韓紅 金赟杰 劉嶸 范卓陽 季正標 王文平△

（1復旦大學附屬中山醫(yī)院超聲科，3介入治療科 上海 200032；2上海市影像醫(yī)學研究所 上海 200032）

肝細胞癌是發(fā)展中國家最常見的惡性腫瘤之一，已成為全球癌癥相關(guān)死亡的主要原因。以射頻消融為代表的腫瘤熱消融治療技術(shù)在肝癌的微創(chuàng)治療方面取得了顯著成績，不僅療效顯著，還具有創(chuàng)傷小、患者痛苦少、可重復操作等明顯優(yōu)勢，對一些無法手術(shù)切除的肝癌也可進行治療［1-2］。早期準確評價消融術(shù)后癌殘留十分重要，然而消融術(shù)后早期診斷灶周癌殘留往往十分困難。熱消融治療后病灶周圍組織出現(xiàn)熱損傷，可引起局部炎癥反應，表現(xiàn)為增強影像上消融灶周邊的強化，被稱為消融灶周邊良性增強（benign periablational enhancement，BPE）［3］。消融術(shù)后灶 周 炎癥反應 帶引起的BPE常常與同樣以灶周增強為表現(xiàn)的殘癌混淆，難以鑒別；并且該BPE持續(xù)時間很長，甚至可達6個月。

盡管增強CT、PET、MRI成像等影像學檢查對肝癌消融后療效評價有一定價值，但在區(qū)別消融后灶周炎癥反應帶和殘余瘤上仍存在不同程度的限制，影響臨床進一步制訂后續(xù)方案。研究發(fā)現(xiàn)應用CT診斷消融后癌殘留整體敏感度僅為44%。Kim等［4］提出，增強MRI檢查容易高估消融后癌殘留，原因是灶周良性炎癥反應帶也會增強，特別是在消融術(shù)后1個月內(nèi)的檢查中。

超聲檢查具有實時、經(jīng)濟、無輻射和便于多次重復檢查等優(yōu)點，因此成為消融術(shù)后療效評估的重要手段。很多消融治療也是在超聲引導下進行的，應用超聲技術(shù)進行評估較CT或MRI更為簡便，可直接發(fā)現(xiàn)存活病灶，進行定位補充治療［5］。但應用超聲鑒別消融后殘癌及炎癥的報道不多，更少見超聲造影定量分析技術(shù)在這方面的應用。在臨床實踐中，不但影像檢查難以鑒別消融后殘癌與BPE困難，實際上也難以取得相應病理標本證實診斷。因此，本研究制作了殘癌與灶周炎癥帶共存的VX2兔肝腫瘤部分消融模型，應用超聲造影定量分析技術(shù)對消融后殘癌與灶周炎癥帶進行同步鑒別比較，并以病理結(jié)果為金標準，以期為解決傳統(tǒng)影像方法難以早期精準鑒別的問題提供實驗基礎，并確定消融后鑒別診斷的最優(yōu)時間點。

材料和方法

制作兔VX2肝腫瘤部分消融模型16只健康新西蘭大白兔由復旦大學附屬中山醫(yī)院實驗動物中心提供，體重2.5～3.0 kg，雌雄不限。采用2%戊巴比妥鈉溶液麻醉，備皮消毒，劍突下沿腹白線正中切口，暴露兔肝左內(nèi)葉，用眼科鑷刺破肝實質(zhì)表面，取出備用VX2腫瘤組織塊（約2 mm3）置入切口底部，置入止血用明膠海綿塊，將肝臟回納，逐層縫合切口。術(shù)后青霉素40萬單位肌注連續(xù)3天。

在VX2瘤種植2周后制作兔肝腫瘤部分消融模型。肝腫瘤大小為（9.50±1.56）mm（8～13 mm）。超聲儀器為意大利Esaote公司的MyLab Twice，配備激光消融系統(tǒng)Echo Laser X4，發(fā)射激光波長1 064 nm，光纖直徑300 μm。超聲引導下將21G PTC穿刺針偏心刺入肝腫瘤，取出針芯后導入光纖，光纖頭端裸露5 mm；消融功率4 W，輸出能量100 J，毀損半徑占腫瘤1/3～2/3。1只VX2兔因針道偏離腫瘤，未能成功消融，其余15只均成功制作部分消融模型。

