥99.5%），西格瑪奧德里奇公司；左旋葡聚糖和左旋葡糖酮，蘇州卡博森斯化學(xué)科技有限公司；纖維二糖（98%）和各種酸催化劑，阿拉丁試劑（上海）有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

E100型EasyChem高溫高壓反應(yīng)釜，北京世紀(jì)森朗公司；SQP型電子分析天平，德國(guó)賽多利斯公司；LC -20AD型高效液相色譜儀、GC -2014型氣相色譜儀，日本島津公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

將反應(yīng)物、1，4二氧六環(huán)以及酸催化劑依次加入反應(yīng)釜中。取樣管用孔徑75 μm鋼絲篩網(wǎng)包裹，以防止反應(yīng)液中的固體顆粒進(jìn)入取樣管路。密閉反應(yīng)釜用N2置換3次后，通入N2加壓至7 MPa。開啟攪拌，升溫至設(shè)定條件定為初始時(shí)刻t0，分別在不同時(shí)間取樣。為減少取樣時(shí)樣品溶劑氣化造成的檢測(cè)誤差，取樣管要提前放置于冰浴中冷卻。反應(yīng)結(jié)束后冷卻至室溫，排氣后取出反應(yīng)液。

1.4 產(chǎn)物的檢測(cè)方法

對(duì)反應(yīng)過程中的主要產(chǎn)物左旋葡聚糖、左旋葡糖酮以及副產(chǎn)物葡萄糖分別采用氣相色譜和液相色譜進(jìn)行檢測(cè)。

氣相色譜分析方法。色譜柱為Restek Rtx-VMS caplillary（30 m×0.25 mm，1.4 μm），檢測(cè)器為氫火焰離子化（FID）檢測(cè)器，載氣為高純He（分流比為49∶1），進(jìn)樣口溫度為240℃，檢測(cè)器溫度為240℃（升溫程序初始溫度40℃保持5 min，以升溫速率7.5℃／min升至240℃，保持15 min），柱流速為3.0 mL／min，尾吹氣流速為30 mL／min，H2流速為40 mL／min，空氣流速為400 mL／min，進(jìn)樣量為1 μL。

高效液相色譜分析方法。色譜柱為Bio -Rad Aminex HPX -87H（300 mm×7.8 mm），檢測(cè)器為示差折光檢測(cè)器和紫外檢測(cè)器，流動(dòng)相為5 mmol／L稀H2SO4水溶液；流速為0.6 mL／min，柱溫為35℃，檢測(cè)器溫度為35℃，進(jìn)樣量為10 μL。

1.5 計(jì)算方法

1.5.1 產(chǎn)物收率的計(jì)算。

產(chǎn)物收率的具體計(jì)算見式（1）。

式中：i為產(chǎn)物左旋葡聚糖、左旋葡糖酮以及副產(chǎn)物葡萄糖。

1.5.2 轉(zhuǎn)化頻率的計(jì)算

催化劑的轉(zhuǎn)化頻率（TOF）是指單位時(shí)間內(nèi)單個(gè)活性位點(diǎn)的反應(yīng)物轉(zhuǎn)化數(shù)，它可以用來衡量一個(gè)催化劑的本征活性。當(dāng)纖維二糖和LGA轉(zhuǎn)化率低于10%時(shí)，使用纖維二糖和LGA隨時(shí)間變化的濃度計(jì)算TOF，具體計(jì)算見式（2）。

式中：TOF為酸催化劑對(duì)纖維二糖或LGA的轉(zhuǎn)化頻率（ks－1）；c為反應(yīng)物的濃度（mol／L）；t為反應(yīng)時(shí)間（ks）。

1.5.3 反應(yīng)過程中活化能的計(jì)算

活化能代表反應(yīng)物的分子由初始穩(wěn)定狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨癄顟B(tài)所吸收的能量，是重要的熱力學(xué)參數(shù)。LGA脫水和水解的反應(yīng)活化能由阿倫尼烏斯公式計(jì)算［17］，具體計(jì)算見式（3）。

式中：Ea為反應(yīng)所需的活化能（kJ／mol）；k是反應(yīng)速率常數(shù)（s－1）；A是指前因子；R是摩爾氣體常數(shù)（8.314 J／（mol·K））；T是熱力學(xué)溫度（K）。

假設(shè)由LGA脫水形成LGO和水解形成葡萄糖的過程都是一級(jí)反應(yīng)過程，則有

式中：v為產(chǎn)物的生成速率（g／（L·s））；ρ為反應(yīng)物質(zhì)量濃度（g／L）。

式（3）可變?yōu)?/p>

因此，由實(shí)驗(yàn)測(cè)出不同反應(yīng)溫度下的速率常數(shù)k值后，將lnk對(duì)1/T作圖，由斜率可求出相應(yīng)活化能Ea。

