徐郁慧 陳曉軍△

（1復旦大學附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院婦科 上海 200011；2上海市女性生殖內(nèi)分泌相關(guān)疾病重點實驗室 上海 200011）

子宮內(nèi)膜癌（endometrial cancer，EC）是最常見的婦科惡性腫瘤之一［1］，其發(fā)病率的逐年增加與肥胖相關(guān)，這一相關(guān)性在發(fā)達國家尤其明顯［2］。約7%的EC患者年齡在45歲以下并且渴望保留生育能力［3］。目前，EC的保守治療策略僅限于大劑量的激素治療。然而，近年的系統(tǒng)薈萃分析表明，仍有25%～30%的內(nèi)膜病變患者對激素治療無反應(yīng)［4-6］。因此，尋找新的抗腫瘤藥物對于期望保留生育能力的EC患者尤為重要。

載 脂 蛋 白AI（apolipoprotein AI，apo AI）作 為血漿中高密度脂蛋白（high-density lipoprotein，HDL）顆粒的主要成分，其主要功能為促進膽固醇運輸和脂質(zhì)代謝。研究發(fā)現(xiàn)apo AI可作為肥胖相關(guān)惡性腫瘤的診斷標記物［7］，如血清apo AI低水平預示結(jié)腸癌的發(fā)生［8］，血清apo AI低水平被認為是惡性腫瘤進展和不良預后的預測因子［9-10］。文獻報道血清apo AI聯(lián)合轉(zhuǎn)鐵蛋白（transferrin，TF）及前白蛋白（transthyretin，TTR）的檢測集合可作為EC診斷的新工具［11］。但是，國內(nèi)外尚無有關(guān)血清apo AI與EC及癌前病變之間關(guān)系的研究。apo AI模擬肽L4F是一組長度為18個氨基酸的肽，能形成可結(jié)合脂質(zhì)的經(jīng)典兩親螺旋的結(jié)構(gòu)，類似于全長apo AI的功能。apo AI模擬肽被證明具有相似的抗腫瘤特性：在卵巢癌中，L4F、D4F和L5F均可抑制ID8癌細胞增殖并抑制異種移植瘤生長［12-14］。然而，目前尚無研究證明apo AI或其模擬肽是否影響EC的發(fā)展。

本研究通過回顧臨床血脂數(shù)據(jù)，首次評估apo AI模 擬 肽L4F對EC細胞系的影響，并 利 用EC類器官模型模擬機體對L4F的反應(yīng)，初步驗證了apo AI及模擬肽L4F對EC發(fā)展的影響。

資料和方法

細胞和臨床樣本人EC細胞系HEC-1A和ECC-1獲自美國典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC）。細胞系經(jīng)過短串聯(lián)重復序列（short tandem repeat，STR）鑒定，每半年重復鑒定STR。

臨床人體組織樣本采集由復旦大學婦產(chǎn)科醫(yī)院倫理委員會批準（批準號：kyy2019-104）。3例新鮮EC組織樣本取自2019年5月—2020年5月在復旦大學附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院就診并行子宮切除術(shù)的患者，患者均簽署知情同意書。3例患者在6個月內(nèi)均無雌孕激素用藥史，病理診斷由2名病理醫(yī)師共同認定。

回顧性病例納入2020年1月—2021年1月在我院楊浦院區(qū)首次就診并經(jīng)病理診斷證實為子宮內(nèi)膜非典型增生（atypical endometrial hyperplasia，AEH）的患者48例和EC患者45例；41例無子宮內(nèi)膜病變者作為對照。排除嚴重內(nèi)科疾病或其他系統(tǒng)惡性腫瘤者。經(jīng)過患者及家屬知情同意后，在住院病歷系統(tǒng)中查詢并收集納入對象的一般資料、病理診斷及術(shù)前血脂評估。一般資料包括年齡、身高、體重、是否絕經(jīng)、病史（有無高血壓、糖尿病、心臟病及用藥史），血脂評估包括apo AI、apo B、總膽固醇（total cholesterol，TCH）、甘油三脂（triglyceride，TG）、高 密 度 脂 蛋 白（high-density lipoprotein，HDL）和 低 密 度 脂 蛋 白（low-density lipoprotein，LDL）。

