張佳琳，李曉龍，王麗君，趙培寶

（聊城大學(xué)農(nóng)學(xué)與農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，山東聊城 252000）

由于人口的激增，人類面臨糧食短缺的困境，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)也面臨巨大的挑戰(zhàn)。如何避免過度使用化學(xué)農(nóng)藥對(duì)環(huán)境造成的污染、應(yīng)對(duì)不良環(huán)境條件及病原體對(duì)作物造成疾病成為亟待解決的問題。開發(fā)能夠自然提高植物活力的生物系統(tǒng)，抵御生物和非生物脅迫，從而促進(jìn)它們的生長(zhǎng)，是應(yīng)對(duì)這些挑戰(zhàn)的一個(gè)可行策略。而長(zhǎng)期過度依賴化學(xué)農(nóng)藥的使用，已出現(xiàn)了嚴(yán)重的土壤、水分等生態(tài)環(huán)境問題。隨著綠色農(nóng)業(yè)發(fā)展戰(zhàn)略提出及國(guó)際大環(huán)境推動(dòng)，生物防治措施日益受到關(guān)注，選擇對(duì)環(huán)境友好、對(duì)人畜安全、并且兼具防治病蟲害的生物農(nóng)藥至關(guān)重要。木霉菌作為一種重要的生防菌，屬于叢梗孢科的一種腐生型絲狀真菌，其主要存在于森林、草地等較為潮濕的生態(tài)環(huán)境中，廣泛分布于土壤、根際、葉圍等環(huán)境中[1]。木霉由于其適應(yīng)環(huán)境能力強(qiáng)，可以在各種有機(jī)和無機(jī)營(yíng)養(yǎng)源中定殖。木霉種類有200 余種，常見的木霉有綠色木霉菌、哈茨木霉菌、深綠木霉菌、里氏木霉菌和長(zhǎng)枝木霉菌等。在病害防治方面，木霉對(duì)病原真菌和細(xì)菌的抑制作用主要通過競(jìng)爭(zhēng)、誘導(dǎo)抗性、重寄生、抗生作用來實(shí)現(xiàn)。木霉的競(jìng)爭(zhēng)作用是通過在適宜環(huán)境中迅速繁殖實(shí)現(xiàn)對(duì)植物根系形成保護(hù)，利用其自身強(qiáng)大的空間利用能力和營(yíng)養(yǎng)吸收能力來破壞病原菌對(duì)植物的侵染。誘導(dǎo)抗性作用是木霉菌以病原菌相關(guān)分子模式（MAMPs）或損傷相關(guān)分子模式（DAMPs）激活免疫反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)木霉菌誘導(dǎo)植物抗性。重寄生作用是指病原菌被木霉菌識(shí)別、接觸、穿透后實(shí)現(xiàn)對(duì)病原菌菌絲的溶解?？股饔檬峭ㄟ^木霉菌與病原菌互作過程中產(chǎn)生的乙烯、氫氰酸等揮發(fā)性代謝產(chǎn)物及抗菌肽等非揮發(fā)性次生代謝產(chǎn)物來抑制病原菌生長(zhǎng)，且通過改變次生代謝產(chǎn)物及其功能基因可提高木霉菌抗脅迫作用[2]。

隨著對(duì)木霉生防機(jī)制研究的深入，木霉的生防作用不僅存在于木霉與病原菌之間，同時(shí)也存在于木霉與植物之間。木霉與植物互作存在很多的過程，例如木霉與植物之間的互相識(shí)別、兩者之間的激素信號(hào)的傳遞、誘導(dǎo)植物系統(tǒng)抗性的激活等[3]。本文通過對(duì)木霉與植物互作生物防治機(jī)理及木霉與植物互作過程木霉產(chǎn)生的效應(yīng)蛋白參與免疫防御反應(yīng)方面進(jìn)行綜述，以期明確木霉在與植物互作過程中的作用機(jī)理，提高木霉菌的生物防治效果及在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)方面的應(yīng)用潛力。

