王春波， 呂 輝， 韋玲冬， 郭治友

(黔南民族師范學(xué)院生物科學(xué)與農(nóng)學(xué)院， 貴州 都勻 558000)

茶樹(Camelliasinensis(L.) O. Kuntze)是山茶科山茶屬常綠植物，作為一種重要的經(jīng)濟(jì)作物廣泛栽培[1]。茶中含有大量可溶性物質(zhì)，例如兒茶素、咖啡因、茶氨酸、多酚、有機(jī)酸和維生素等，這些物質(zhì)的含量直接影響茶葉的質(zhì)量[2]。另外，根據(jù)加工方式的不同，茶葉又分為綠茶、白茶、紅茶、黑茶、黃茶和烏龍茶等不同類型[3]。Dai等[4]研究表明，不同類型茶葉之間代謝物含量差異較大?；诖耍芯坎煌铇淦贩N葉片中代謝物含量的差異尤為重要。

都勻毛尖是中國十大名茶之一[5]。1915年，都勻毛尖茶獲得國際食品博覽會優(yōu)質(zhì)獎。都勻毛尖野生茶樹主要分布于貴州省黔南州都勻市和貴定縣等地，茶樹葉色鮮綠，葉芽壯實肥大，形狀秀麗，茸毛較多，內(nèi)含物豐富，是優(yōu)良的育種資源[6]。關(guān)于都勻毛尖茶的研究多集中在資源調(diào)查和香氣成分等方面[7-8]，代謝組學(xué)方面的研究鮮有報道。目前，研究代謝組的方法很多，其中超高效液相色譜-四級桿串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜(ultra performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry，UPLC-QTOF-MS)技術(shù)具有高通量和高靈敏度的特性，已經(jīng)廣泛用于茶葉代謝物的定性和定量測定[9-11]。鑒于此，利用UPLC-QTOF/MS代謝組學(xué)技術(shù)，結(jié)合統(tǒng)計和多元數(shù)據(jù)分析方法，研究都勻毛尖茶不同品種間的代謝差異，可為都勻毛尖茶的加工工藝改良、滋味品質(zhì)提升和功能性成分富集等方面提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

都勻毛尖茶大葉種(長橢圓形葉片棕色莖，BS)和小葉種(橢圓形葉片綠色莖，GS)茶樹樣品于2018年4月采自貴定縣云霧鎮(zhèn)茶場(26°34′48″N，107°13′52″E)。每個品種隨機(jī)挑選9株茶樹并采集新鮮葉片樣品，共18個樣品。乙腈、氨水、甲醇和醋酸銨均為色譜純，購自德國Merck公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1290超高效液相色譜儀：美國安捷倫公司；TripleTOF 4600型四極桿串聯(lián)飛行時間高分辨質(zhì)譜儀：美國AB SCIEX公司；D 24 UV純水儀：德國Merck Millipore公司；JXFSTPRP-24型研磨儀：上海凈信科技有限公司；BSA 124 S-CW型天平：德國賽多利斯科學(xué)儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1樣品制備

每個茶樹葉片樣品研磨成粉后稱取50 mg，加入甲醇300μL，混勻后破碎2 min。冰水浴中超聲提取5 min。在4 ℃下，13 000 r/min離心15 min，最后取200μL的上清液進(jìn)樣。質(zhì)控樣本由18份待測樣本進(jìn)行等量混合后制備而成。

1.3.2色譜條件

色譜柱為XSelect HSS T 3 (100×2.1 mm，2.5μm)，25 ℃柱溫。流動相A：0.1%甲酸水溶液，流動相B：乙腈。流速：4 mL/min，2μL進(jìn)樣量。洗脫梯度為：0～1 min，5%B；1～8 min，5%～95%B；8～12 min，95%B；12～20 min，95%～5%B。