主要試劑和抗體apo AI模擬肽L4F購自中國強耀生物有限公司，多肽序列為Ac-DWFKAFYDKVAEKFKEAF-NH2（N→C），純 度高于98%。Ki67抗體購自美國Cell Signaling Technology（CST）公司。AMPK、p-AMPK、Nanog、β-action抗體購自美國Abcam公司。

細胞培養(yǎng)和處理ECC-1細胞培養(yǎng)于R/MINI 1640（HyClone，美 國），HEC-1A細 胞 培 養(yǎng) 于DMEM/F12（HyClone，美國），兩種培養(yǎng)基均含有10%胎牛血清（Gibco，美國）。細胞置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

EC類器官分離及培養(yǎng)將新鮮腫瘤組織切成1～2 mm的碎片，在1.25 mg/mL膠原酶Ⅱ和1 mg/mL分散酶Ⅱ組成的消化液中消化40～50 min。腫瘤組織碎片被消化成上皮細胞簇，用冰PBS洗滌，300×g離心1 min。去除上清液，沉淀物被重新懸浮在預冷的基質(zhì)膠中，混懸液接種于24孔板中，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15 min，直到基質(zhì)膠變成凝膠狀，而后以每 孔500 μL加 入EC類 器 官 培 養(yǎng) 基［Advanced DMEM/F12+50 ng/mL表皮生長因子+250 ng/mL R-spondin1（Wnt信 號 通 路 激 動 劑）+100 ng/mL Noggin（一種類胰島素生長因子）+10 μmol/L Y27632（ROCK信號通路抑制劑）+L-glutamax（L-丙氨酰-L-谷氨酰胺）］。

細胞增殖能力檢測消化對數(shù)生長期的人EC細胞，以3 000個/孔的密度均勻接種于96孔板中，每孔含100 μL完全培養(yǎng)基。細胞貼壁培養(yǎng)24 h，PBS洗滌2次，予以不同濃度的L4F（0、5、20、40 μg/mL）處理24 h。Cell Counting Kit-8（CCK8）檢測試劑盒（日本Dojindo公司）用于檢測細胞增殖，每孔加入10 μL CCK8試劑，在37℃下孵育1 h。用酶標儀測定450 nm處吸光度值。

免疫熒光檢測EC類器官用20 ng/mL的L4F處理7天后，用4%多聚甲醛固定1 h，0.25% Triton 100滲透30 min，用5% BSA封閉1 h。類器官與一抗Ki67（1∶200）在4℃下孵育過夜。預冷PBS洗滌類器官沉淀2次，與二抗室溫孵育30 min。預冷PBS洗滌類器官沉淀2次，將類器官重懸于含DAPI（4′，6-二脒基-2-苯基吲哚）的抗熒光淬滅劑中，并固定于載玻片上。共聚焦顯微鏡（賽默飛，中國上海）拍攝圖像（20倍放大率）。

免疫印跡實驗收集不同濃度L4F（0、5、20、40 μg/mL）處理48 h后的人EC細胞沉淀，PBS洗滌2次，予以RIPA（強）裂解液（Santa Cruz，美國）冰上裂解細胞沉淀10 min。所得細胞懸液予以12 000×g離心10 min后，收集上清液，并和5×SDS上樣緩沖液按比例混合后，放入100℃金屬浴處理15 min。電泳：80 V恒壓30 min，120 V恒壓1 h；轉(zhuǎn)膜：300 mA恒流3 h。蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5% BSA室溫封閉1 h后，予以一抗4℃孵育過夜，二抗室溫孵育1 h，ECL（Epizyme，中國上海）化學發(fā)光方法對抗原蛋白進行可視化和定量。

統(tǒng)計學分析采用雙尾t檢驗分析數(shù)據(jù)，對照組標準化為1，利用Graphpad軟件呈現(xiàn)數(shù)據(jù)圖（柱狀圖）。所有數(shù)據(jù)的處理都遵循SEM分析法（用x±s表示），每個實驗獨立重復3次。多組間計量資料的比較使用Kruskal-Wallis H檢驗，多組間計數(shù)資料間的比較采用Pearson’sχ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