2 結(jié)果與討論

2.1 酸強(qiáng)度對(duì)纖維二糖制備LGA的影響

纖維二糖是纖維素基本結(jié)構(gòu)單元，常用作纖維素的最簡(jiǎn)單模型化合物。通過考察不同強(qiáng)度酸催化纖維二糖制備LGA（圖1中路徑②）的反應(yīng)結(jié)果，可以初步篩選纖維素制備LGA最佳催化劑酸強(qiáng)度。1，4-二氧六環(huán)加入量為100 mL，纖維二糖用量為溶劑質(zhì)量的1%，各種酸催化劑的用量均以15 mmol／L H＋為標(biāo)準(zhǔn)來加入，反應(yīng)溫度190℃，反應(yīng)釜攪拌轉(zhuǎn)速600 r／min。在11種酸催化劑中，未使用濃鹽酸和富馬酸驗(yàn)證，原因是：濃鹽酸（pKa＝－8）揮發(fā)嚴(yán)重，在高溫反應(yīng)體系中揮發(fā)會(huì)更劇烈，同時(shí)，引入了大量水不利于催化反應(yīng)；而富馬酸（pKa＝3.02）酸性最弱且不能溶解在溶劑中，無法達(dá)到試驗(yàn)的目的。不同酸催化劑pKa與LGA碳收率的結(jié)果見圖2。

圖2 酸強(qiáng)度和纖維二糖生成LGA碳收率的相關(guān)性Fig.2 Correlation between the acid strength and LGA carbon yield prepared from cellobiose

由圖2可知，pKa為－3～－2的酸：對(duì)甲苯磺酸（pKa＝－2.8）、甲磺酸（pKa＝－2.6）和濃硫酸（pKa＝－2）作催化劑可獲得較好的效果，LGA的碳收率分別為45.72%、45.87%和45.17%。而當(dāng)三氟甲磺酸（pKa＝－14）和氫溴酸（pKa＝－9）作催化劑時(shí)，并沒有獲得更高的LGA碳收率（分別為31.13%和10.97%）。當(dāng)酸催化劑的pKa＞－2時(shí)，催化纖維二糖幾乎無法獲得LGA。其中，三氟乙酸（pKa＝0.23）、草酸（pKa＝1.27）為催化劑時(shí)無法檢測(cè)到LGA，以磷酸（pKa＝2.12）為催化劑時(shí)，僅得到碳收率為1.23%的LGA。

根據(jù)式（2）計(jì)算不同強(qiáng)度酸催化纖維二糖制備LGA的轉(zhuǎn)化頻率（TOF），考察酸強(qiáng)度與轉(zhuǎn)化頻率的相關(guān)性，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知：轉(zhuǎn)化頻率TOF與酸強(qiáng)度pKa呈線性相關(guān)，即催化劑的酸性越強(qiáng)，其TOF值越大，該催化劑催化纖維二糖轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)GA的速率越快。酸性最強(qiáng)的三氟甲磺酸的TOF值最大，達(dá)到85.33 ks－1；而pKa為－3～－2的對(duì)甲苯磺酸、甲磺酸和濃硫酸的TOF值接近，分別為24.37、23.04和20.67 ks－1；當(dāng)酸催化劑的pKa＞－2時(shí)，其TOF值均很低，最低僅為0.68 ks－1。

結(jié)合圖2和圖3結(jié)果分析可以發(fā)現(xiàn)：雖然pKa是不同酸在水體系中H＋的解離常數(shù)值，但也適用于不同酸在有機(jī)溶劑體系中H＋解離度的判斷。酸催化劑的pKa越小，其在極性非質(zhì)子溶劑種電離出的H＋越多，催化纖維二糖轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)GA的轉(zhuǎn)化頻率越大；反之，pKa越大，其電離出的H＋越少，則無法催化糖苷鍵斷鍵，纖維二糖轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)GA的轉(zhuǎn)化頻率越小，甚至無LGA形成。這與Mellmer等［8］研究γ-戊內(nèi)酯溶劑中酸催化木糖脫水反應(yīng)得到的結(jié)果一致。但pKa過小的酸催化劑，轉(zhuǎn)化頻率雖高，卻會(huì)造成脫水反應(yīng)過度而發(fā)生碳化現(xiàn)象，目標(biāo)產(chǎn)物L(fēng)GA的收率反而下降。為了獲得良好的纖維二糖制備LGA收率，選擇pKa為－3～－2的對(duì)甲苯磺酸、甲磺酸和濃硫酸作為催化劑比較合適。

圖3 酸強(qiáng)度與纖維二糖脫水制備TOF值的相關(guān)性Fig.3 Correlation between the acid strength and TOF value of cellobiose degradation into LGA

