余光書，林焱斌，莊福毅，吳春玲

(1. 福州市第二醫(yī)院，福建 福州 350007；2. 福建中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，福建 福州 350122；3. 廈門大學(xué)醫(yī)學(xué)院，福建 廈門 361102)

骨是一種高度血管化的組織，血管生成對于維持骨穩(wěn)態(tài)和骨再生具有重要的意義，許多患者的骨折修復(fù)失敗可歸因于血液供應(yīng)受損，因此成功的骨再生意味著新血管的形成。然而，新血管的形成受不同類型細(xì)胞活性及細(xì)胞因子等諸多因素的影響，研究血管新生的調(diào)控機(jī)制以及血管新生和成骨之間如何相互影響仍是目前的熱點。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是血管生成和體內(nèi)穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，能夠與包括骨形成蛋白2(BMP-2)在內(nèi)的多種細(xì)胞因子相互協(xié)調(diào)作用以調(diào)控骨組織的修復(fù)，并且VEGF表達(dá)水平代表了骨組織修復(fù)重建的潛能，因此通過添加VEGF等生長因子來促進(jìn)血管生成成為研究的熱點[1]。但是目前大多數(shù)研究發(fā)現(xiàn)外源性添加VEGF以維持一定水平的難度大且易于失活[2]，通過外源性藥物干預(yù)以激活相關(guān)細(xì)胞活性以提高VEGF的表達(dá)成為近年的研究方向[3]。因此，本研究在既往應(yīng)用補骨顆粒治療股骨頸骨折具有良好效果的基礎(chǔ)上[4]，觀察了補骨顆粒對體內(nèi)異位成骨及VEGF、BMP-2表達(dá)的影響，探討補骨顆粒對骨折愈合的影響機(jī)制。

1 實驗材料與方法

1.1實驗動物 清潔級SD雄性大鼠30只，6周齡，體重(160±20)g，由湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司提供[SYXK(湘)2019-0004]，室溫飼養(yǎng)，自由飲水。

1.2實驗試劑 VEGF試劑盒(酶聯(lián)生物科技有限公司，貨號：ml002862)，BMP-2試劑盒(酶聯(lián)生物科技有限公司，貨號：ml102832)，VEGF165凍干粉(同立海源生物有限公司，貨號：GMP-TL653)。

1.3實驗儀器 手術(shù)器械(北京中鏡科儀)，超凈臺(北京亞泰科隆儀器)，電子天平(中國民橋)，縫合線(愛惜康慕絲線)，縫合針(上海金環(huán))，植入式緩釋泵(瑞沃德)，臺式高速冷凍離心機(jī)(湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司)，全自動酶標(biāo)洗板機(jī)(深圳市匯松科技發(fā)展有限公司)，多功能酶標(biāo)分析儀(深圳市匯松科技發(fā)展有限公司)，搖床(其林貝爾)，恒溫箱(北京六一)，微波爐(美的)，切片刀(萊卡)，切片機(jī)(浙江金華益迪試驗器材)，包埋機(jī)(常州中威電子儀器)，普通冰箱(榮事達(dá))，精密PH計(雷磁)，顯微鏡(Motic)，蓋玻片(海門遠(yuǎn)泰)，載玻片(海門遠(yuǎn)泰)。

1.4實驗藥物及制備 補骨顆粒由廈門大學(xué)附屬福州第二醫(yī)院藥劑科負(fù)責(zé)加工制備，組方:骨碎補20 g、鹿銜草12 g、淫羊藿12 g、潞黨參15 g、茯苓20 g、三七3 g、川牛膝9 g、當(dāng)歸9 g、川芎6 g、女貞子15 g、枸杞9 g、生地15 g、甘草3 g，每克顆粒藥含原生藥9.8 g，使用時用生理鹽水加熱溶解，制成1 g/mL的水溶液。

1.5緩釋泵的灌充 在室溫23 ℃的無菌條件下，使用1.0 mL的注射器抽取VEGF165溶液(使用蒸餾水溶解VEGF165凍干粉并配置為濃度36 μg/mL)，將注射器與27G平頭灌充針鏈接，將緩釋泵豎直拿在手中，從頂端開孔位置插入灌充針，直到針頭輕觸緩釋泵底部再稍微向上提起灌充針約1 mm，然后緩慢推動注射器將溶液灌充進(jìn)緩釋泵直至緩釋泵開孔位置看到溶液溢出為止。