不同子宮內(nèi)膜病變階段與正常對照血脂水平的比較134例觀察對象的臨床參數(shù)資料比較見表1，包括48例子宮內(nèi)膜AEH、45例EC及41例正常對 照。45例EC患 者 中 有12例 為G3期，33例 為G1～G2期。觀察對象的年齡、月經(jīng)狀態(tài)、體重指數(shù)、是否存在高血壓以及高脂血癥在3組之間差異無統(tǒng)計學意義（表1）。對3組觀察對象血清中的血脂水平進行統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)apo B、TCH、TG、HDL、LDL與正常對照組的差異無統(tǒng)計學意義，而血清apo AI水平在子宮內(nèi)膜AEH組和EC組均低于對照組（P＜0.001，表2）。其中，正常對照組為（1.129±0.257）g/L，高 于AEH組 的（0.970±0.201）g/L和EC組的（0.913±0.163）g/L，提示apo AI可能參與EC的發(fā)生發(fā)展。EC組血清apo AI平均值低于子宮內(nèi)膜AEH組，但差異無統(tǒng)計學意義（P=0.671）。

表1 正常對照組、子宮內(nèi)膜非典型增生組及內(nèi)膜癌組患者臨床參數(shù)資料的比較Tab 1 Univariate analyses of clinical parameters in patients of normal，AEH or EC group ［n（%）］

表2 子宮內(nèi)膜非典型增生組及內(nèi)膜癌組與正常對照組血脂水平的比較Tab 2 Comparison of lipid metabolism levels in normal，AEH and EC group （）

表2 子宮內(nèi)膜非典型增生組及內(nèi)膜癌組與正常對照組血脂水平的比較Tab 2 Comparison of lipid metabolism levels in normal，AEH and EC group （）

AEH：Atypical endometrial hyperplasia group；EC：Endometrial cancer group；TCH：Total cholesterol；TG：Triglyceride；HDL：High-density lipoprotein；LDL：Low-density lipoprotein.

Lipid Metabolism apo AI（g/L）apo B（g/L）TCH（mmol/L）TG（mmol/L）HDL（mmol/L）LDL（mmol/L）Normal（n=41）1.129±0.257 0.859±0.203 4.698±0.970 1.366±0.668 1.130±0.239 3.179±0.696 AEH（n=48）0.970±0.201 0.887±0.211 4.636±0.734 1.559±1.224 1.096±0.261 2.895±0.658 EC（n=45）0.913±0.163 0.934±0.183 4.954±0.739 1.435±0.658 1.134±0.227 2.976±0.551 H P＜0.001 0.072 0.057 0.743 0.433 0.158 20.520 5.263 5.728 0.593 1.671 3.688

apo AI模擬肽L4F抑制EC細胞系增殖利用不同濃度的apo AI模擬肽L4F（0、5、20、40 μg/mL）處理內(nèi)膜癌細胞系HEC-1A和ECC-1。L4F處理癌細胞48 h后，通過CCK8細胞活力檢測試劑盒檢測EC細胞增殖活力。L4F可以抑制HEC-1A和ECC-1的增殖，且隨著L4F濃度升高，其對HEC-1A和ECC-1細胞增殖的抑制效果增加（圖1）。綜上所述，L4F以劑量依賴的方式抑制EC細胞系的增殖。

圖1 apo AI模擬肽L4F抑制EC細胞系增殖Fig 1 Apo AI mimetic L4F reduced the cell viability in EC cell lines