超聲造影檢查及定量分析采用東芝Aplio i900超聲診斷儀，凸陣探頭頻率為1～8 MHz。消融術(shù)后1、3、7、14天對病灶行超聲檢查。常規(guī)超聲檢查兔肝腫瘤消融區(qū)，觀察腫塊位置、深度、形態(tài)，并測量大小。選擇消融灶的針道截面，進行超聲造影檢查。通過兔耳緣靜脈團注射0.6 mL造影劑SonoVue，立即用1 mL生理鹽水沖管，超聲造影圖像動靜態(tài)存圖。造影時采用固定的預設條件，增益為76，機械指數(shù)為0.10，聲功率為1%，動態(tài)范圍為60 dB，聚焦均放置于圖像底部。

依據(jù)最終病理結(jié)果，回放定幀圖像，分別在正常肝臟組織、殘癌組織、炎癥帶中選取興趣區(qū)（region of interest，ROI），進行定量分析檢查。采用儀器自帶的圖像分析軟件，對每個ROI繪制時間-強度曲線（time-intensity curve，TIC），根據(jù)擬合后曲線自動計算超聲造影定量參數(shù)：（1）時間相關(guān)參數(shù)：達峰時間（time to peak，TTP），即組織內(nèi)出現(xiàn)造影劑到造影劑達峰值強度的時間差；平均渡越時間（mean transit time，MTT），即造影劑在組織內(nèi)從進入到廓清的時間。（2）強度相關(guān)參數(shù)：峰值強度（peak intensity，PI），即TIC曲線最高點對應的縱坐標數(shù)值；曲線下面積（area under the curve，AUC），即TIC曲線與橫軸圍成的面積；上升支曲線下面積（area under the curve of wash in，AWI），即TIC曲線上升支與橫軸圍成的面積；下降支曲線下面積（area under the curve of wash out，AWO），即TIC曲線下降支與橫軸圍成的面積。每一段動態(tài)原始數(shù)據(jù)各取3次TIC曲線，取擬合度最高的曲線數(shù)據(jù)進行分析。以正常肝組織TIC曲線的上升及下降支為參照，將ROI的TIC曲線形態(tài)分成4型：速升速降型（Ⅰ型）、速升緩降型（Ⅱ型）、緩升速降型（Ⅲ型）及緩升緩降型（Ⅳ型）。

病理檢測消融術(shù)后1、3、7、14天分別隨機處死3～5只VX2兔，取標本觀察消融灶及殘余瘤情況。在消融灶的針道截面切取包括殘余瘤、消融凝固灶、炎癥反應帶、正常肝組織的部分，4%甲醛溶液固定，HE染色，進行組織病理學觀察（圖1）。

圖1 VX2兔肝腫瘤激光部分消融術(shù)后第3天圖像Fig 1 Images of rabbit VX2 liver tumor on the third day after partial ablation laser

統(tǒng)計學分析采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計分析。采用獨立樣本t檢驗（方差齊性）或非參數(shù)秩和檢驗（方差不齊）比較殘癌與消融后炎癥帶在各時間點的造影定量參數(shù)。采用Kruskal-Wallis檢驗（H檢驗）及χ2檢驗。采用雙側(cè)檢驗比較殘癌與炎癥帶的超聲造影TIC曲線形態(tài)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

激光消融后殘余瘤與炎癥帶的組織病理學表現(xiàn)灰階超聲顯示激光消融開始后即刻在光纖前方形成氣體樣強回聲，邊界不清；術(shù)后3天，消融灶所在區(qū)中央可見邊界清楚的強回聲，消融灶另一側(cè)的殘癌組織呈團塊狀、均勻、稍低回聲區(qū)。取腫瘤標本，沿消融針道剖開，見消融灶呈類圓形，光纖尖端前方為黑色碳化區(qū)，外周為白色壞死區(qū)及粉紅色充血水腫區(qū)。HE染色后鏡下見消融壞死區(qū)細胞形態(tài)消失，緊貼消融灶周邊見大量炎癥細胞浸潤；術(shù)后7天，病灶呈灰白色壞死區(qū)，炎癥細胞浸潤區(qū)伴少許纖維肉芽組織增生；術(shù)后14天，壞死灶周圍可見淋巴細胞、漿細胞、多核巨細胞浸潤，同時可見梭形纖維組織及肉芽組織增生。在消融灶另一端的殘癌組織呈白色魚肉樣，無包膜，HE染色后腫瘤組織內(nèi)可見浸潤性癌巢，癌細胞排列不規(guī)則（圖1D）。