2.2 酸強(qiáng)度對(duì)纖維素LGA的影響

在纖維二糖酸催化制備LGA的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步考察不同強(qiáng)度酸催化劑催化纖維素制備脫水糖LGA（圖1中的反應(yīng)路徑①）的反應(yīng)。反應(yīng)條件與前述相同。在這里未選用磷酸，是因?yàn)槠鋚Ka為2.12，與pKa為1.92的馬來酸酸性強(qiáng)弱相近。不同酸催化劑pKa與LGA碳收率的結(jié)果見圖4。

圖4 酸強(qiáng)度和纖維素生成LGA碳收率的相關(guān)性Fig.4 Correlation between the acid strength and LGA carbon yield prepared from cellulose

由圖4可知：采用纖維素為反應(yīng)物時(shí)，不同強(qiáng)度酸催化獲得的LGA收率與纖維二糖作反應(yīng)物時(shí)相似，pKa為－3～－2的酸催化可獲得較好的LGA收率。其中，對(duì)甲苯磺酸（pKa＝－2.8）、甲 磺 酸（pKa＝－2.6）和濃硫酸（pKa＝－2）為催化劑時(shí)，LGA的碳收率分別為36.01%、33.56%和36.28%。三氟甲磺酸、氫溴酸和濃鹽酸為催化劑時(shí)，纖維素的碳化程度非常嚴(yán)重，所得LGA的碳收率為15%～20%；pKa大于－2的酸為催化劑時(shí)，幾乎無LGA生成。因此，在纖維二糖中考察的酸強(qiáng)度結(jié)果也適用于纖維素降解過程，pKa為－3～－2的酸催化劑對(duì)纖維素制備脫水糖有良好的催化作用。

2.3 酸強(qiáng)度對(duì)LGA脫水制備LGO的影響

與酸催化纖維素或纖維二糖形成LGA不同，LGA進(jìn)一步形成LGO需要脫除2分子水，所需的酸強(qiáng)度會(huì)更大。以1 g LGA為反應(yīng)物，在100 mL 1，4-二氧六環(huán)、190℃條件下，各種酸催化劑的用量標(biāo)準(zhǔn)為15 mmol／L H＋，考察不同強(qiáng)度酸催化劑催化LGA制備脫水糖LGO（圖1中的反應(yīng)路徑③）的影響。選擇了在2.1和2.2節(jié)中具有典型催化特性的8種酸催化劑，不同酸催化劑pKa與LGO、葡萄糖的碳收率結(jié)果見圖5。

圖5 不同強(qiáng)度酸催化LGA生成LGO和葡萄糖的碳收率Fig.5 Carbon yield of LGO and glucose from LGA with different acid catalysts

由圖5可知：對(duì)甲苯磺酸（pKa＝－2.8）、甲磺酸（pKa＝－2.6）和濃硫酸（pKa＝－2）為催化劑時(shí)，LGO的碳收率分別為34.41%、32.49%和36.91%，LGO碳收率與葡萄糖碳收率比值分別為5.1、4.1和5.5；而 當(dāng) 三 氟 甲 磺 酸（pKa＝－14）和 氫 溴 酸（pKa＝－9）為 催 化 劑 時(shí)，LGO的 碳 收 率 分 別 為20.65%和16.01%的，LGO與葡萄糖碳收率的比值降至1.3；當(dāng)催化劑酸性減弱時(shí)，LGO的收率反而低于葡萄糖的收率，兩者收率比值降至0.48，甚至三氟乙酸（pKa＝0.23）為催化劑時(shí)，僅有葡萄糖生成。這表明在脫水反應(yīng)過程中，催化劑酸強(qiáng)度的選擇極大地影響LGO的生成。pKa為－3～－2的酸催化劑均有較好的催化效果，而酸性過強(qiáng)和過弱對(duì)LGO的生成均無良好的催化效果。同時(shí)，在LGA脫水生成LGO時(shí)，總會(huì)伴有LGA水解產(chǎn)物葡萄糖的生成。

根據(jù)式（2）計(jì)算不同酸催化LGA脫水反應(yīng)的轉(zhuǎn)化頻率，考察酸強(qiáng)度與LGA到LGO轉(zhuǎn)化頻率的相關(guān)性，結(jié)果見圖6。由圖6可知：LGA到LGO轉(zhuǎn)化頻率（TOF）隨酸強(qiáng)度的增大而減小。pKa最小的三氟甲磺酸的TOF值也最大（24.57 ks－1），以至于其催化LGA脫水時(shí)，LGA的轉(zhuǎn)化頻率過快，反應(yīng)進(jìn)程甚至難以監(jiān)測(cè)；而pKa為－3～－2的對(duì)甲苯磺酸、甲磺酸和濃硫酸的TOF值相近，均在5 ks－1左右；pKa＞－2時(shí)，TOF值均很低，磷酸（pKa＝2.12）的TOF值最低（0.06 ks－1），無法催化LGA脫水制備LGO。