1 木霉與植物互作生物防治機(jī)理

植物依靠自身各種重要的生理生化過程來適應(yīng)不同生態(tài)環(huán)境條件。目前植物受到許多嚴(yán)酷的環(huán)境脅迫及各種寄生病原物的攻擊，如病毒、細(xì)菌或真菌，這往往導(dǎo)致植物生長(zhǎng)遲緩或產(chǎn)生疾病。為了適應(yīng)生存環(huán)境的改變，通過長(zhǎng)期的共同進(jìn)化，植物已產(chǎn)生許多策略來對(duì)付它們的敵人。為了防止病原微生物的入侵，利用了固有的兩層免疫系統(tǒng)，即基于PAMP/MAMPs 誘導(dǎo)初級(jí)防御觸發(fā)免疫（PTI）來感知對(duì)抗入侵微生物和第二道防御效應(yīng)器觸發(fā)免疫（ETI）感知微生物的效應(yīng)因子，從而快速增強(qiáng)寄主防御反應(yīng)[4]。通過識(shí)別病原體衍生的信號(hào)分子MAMPs 或DAMPs，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)外部病原體的早期識(shí)別，激活免疫反應(yīng)。木霉菌通過產(chǎn)生分泌蛋白、次生代謝物、細(xì)胞壁降解酶等作為效應(yīng)子，通過分別增強(qiáng)MAMPs/DAMPs 分子和效應(yīng)子激發(fā)的兩種免疫反應(yīng)、減弱效應(yīng)子引起的感病反應(yīng)這三種途徑實(shí)現(xiàn)木霉菌誘導(dǎo)植物抗性。寄主植物所產(chǎn)生的復(fù)雜的先天免疫系統(tǒng)在許多生態(tài)系統(tǒng)抵御破壞性病原體的反應(yīng)機(jī)制中已經(jīng)得到證實(shí)。為了抵制入侵者，植物進(jìn)化出系統(tǒng)獲得性抗性（SAR）和誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性（ISR），通過激活水楊酸和茉莉酸的產(chǎn)生來觸發(fā)植物的防御反應(yīng)[5]。盡管SAR 和ISR 通過不同的生理激素途徑發(fā)揮不同的作用，但有研究表明這些不同類型激素之間存在重疊功能。通過介導(dǎo)致病相關(guān)基因非表達(dá)者信號(hào)傳導(dǎo)的免疫系統(tǒng)，激活分子機(jī)制復(fù)合體對(duì)遠(yuǎn)端病原微生物的系統(tǒng)抗性。

有益微生物是指能夠刺激共生宿主植物的生長(zhǎng)發(fā)育，促進(jìn)水和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，增強(qiáng)對(duì)病原體的免疫力。常見有益微生物包括植物促生長(zhǎng)根瘤菌和植物促生長(zhǎng)真菌，通常生活在根表面的根際或是寄生植物的內(nèi)生菌?，F(xiàn)有研究表明，木霉菌是一種常見的有益微生物，通過菌絲表面分泌疏水蛋白來識(shí)別植物根部表皮細(xì)胞，以附著胞形式實(shí)現(xiàn)菌絲附著，進(jìn)而菌絲滲透到植物表皮內(nèi)部，并分泌纖維素酶降解細(xì)胞壁，在定殖過程會(huì)受到水楊酸調(diào)控[6]。同時(shí)作為土壤中的一種促生菌，木霉菌可在根際生長(zhǎng)繁殖后促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育、提高產(chǎn)量。

2 木霉與植物互作過程產(chǎn)生的效應(yīng)蛋白

2.1 半胱氨酸蛋白

半胱氨酸蛋白具有LysM 重復(fù)序列，是木霉中分泌蛋白最豐富的一種蛋白，對(duì)應(yīng)于4 個(gè)及以上半胱氨酸殘基。幾丁質(zhì)是真菌細(xì)胞壁的主要成分，在植物識(shí)別病原體激活宿主免疫反應(yīng)起到重要的作用，幾丁質(zhì)酶參與植物病原真菌細(xì)胞壁中幾丁質(zhì)的催化分解，釋放具有生長(zhǎng)素運(yùn)輸抑制劑等有絲分裂和形態(tài)形成作用的寡糖[7]。LysM 效應(yīng)子不僅可以保護(hù)真菌菌絲，干擾植物傳遞幾丁質(zhì)酶的活性，還能通過阻止真菌細(xì)胞壁產(chǎn)生的幾丁質(zhì)片段，避免免疫反應(yīng)的發(fā)生?，F(xiàn)有研究表明，黃分枝桿菌含有LysM 結(jié)構(gòu)域的效應(yīng)蛋白Ecp6，通過擾亂幾丁質(zhì)觸發(fā)的宿主免疫來介導(dǎo)毒力，在感染植物過程中，Ecp6通過隔離入侵菌絲細(xì)胞壁釋放的幾丁質(zhì)寡糖來防止宿主免疫。Romero 等人研究表明，深綠木霉產(chǎn)生LysM 蛋白Tal6，能夠與復(fù)合幾丁質(zhì)結(jié)合，保護(hù)菌絲免受幾丁質(zhì)酶的侵害，增加真菌寄生能力，并調(diào)節(jié)植物防御系統(tǒng)的激活[8]。