1.6實驗方法 30只SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后按照隨機(jī)對照原則分為空白組、對照組、補骨顆粒組，每組10只。將大鼠稱重，10%水合氯醛0.3 mL/100 g腹腔注射。剔除右側(cè)后腿毛發(fā)，切開股四頭肌附近的皮膚和肌肉，然后于補骨顆粒組與空白組大鼠的股四頭肌肌袋中植入灌有生理鹽水的緩釋泵，于對照組大鼠股四頭肌肌袋中植入灌有VEGF165溶液的緩釋泵(速率0.25 μL/h)，縫合肌肉和皮膚，消毒切口，放回飼養(yǎng)籠飼養(yǎng)。依據(jù)臨床常用量按實驗動物與人體表面積折算的等效劑量比值換算，補骨顆粒組給予補骨顆粒3.08 g/kg灌胃；對照組與空白組給予生理鹽水2 mL/kg灌胃，均每日1次，連續(xù)2周。于灌胃前進(jìn)行眼眶取血(留血清)，灌胃2周后于末次灌胃2 h后處死大鼠，腹主動脈取血(留血清)，同時取股四頭肌肌袋區(qū)域肌肉，使用4%多聚甲醛固定備用。

1.7檢測指標(biāo)及方法

1.7.1HE染色-免疫熒光法檢測骨骼肌成骨情況 將組織切片于60 ℃烤片12 h，將切片置于二甲苯中15 min×3次，然后依次在100%，100%，95%，85%和75%乙醇中放置5min，再用蒸餾水浸洗5 min，蘇木素染3 min，蒸餾水沖洗，PBS返藍(lán)；伊紅染5 s，蒸餾水沖洗；梯度乙醇(95%～100%)脫水，每級5 min。取出后置于二甲苯10 min×2次，中性樹膠封片。顯微鏡觀察，應(yīng)用IPP(Image-Pro-Plus)軟件觀察骨骼肌的形態(tài)并計算成骨面積的比率。

1.7.2天狼猩紅檢測骨骼肌膠原形成情況 將組織切片于160℃烤片12h，將切片置于二甲苯中20 min×3次，然后依次在100%，100%，95%，85%和75%乙醇中放置5 min，再用蒸餾水浸洗5 min；天狼星紅染色液染10 min，蒸餾水沖洗干凈，再自來水沖洗5 s，吹干、透明、封片。顯微鏡觀察，應(yīng)用IPP(Image-Pro-Plus)軟件觀察骨骼肌的染色情況并計算膠原面積的比率。

1.7.3免疫組化方法檢測CD31在骨骼肌的表達(dá)情況 將組織切片于60 ℃烤片30 min，將切片置于二甲苯中10 min×2次，然后依次在100%，95%，85%和75%乙醇放置5 min，再用蒸餾水浸洗5 min。將切片浸入0.01 mol/L 枸櫞酸鹽緩沖液(pH 6.0),微波爐加熱至沸騰后斷電，連續(xù)煮15 min后冷卻10 min后拿出，冷卻至室溫。冷卻后使用0.01 mol/L PBS(pH 7.2)洗滌3 min×3次；加入3% H2O2于室溫10min以滅活內(nèi)源性酶。再使用PBS沖洗3 min×3次；滴加適當(dāng)稀釋的一抗(CD31)，4 ℃過夜，PBS沖洗5 min×3次。滴加50 μL抗-兔-IgG抗體-HRP多聚體37℃孵育30min，PBS沖洗5 min×3次；滴加預(yù)制好的顯色劑DAB工作液50 μL，室溫孵育5 min，鏡下控制反應(yīng)時間，蒸餾水洗滌；蘇木素復(fù)染5 min，蒸餾水沖洗，PBS返藍(lán)；各級乙醇(60%～100%)脫水，每級5 min。取出后置于二甲苯10 min×2次，中性樹膠封片。顯微鏡觀察，應(yīng)用IPP(Image-Pro-Plus)軟件觀察CD31陽性染色情況(血管生成數(shù))。

1.7.4ELISA法檢測血清VEGF及BMP-2含量將采集的血清作為檢測樣本，然后設(shè)空白孔(空白對照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑)、待測樣品孔，按照VEGF及BMP-2試劑盒說明書進(jìn)行檢測。在酶標(biāo)包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40 μL，然后再加待測樣品10 μL。每孔加入酶標(biāo)試劑100 μL，空白孔除外。用封板膜封板后置37 ℃溫育60 min。將20倍濃縮洗滌液用蒸餾水20倍稀釋后備用。小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 s后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。每孔先加入顯色劑A 50 μL，再加入顯色劑B 50 μL，輕輕震蕩混勻，37 ℃避光顯色15 min。每孔加終止液50 μL以終止反應(yīng)(此時藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色)。以空白孔調(diào)零，450 nm波長依序測量各孔的吸光度(OD值)。

2 結(jié) 果

2.13組大鼠骨骼肌成骨面積、膠原面積、血管生成數(shù)比較 補骨顆粒組的成骨面積明顯高于空白組(P<0.05)，與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；3組間膠原面積比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)；補骨顆粒組的血管生成數(shù)明顯多于空白組及對照組(P均<0.05)，空白組與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1及圖1～3。