超聲造影定量分析技術(shù)評價殘余瘤與炎癥帶在消融術(shù)后1、3、7及14天，除正常肝組織外，共劃定70個ROI，包括殘癌區(qū)34個和炎癥區(qū)36個。殘癌與消融灶周炎癥帶超聲造影后動脈期增強形態(tài)不同：殘癌多表現(xiàn)為灶周月牙狀或結(jié)節(jié)狀增強（25/34，73.5%），少 部 分為 不 規(guī)則 環(huán) 形增 強（9/34，26.5%）；炎癥帶多為包裹在消融灶周圍的、厚度一致的環(huán)形或弧形增強（34/36，94.4%），僅2個炎癥帶表現(xiàn)為灶周不規(guī)則環(huán)形增強。

比較殘癌及消融灶周炎癥帶的超聲造影TIC曲線形態(tài)發(fā)現(xiàn)，殘癌及炎癥帶均可表現(xiàn)為Ⅰ～Ⅳ型，但殘癌曲線形態(tài)以Ⅰ型為主（22/34，64.7%），而炎癥帶曲線形態(tài)多表現(xiàn)為Ⅱ型（20/36，55.6%）。兩組的各種曲線形態(tài)構(gòu)成比差異有統(tǒng)計學意義（H=22.659，P＜0.001，表1）。

表1 殘癌及炎癥反應帶常見時間強度曲線形態(tài)比較n（%）Tab 1 Comparison of the morphologies of common time intensity curves of residual tumor and hyperemic inflammatory rim n（%）

比較殘癌和炎癥反應帶的超聲造影TIC各定量參數(shù)發(fā)現(xiàn)，在消融后不同時間段殘癌與炎癥帶的各造影定量參數(shù)值不同。消融術(shù)后第3天，殘癌與炎癥帶差異最明顯，表現(xiàn)為PI、TTP、MTT、AUC、AWI、AWO各參數(shù)值差異均有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05，表2）。

表2 兔VX2肝腫瘤部分消融后不同時間點殘余癌與消融后炎癥帶超聲造影定量參數(shù)比較Tab 2 Comparison of quantitative parameters of residual tumor and hyperemic inflammatory rim at different time points after ablation in rabbit VX2 liver tumors（x±s）

討 論

應用CT或MRI增強診斷消融后殘癌的敏感度為44%～89%［6］。因為受灶周炎癥反應帶的干擾，Dromain等［7］報道CT及MRI增強檢查最早在消融治療后4個月后才能診斷殘癌或腫瘤復發(fā)。消融治療后1個月內(nèi)鑒別殘癌與消融后炎癥帶有助于及時對殘癌補充治療，從而提高患者的生存機會。

超聲造影定量分析技術(shù)利用不同的數(shù)學模型對超聲造影圖像進行擬合，形成TIC，并獲得相應的定量參數(shù)。超聲造影定量分析技術(shù)對腫瘤的鑒別診斷及抗血管生成的療效已見報道［8-9］。本研究發(fā)現(xiàn)超聲造影定量分析技術(shù)可用于早期鑒別兔VX2肝腫瘤消融后殘癌與灶周炎癥帶，分析兩組在消融后各時間節(jié)點定量參數(shù)的差異，消融后第3天兩者差異最為顯著，推測這與消融后炎癥帶的病理變化特點相關(guān)：消融灶周圍受術(shù)后熱損傷影響，出現(xiàn)充血、水腫、中性粒細胞和巨噬細胞浸潤為主的急性炎癥反應，在消融后第3天炎性反應達高峰。分析該時間窗超聲造影TIC曲線發(fā)現(xiàn)，炎癥反應帶的PI、總AUC、AWI及AWO等參數(shù)值明顯高于殘癌。由此可見，術(shù)后第3天血流量是鑒別殘癌和消融后炎癥帶的敏感指標?？紤]原因是受熱損傷影響，消融后早期炎癥反應帶內(nèi)小血管明顯擴張充血，表現(xiàn)為高灌注狀態(tài)，血流量明顯增多，強度高于同時間段殘癌內(nèi)的血流量。我們的實驗結(jié)果表明，超聲造影定量分析技術(shù)可鑒別消融后炎癥反應帶與殘癌，并且時間明顯早于增強CT及增強MRI。