1.3.3質(zhì)譜條件

質(zhì)譜使用正離子模式結(jié)合負(fù)離子模式，優(yōu)化后的參數(shù)為：噴霧電壓：負(fù)離子模式為3.1 kV，正離子模式為3.8 kV；毛細(xì)管溫度320 ℃；鞘氣流速45 PSI；輔助氣流速15 PSI；掃描范圍70～1 000 m/z；掃描速率7 Hz。

1.3.4數(shù)據(jù)處理與分析

應(yīng)用安捷倫分析軟件Masshunter Qualitative Analysis將原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為通用格式(mz.data)?；赗語言平臺，利用XCMS程序?qū)|(zhì)譜峰進(jìn)自動積分和歸一化等處理，獲得一個包含峰面積，m/z-RT對和樣品名的可視化矩陣。使用SIMCA-P軟件對可視化矩陣進(jìn)行主成分分析(principal component analysis, PCA)和正交偏最小二乘判別分析(orthogonal least squares discriminant analysis, OPLS-DA)，以檢測差異代謝物[12]。基于Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) 數(shù)據(jù)庫和MetaboAnalyst軟件對差異代謝物進(jìn)行通路分析[13]。利用MeV 4.9軟件進(jìn)行熱圖分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 UPLC-QTOF-MS鑒定結(jié)果

本研究基于UPLC-QTOF-MS技術(shù)分析了都勻毛尖茶大葉種和小葉種的代謝差異，結(jié)果在正離子模式下與數(shù)據(jù)庫匹配到的代謝物有121個，負(fù)離子模式下匹配到的代謝物有308個。由于在負(fù)離子模式下匹配到的代謝物完全覆蓋正離子模式，且在多元統(tǒng)計分析中負(fù)離子模式檢測到的參數(shù)更有預(yù)測性和更可信，所以本研究后續(xù)的統(tǒng)計分析采用負(fù)離子模式下獲得的數(shù)據(jù)。圖1為茶樹樣品在質(zhì)譜ESI-模式下檢測到的基峰圖。從圖1可以看出，在0.4～0.96 min、2.7～3.7 min和7.94～10.95 min時物質(zhì)相對豐度最高。

圖1 樣品負(fù)離子模式下基峰圖(BPC)

2.2 多元統(tǒng)計分析

將負(fù)離子模式下獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行PCA和OPLS-DA統(tǒng)計分析，結(jié)果BS和GS樣品呈現(xiàn)出明顯的分離趨勢(圖2 A，B)。在PCA得分圖中，主成分1和主成分2的貢獻(xiàn)率分別為61.8%和21.9%，樣品累計貢獻(xiàn)率超過85%，說明代表性較好。此外，PCA分析也能反映代謝物相對豐度的分布情況，距離越近的樣品物質(zhì)含量差異越小，反之則越大。主成分分析中，BS樣品主要分布在主成分1的正軸位置，而GS種樣品主要分布在主成分1的負(fù)軸位置，并且不同品種間的樣本距離較遠(yuǎn)，這表明這兩個茶樹品種代謝物差異較大。OPLS-DA得分圖中，各品種的樣本劃分明確，沒有分散，模型驗證后參數(shù)值R2x為85.3%，R2y為99.8%，Q2為96.8%，參數(shù)值均接近1，說明負(fù)離子模型下具有較好的預(yù)測性和可靠性。此外，通過CV-ANOVA對OPLS-DA模型進(jìn)行驗證，R2和Q2分別為0.906和-0.385，這證明了該模型的有效性(圖2 C)。

圖2 多元統(tǒng)計分析(三角形代表GS，圓形代表BS)： (A) PCA得分圖 (B) OPLS-DA得分圖 (C) OPLS-DA模型排序檢驗 (D) OPLS-DA載荷圖