表1 3組大鼠股四頭肌肌袋區(qū)域骨骼肌成骨面積、膠原面積及血管生成數(shù)比較

圖1 3組大鼠股四頭肌肌袋區(qū)域骨骼肌成骨情況(HE染色,×100)

圖2 3組大鼠股四頭肌肌袋區(qū)域骨骼肌膠原形成情況(天狼猩紅染色，×100)

圖3 3組大鼠股四頭肌肌袋區(qū)域骨骼肌中血管生成情況(CD31免疫組化，×100)

2.23組大鼠血清VEGF、BMP-2含量比較 干預(yù)前，3組血清VEGF、BMP-2含量比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。干預(yù)2周后，補骨顆粒組血清VEGF含量明顯高于空白組(P<0.05)，與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；補骨顆粒組血清BMP-2含量明顯高于對照組(P<0.05)，與空白組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 3組大鼠干預(yù)前后血清VEGF、BMP-2含量比較

3 討 論

骨組織損傷的修復(fù)過程是不同類型細(xì)胞及相關(guān)因子相互作用的一個復(fù)雜過程，在這種過程中血管化和骨礦化同時發(fā)生[5-6]。而血管化可能在這些過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，可以為細(xì)胞的生長提供必要的營養(yǎng)物質(zhì)并去除廢物，同時將循環(huán)和局部信號與骨微環(huán)境的細(xì)胞聯(lián)系起來，并積極參與骨細(xì)胞生理的調(diào)節(jié)，因此微血管系統(tǒng)形成在成功構(gòu)建骨組織結(jié)構(gòu)中起著關(guān)鍵作用[7-9]。既往有實驗研究表明，外源性VEGF可以促進(jìn)小鼠股骨骨折中的血管形成及骨折部位的修復(fù)[10]。但目前藥物對于促進(jìn)骨組織損傷后血管新生的作用有限或者因價格昂貴受到限制，而補腎活血中藥在促進(jìn)血管新生及骨組織損傷方面顯示出明顯優(yōu)勢。本實驗觀察了具有補腎活血作用的補骨顆粒對大鼠體內(nèi)異位成骨的影響，結(jié)果顯示補骨顆粒組的成骨面積明顯高于空白組，血管生成數(shù)明顯多于空白組及對照組。說明補骨顆?？梢源龠M(jìn)體內(nèi)異位成骨和血管新生，且促進(jìn)血管新生的作用強于外源性VEGF，故認(rèn)為補骨顆粒主要通過促進(jìn)血管新生而加速骨折愈合。

成功的骨組織再生意味著新血管的形成，但是血管新生和成骨之間如何相互影響仍不明確。VEGF和BMP-2是骨再生過程中血管生成和成骨的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑[11-12]，VEGF主要在重建血管的早期階段表達(dá)，BMP-2在骨形成和重塑過程中持續(xù)表達(dá)，因此骨重建過程中VEGF表達(dá)加快是否可以增強BMP-2誘導(dǎo)的骨形成便成為研究的熱點。目前有研究發(fā)現(xiàn)在骨折愈合過程中VEGF的表達(dá)發(fā)生在早期愈合階段(在5～10d內(nèi))，而BMP-2的分泌發(fā)生在整個過程中[13-14]。如果通過遞送的方式增加VEGF和BMP-2含量則會起到協(xié)同作用并促進(jìn)早期骨再生，并且與單獨遞送BMP-2相比,VEGF可顯著促進(jìn)異位骨形成[15-16]。本實驗對比了補骨顆粒及外源性補充VEGF對血液中VEGF和BMP-2表達(dá)的影響，結(jié)果顯示補骨顆粒組血清VEGF含量明顯高于空白組，與對照組比較差異不明顯；補骨顆粒組血清BMP-2含量明顯高于對照組，與空白組比較差異不明顯。這說明補骨顆?？梢源龠M(jìn)VEGF及BMP-2的表達(dá)，并且補骨顆粒促進(jìn)BMP-2表達(dá)的效果優(yōu)于外源性補充VEGF，這或許與補骨顆粒的活血作用促進(jìn)含氧物質(zhì)的遞送而影響相關(guān)細(xì)胞活性及補骨顆?？杉せ畛晒羌?xì)胞活性等有關(guān)。

綜上所述，補骨顆?？梢源龠M(jìn)體內(nèi)異位成骨，機(jī)制與上調(diào)VEGF和BMP-2的表達(dá)，促進(jìn)血管新生有關(guān)。但骨組織損傷的修復(fù)過程復(fù)雜，補骨顆粒的作用機(jī)制仍有待深入探討。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。