圖6 酸強(qiáng)度和LGA脫水制備LGO轉(zhuǎn)化頻率的相關(guān)性Fig.6 Correlation between the acid strength and the TOF value of LGA dehydration into LGO

2.4 LGA水解至葡萄糖和脫水至LGO兩條途徑的動(dòng)力學(xué)

在LGA脫水制備LGO的過程中，總會(huì)伴隨產(chǎn)生部分葡萄糖，這主要來自于LGA的水解。在考察不同酸催化LGA脫水制備LGO的過程中，發(fā)現(xiàn)葡萄糖的生成量也與酸強(qiáng)度存在一定的關(guān)系。因此，選擇催化效果較好的3種催化劑與水解產(chǎn)生葡萄糖相對(duì)較多的三氟甲磺酸催化劑進(jìn)行比較。在100 mL 1，4-二氧六環(huán)中，4種酸催化劑的用量仍為15 mmol／L H＋，在反應(yīng)過程中定時(shí)取樣測(cè)定LGO和葡萄糖濃度隨時(shí)間變化，分別計(jì)算LGA脫水和水解兩條途徑（圖1中的反應(yīng)路徑③和④）的反應(yīng)速率常數(shù)和活化能，其結(jié)果見表1。

由表1可知：無論是水解途徑還是脫水途徑，隨著溫度升高，其反應(yīng)速率常數(shù)均提高；在使用酸性最強(qiáng)的三氟甲磺酸為催化劑時(shí)，即使在110、130和150℃這3個(gè)低溫反應(yīng)條件下，脫水反應(yīng)和水解反應(yīng)的速率常數(shù)k都比另外3種酸為催化劑在150、170和190℃高溫條件下的速率常數(shù)k大。由此可見，酸性增強(qiáng)會(huì)大大加快反應(yīng)速率。同時(shí)，脫水反應(yīng)和水解反應(yīng)的活化能均隨酸性增強(qiáng)而降低，且無論以何種酸為催化劑，LGA水解形成葡萄糖的反應(yīng)活化能均低于其脫水成為L(zhǎng)GO的反應(yīng)活化能。三氟甲磺酸為催化劑時(shí)，LGA水解生成葡萄糖的活化能為19.5 kJ／mol，而脫水反應(yīng)活化能為68.2 kJ／mol，脫水反應(yīng)與水解反應(yīng)活化能的比值為3.50。其他3種酸的水解反應(yīng)活化能和脫水反應(yīng)活化能均高于三氟甲磺酸，二者活化能的比值根據(jù)pKa由小到大分別為2.71、1.74和1.25。這表明LGA水解途徑比脫水途徑更易進(jìn)行，水解反應(yīng)是LGA脫水制備LGO過程中最大的副反應(yīng)，這也是造成纖維素制備脫水糖產(chǎn)物收率低的一個(gè)重要原因。而調(diào)節(jié)催化劑酸強(qiáng)度，可以改變水解反應(yīng)活化能和脫水反應(yīng)活化能的差距，是提升LGA脫水制備LGO收率的重要手段。

表1 LGA脫水和水解兩條反應(yīng)途徑反應(yīng)速率常數(shù)和活化能Table 1 Kinetics constant and activation energy of LGA dehydration and hydrolysis

3 結(jié)論

在極性非質(zhì)子溶劑中，催化劑酸強(qiáng)度對(duì)于纖維素降解制備脫水糖具有顯著影響。選擇了11種具有不同pKa的酸催化劑，考察纖維素、纖維二糖降解制備LGA和LGA脫水制備LGO的碳收率、TOF與酸強(qiáng)度的相關(guān)性。結(jié)果表明，pKa為－3～－2的酸催化劑（如對(duì)甲苯磺酸、甲磺酸、濃硫酸），無論對(duì)于纖維素降解還是LGA脫水均具有良好的催化效果。酸性過強(qiáng)或過弱均對(duì)脫水糖制備不利，這為極性非質(zhì)子溶劑中纖維素降解制備脫水糖反應(yīng)提供了一個(gè)催化劑酸強(qiáng)度范圍選擇的重要參考值。同時(shí)，通過對(duì)LGA水解至葡萄糖和脫水至LGO的兩條途徑的動(dòng)力學(xué)考察發(fā)現(xiàn)，LGO的水解是制備脫水糖過程中最大的副反應(yīng)，而通過調(diào)節(jié)催化劑酸強(qiáng)度，可以改變水解反應(yīng)活化能和脫水反應(yīng)活化能的差距，是提升LGA脫水制備LGO收率的重要手段。