apo AI模擬肽L4F抑制EC類器官增殖由臨床腫瘤樣本構(gòu)建的腫瘤類器官模型是目前最有效的 藥 物 篩 選 工 具。根 據(jù)Turco等［15］2017年 發(fā) 表 的EC類器官培養(yǎng)方案，我們培養(yǎng)了3例EC類器官，標記編號為No.1，No.2，No.3（圖2、3）。3例取樣的患者均為絕經(jīng)前婦女，病理證實為EC，均行全子宮及雙側(cè)附件切除術(shù)。我們利用20 μg/mL L4F處理EC類器官7天，以研究L4F是否可作為潛在的抗腫瘤制劑。類器官的明場顯微鏡圖像顯示：與對照組相比，L4F處理組的EC類器官球體大小及數(shù)量顯著低于對照組（圖2A）。統(tǒng)計類器官數(shù)量后發(fā)現(xiàn)，L4F處理的EC類器官數(shù)量顯著低于對照組（圖2B）。對類器官進行免疫熒光染色以評估增殖標志物Ki67的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)L4F處理后EC類器官的Ki67表達水平相對于對照組顯著降低（圖3），這表明L4F對所有3例EC類器官均有抑制增殖的作用。

圖2 apo AI模擬肽L4F抑制EC類器官生長Fig 2 apo AI mimetic L4F inhibited the growth of endometrial cancer derived-organoids

圖3 apo AI模擬肽L4F抑制EC類器官增殖活力Fig 3 apo AI mimetic L4F inhibited the proliferation of endometrial cancer derived-organoids

apo AI模擬肽L4F激活EC細胞AMPK信號通路的磷酸化不同濃度的L4F分別處理HEC-1A和ECC-1細胞系24 h后，收集癌細胞的蛋白裂解液。蛋白質(zhì)印跡實驗顯示：與對照組相比，L4F顯著增加了HEC-1A和ECC-1細胞的AMPK磷酸化蛋白（phospho-AMPK、p-AMPK）水平。隨著L4F處理劑量的增加，癌細胞的AMPK磷酸化水平不斷增加（圖4），提示L4F可能通過促進AMPK的磷酸化來抑制腫瘤細胞增殖。

圖4 apo AI模擬肽L4F誘導EC細胞AMPK信號通路磷酸化Fig 4 apo AI mimetic L4F stimulated the phosphorylation of AMPK in endometrial cancer cells

apo AI模擬肽L4F抑制EC細胞干性標記物Nanog的表達Nanog是維持EC干細胞的重要轉(zhuǎn)錄因子，被作為腫瘤治療的新靶點［16］。已有文獻報道Nanog的胞內(nèi)降解受到AMPK磷酸化通路的調(diào)控［17］。20 μg/mL L4F處 理HEC-1A和ECC-1細 胞24 h后，收集細胞蛋白裂解液。免疫印跡實驗表明L4F處理組Nanog蛋白表達水平低于空白對照組（圖5），提示L4F可能通過AMPK信號通路調(diào)控抑制EC干性。

圖5 apo AI模擬肽L4F抑制EC細胞Nanog蛋白水平Fig 5 apo AI mimetic L4F inhibited the protein level of Nanog in endometrial cancer cells

為驗證EC類器官中，apo AI模擬肽L4F是否促進其AMPK信號通路磷酸化并抑制Nanog的表達，我們利用EC類器官模型驗證L4F對EC細胞AMPK信號通路及干性相關(guān)基因的影響。20 μg/mL L4F處理EC類器官7天后，收集類器官的蛋白裂解液。蛋白質(zhì)印跡實驗顯示：L4F處理組磷酸化AMPK蛋白高于空白對照組，而Nanog蛋白表達水平低于空白對照組（圖6）。表明L4F激活AMPK信號通路磷酸化并抑制Nanog表達在EC類器官中得到驗證。

圖6 apo AI模擬肽L4F誘導EC類器官AMPK信號通路磷酸化并下調(diào)Nanog蛋白水平Fig 6 apo AI mimetic L4F stimulated the phosphorylation of AMPK and inhibited the protein level of Nanog in endometrial cancer derived-organoids

討 論

近年的研究表明，血清apo AI低水平可能有助于腫瘤發(fā)生，并且與許多癌癥的轉(zhuǎn)移程度和預后不良有關(guān)，如結(jié)直腸癌［10］、卵巢癌［18］、肺癌［19］、肝癌［20］等。有文獻表明血清apo AI是一種很有前景的預后指標，可用于補充食管癌的TNM分期［21］。此外，血清apo AI低水平與結(jié)直腸癌患者的全身炎癥反應(yīng)和低存活率相關(guān)［22］。本研究通過回顧子宮內(nèi)膜AEH及EC患者的血清血脂水平，以正常人群作為對照，發(fā)現(xiàn)AEH及EC患者血清apo AI水平較低，血清apo AI低水平在EC的進展中可能起重要作用，同時我們推測補充apo AI或其模擬肽可能影響EC的發(fā)展進程。