本研究中超聲造影后動脈相殘癌與炎癥反應帶呈現(xiàn)不同的增強形態(tài)。殘癌多為局灶形或不規(guī)則形外周增強；炎癥反應帶引起的外周邊緣增強多呈環(huán)形或弧形，厚度均勻，并包裹消融壞死區(qū)。研究顯示，增強CT及增強MRI也可以觀察到這種改變，但僅依靠增強形態(tài)差異鑒別殘癌及炎癥帶難度較大［10］。本研究還發(fā)現(xiàn)，各個時間段殘癌與炎癥反應帶的超聲造影TIC有顯著差異。殘癌TIC以速升速降型為主，這與腫瘤的血供特點有關(guān)：一方面，腫瘤病灶內(nèi)新生微小動脈血管異常增生，使肝動脈的優(yōu)勢供血比例遠超門靜脈，進入病灶內(nèi)血流量較正常肝組織明顯增多；另一方面，腫瘤病灶缺乏門靜脈供血及瘤體內(nèi)動靜脈瘺的存在，在門脈相及延遲相造影劑表現(xiàn)出快速廓清［11］。炎癥反應帶在消融后早期表現(xiàn)為急性炎癥反應，血管擴張，流速增加，超聲造影后炎癥反應帶動脈相增強程度明顯高于周邊肝組織，因門靜脈仍持續(xù)供血，門脈相病灶仍呈高回聲或等回聲改變，TIC表現(xiàn)為速升緩降型。需注意的是，殘癌與炎癥反應帶的TIC形態(tài)仍存在部分重疊，需結(jié)合定量參數(shù)一起分析，以減少偏差。

本研究中，為建立殘余腫瘤及消融后炎癥帶共存的動物模型，我們應用了激光消融技術(shù)。激光消融是一種局部熱消融方法，可運用于小肝癌的消融治 療［12］。本 研 究中 兔VX2腫瘤 移 植2周 后 瘤體大小為8～13 mm，腫瘤體積較小，相比射頻或微波針，單根激光針更細，消融時的脈沖頻率和強度可控，消融范圍更精確，更適宜制作部分消融模型。本研究應用超聲引導下激光消融方法制作兔VX2肝腫瘤部分消融模型，成功率達到93.7%（15/16），未產(chǎn)生明顯并發(fā)癥，同時能比較清楚地呈現(xiàn)一側(cè)的殘余癌及另一側(cè)包括消融壞死灶的炎癥反應帶。

本研究有一定局限性：（1）VX2腫瘤來源于兔的病毒誘導的乳頭狀瘤，其病理特征可能與人肝細胞肝癌不同，也缺乏原發(fā)性肝癌的肝硬化背景［13］；（2）隨訪期比較短，僅在消融后早期（術(shù)后1、3、7及14天）4個時間點對殘癌與炎癥反應帶進行超聲造影定量分析；（3）樣本量較小。今后可以增加實驗動物數(shù)目及種類，觀察不同模型中遠期殘癌及炎癥反應帶的特點，并加以比較和進一步評價。

綜上所述，超聲造影定量分析技術(shù)有助于兔VX2肝腫瘤激光消融后殘癌與炎癥反應帶的早期鑒別診斷。消融后第3天是鑒別的最佳時間點，超聲造影后病灶增強形態(tài)、TIC曲線形態(tài)及擬合后產(chǎn)生的各定量參數(shù)均有參考價值。超聲造影定量分析技術(shù)同時有超聲造影檢查實時性強、無放射損傷、可多次重復注射造影劑觀察等多種優(yōu)勢，其在肝癌消融治療后早期療效評估中將有更廣闊的應用價值。

作者貢獻聲明韓紅研究設計和實施，論文構(gòu)思和撰寫。金赟杰，范卓陽研究實施，數(shù)據(jù)采集和整理。劉嶸，季正標研究設計，論文修訂。王文平研究選題和設計，論文指導和審校。

利益沖突聲明所有作者均聲明不存在利益沖突。