2.3 差異代謝物和代謝通路分析

OPLS-DA載荷圖可以直觀地顯示不同品種樣本間的差異代謝物，其中的圓點(diǎn)代表數(shù)據(jù)庫中匹配的物質(zhì)，距離橫縱坐標(biāo)原點(diǎn)越遠(yuǎn)，在邊緣越分散的即為檢測到的樣本間顯著差異代謝物。本研究對鑒定到的308個代謝物進(jìn)行差異性篩選，標(biāo)準(zhǔn)為VIP≥1、p<0.05和FC≥2或FC≤-2。結(jié)果共篩選到7個顯著差異代謝物，OPLS-DA載荷圖見圖2 D，其中包括4種黃酮醇類物質(zhì)(1～4號)、2種兒茶素(5～6號)和1種酚酸類物質(zhì)(7號)(表1)。

表1 不同茶樹品種的差異代謝物

根據(jù)7種差異代謝物的相對豐度進(jìn)行熱圖分析(圖3)，紅色表明代謝物相對豐度高于平均水平，藍(lán)色表明代謝物相對豐度低于平均水平。結(jié)果顯示，BS樣品中含有的楊梅素、二氫槲皮素、槲皮素、山奈酚和咖啡?？崴嵋黠@高于GS樣品；而表兒茶素和表沒食子兒茶素的含量GS樣品要高于BS樣品。

圖3 差異代謝物熱圖

另外，利用KEGG數(shù)據(jù)庫對7個差異代謝物進(jìn)行代謝通路分析(圖4)，結(jié)果顯示，這些差異代謝物主要分布于類黃酮代謝途徑中。從圖中可以看出，上游代謝物二氫槲皮素和二氫楊梅素是類黃酮代謝的中間產(chǎn)物，在兒茶素的生物合成中起關(guān)鍵作用[7]。

圖4 7個差異代謝物的代謝通路分析(加粗的為差異代謝物，柱狀圖代表物質(zhì)相對豐度)

3 討論與結(jié)論

茶樹鮮葉是茶葉加工的原材料，不同品種茶樹葉片含有的物質(zhì)差異較大，選擇合適的茶樹品種對于茶葉的加工和品質(zhì)至關(guān)重要。另外，茶葉中化合物成分含量的不同賦予了茶葉不同的感官品質(zhì)。例如澀味主要來源于兒茶素和黃酮醇等。以往的研究表明，綠茶含有比其他茶類相對較高的兒茶素[14]。

利用UPLC-QTOF-MS技術(shù)并結(jié)合多元統(tǒng)計方法檢測到7個顯著差異代謝物，主要分布在類黃酮生物合成途徑中。而類黃酮物質(zhì)對于茶湯苦味的貢獻(xiàn)較大，茶中含有許多類黃酮，約占干重的25%[15]。通常，一杯3 g左右的干茶含有約0.12 g類黃酮。茶葉的質(zhì)量高度依賴于這些類黃酮化合物的含量及其性質(zhì)。同時，類黃酮物質(zhì)的變化也會較大程度的影響茶葉的顏色和香氣等特性?；诖耍迈r茶樹葉片中類黃酮物質(zhì)的含量差異直接影響茶葉的加工方法及其品質(zhì)。

兒茶素對茶的質(zhì)量至關(guān)重要，其含量決定茶的顏色，香氣和口味[16]。通常，綠茶的質(zhì)量與兒茶素含量成正比，好的綠茶中含有更多的兒茶素[17]。本研究檢測到的7個顯著差異代謝物包括2種兒茶素，分別為表兒茶素和表沒食子兒茶素，它們在GS樣品中的含量遠(yuǎn)高于BS樣品，這表明GS樣品更適合用于綠茶加工。相反，BS樣品含有的楊梅素、二氫槲皮素、槲皮素、山奈酚和咖啡?？崴岬暮扛哂贕S樣品，而在中國云南、印度和斯里蘭卡等地的優(yōu)質(zhì)紅茶中，這5種代謝物的含量也較高[18]，鑒于此，認(rèn)為BS樣品更適合加工成紅茶。本研究結(jié)果可為都勻毛尖茶的加工方法和良種選育提供理論依據(jù)。