在卵巢癌、結(jié)腸癌及胰腺癌的研究中，apo AI及其模擬肽可通過抑制腫瘤細胞增殖活力及遷移來抑制 腫瘤發(fā) 展［12，23-24］。apo AI模擬 肽比全 長apo AI能更有效地抑制腫瘤增殖。在乳腺癌小鼠模型中，apo AI和apo AI模擬肽D4F都降低了血清氧化低密度脂蛋白（oxLDL）水平，但只有D4F抑制了oxLDL介導的腫瘤生長［25］。本研究中，L4F以劑量依賴性的方式抑制兩株EC細胞系的增殖，與上述文獻結(jié)果一致。這種劑量依賴的作用提示：未來L4F作為臨床藥物時需選擇合理的用藥濃度，以達到安全及有效的治療結(jié)果。

腫瘤類器官由源自患者的原代腫瘤組織培養(yǎng)獲得，保留了腫瘤組織的特性，如細胞與細胞的接觸、細胞極性等［26］。因此腫瘤類器官系統(tǒng)比動物模型能更好地模擬人體對藥物和毒素的反應(yīng)，從而被用于抗癌藥物研發(fā)和個性化治療［27］。盡管apo AI模擬肽的抗腫瘤特性在體內(nèi)和體外均已確定，但其在癌癥治療中的應(yīng)用尚無臨床前試驗。我們成功分離培養(yǎng)了3例EC患者的類器官，以此模擬機體對L4F的反應(yīng)性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，L4F可抑制EC類器官的生長以及增殖活力，同時不同腫瘤樣本提取的類器官對L4F的反應(yīng)性存在一定差異。提示L4F或可用于臨床治療EC并具有一定的抑制效果，但這種效果存在異質(zhì)性。

apo AI模擬肽可以通過激活AMPK磷酸化來改善葡萄糖代謝［28］，而AMPK信號通路磷酸化被認為是二甲雙胍抑制腫瘤細胞增殖的重要機制［29］。Wang等［17］發(fā)現(xiàn)，AMPK信號通路的磷酸化通過促進Nanog的泛素化降解而下調(diào)前列腺癌干性，最終抑制腫瘤發(fā)展。Nanog被廣泛證實是維持EC干細胞的重要轉(zhuǎn)錄因子［16］。因此，我們推測L4F對EC細胞系增殖的抑制可能是通過激活AMPK信號通路，從而促進Nanog降解，影響EC細胞干性。我們的結(jié)果證實L4F可以誘導EC細胞AMPK信號通路的磷酸化，同時抑制癌細胞Nanog蛋白的表達水平。Nanog蛋白降解是否與AMPK激活而促進其蛋白的泛素化有關(guān)，有待進一步研究。

本研究存在以下局限性：（1）屬于單中心的回顧性研究，研究時間有限，樣本量不大，可能存在選擇偏倚。（2）未涉及L4F在體內(nèi)的效果驗證，L4F對EC的抗腫瘤作用及機制有待深入研究。（3）雖然L4F對EC的抗腫瘤作用已得到初步證實，但其臨床應(yīng)用及可行性還需進行安全性和效力評估。

綜上所述，本研究證實血清apo AI低水平為子宮內(nèi)膜AHE及EC患者的血脂特點，L4F可能具有作為診斷EC的生物標志物的潛力。同時證實了apo AI模擬肽L4F抑制EC進展、激活AMPK信號通路以及抑制腫瘤干細胞標記物Nanog表達的能力。這是首次通過患者來源的類器官提供了令人信服的證據(jù)來證實L4F的抗腫瘤功能，為今后進行臨床試驗或臨床應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。

作者貢獻聲明徐郁慧數(shù)據(jù)整理，實驗研究，論文撰寫。陳曉軍實驗指導，論文修改。

利益沖突聲明所有作者均聲明不存在利益沖突。