2.2 cerato platanins蛋白

cerato platanins蛋白是一種非催化分泌蛋白，能夠削弱細(xì)胞壁纖維素聚集體。CP蛋白家族通過保守的氨基酸殘基與幾丁質(zhì)等低聚物結(jié)合，識(shí)別潛在病原體分子模式，誘導(dǎo)免疫防御反應(yīng)。大部分的CP 蛋白都是在真菌細(xì)胞壁中分泌和定位的，這類蛋白在真菌和宿主植物的相互作用中發(fā)揮積極作用。綠色木霉、深綠木霉與植物互作分別產(chǎn)生小蛋白sm1/sm2/sm3 和誘導(dǎo)植物應(yīng)答Epl1/Epl2/Epl3。Cheng 等研究發(fā)現(xiàn)，sm1/Epl1 可以作為微生物或微生物相關(guān)分子模式刺激植物免疫反應(yīng)，sm1/Epl1 蛋白的單體在玉米中可以誘導(dǎo)植物防御反應(yīng)，二聚體可以阻斷ISR 激活；與sm1/Epl1相比，Sm2/Epl2 蛋白在玉米根系定植中作用更加明顯[9]。Azzagli 等人研究表明，綠色木霉在植物根系定殖過程中，sm1 表達(dá)增強(qiáng)，在sm1 浸入玉米和棉花葉片，有助于防治炭疽病，激活植物免疫系統(tǒng)[10]。

2.3 疏水蛋白

疏水蛋白是一種分泌蛋白質(zhì)，只存在于真菌中，由8 個(gè)保守的半胱氨酸殘基構(gòu)成，其表面活性較高，具有高度疏水性。疏水蛋白位于菌絲和分生孢子細(xì)胞壁的外表面，參與了木霉菌菌絲與植物根系的附著，介導(dǎo)真菌與環(huán)境之間的相互作用，以及在真菌與寄生蟲相互作用中形成附著胞。在綠色木霉中發(fā)現(xiàn)關(guān)于編碼疏水蛋白的基因，在木霉與植物互作過程中發(fā)揮作用。Huang 等研究表明，施用純化的重組疏水蛋白于楊樹幼苗，可以激活茉莉酸和水楊酸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，說明疏水蛋白參與促進(jìn)楊樹植物的生長(zhǎng)和防御[11]。Ruocco 等人研究發(fā)現(xiàn)，敲除長(zhǎng)枝木霉中疏水蛋白HYTLO1，其拮抗活性和促進(jìn)植物的生長(zhǎng)能力下降，說明該蛋白可以激活防御反應(yīng)促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育[12]。

2.4 糖基水解酶

糖基水解酶是一類以內(nèi)切或外切方式水解糖苷鍵的酶，參與生物體糖的合成與水解，存在于大部分的生物體中。研究證實(shí)在木霉與植物互作過程中能夠產(chǎn)生這類蛋白質(zhì)，Saravanakumar 等人通過在玉米葉片上施用哈茨木霉Thph1 和Thph2 兩種酶后，導(dǎo)致游離胞漿鈣含量的提高及活性氧的產(chǎn)生[13]。通過構(gòu)建Thph1和Thph2 哈茨木霉缺失突變體，使得玉米中茉莉酸和乙烯信號(hào)通路相關(guān)基因的表達(dá)受到抑制。在酵母雙雜交系統(tǒng)中，Thph1和Thph2分別與植物的自噬相關(guān)蛋白和發(fā)芽樣蛋白結(jié)合，這種分子相互識(shí)別作用為分析這些靶標(biāo)的細(xì)胞定位和參與誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性提供了可能。

2.5 金屬蛋白酶

這類蛋白通過保留一定量的金屬離子來保持酶的活性，常見的金屬蛋白酶有胰蛋白酶、中性蛋白酶和嗜熱菌蛋白酶等。這類蛋白是關(guān)于致病真菌組織降解相關(guān)的蛋白水解酶，Tvmp1 基因是金屬蛋白酶家族的主要成員之一，Khang 等人研究表明在深綠色木霉兩種真菌與擬南芥接觸前期Tvmp1 基因表達(dá)上調(diào)，但在接觸和生長(zhǎng)發(fā)育階段不進(jìn)行表達(dá)，說明該基因可能在木霉與植物互作早期誘導(dǎo)植物抗性發(fā)揮作用[14]。同樣，Jia 等人在水稻稻瘟菌中發(fā)現(xiàn)Avr-Pita 蛋白與曲霉菌和青霉菌的金屬蛋白酶具有同源性，可以誘導(dǎo)水稻產(chǎn)生抗性，也證明在誘導(dǎo)植物抗性中發(fā)揮作用[15]。

2.6 具有CFEM結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)

作為木霉屬中分泌較豐富的一類蛋白質(zhì)，常見于真菌細(xì)胞外膜上。這類蛋白常作為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)器或宿主病原體相互作用中的粘附分子或細(xì)胞表面受體來發(fā)揮作用[16]。通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，在綠色木霉和深綠木霉中含有一些CFEM 結(jié)構(gòu)的蛋白，參與和植物互作的過程中，但并非所有CFEM 蛋白都能作為植物防御的調(diào)節(jié)因子。tacfem1 是CFEM 家族成員蛋白之一，Reithner等人研究表明，該基因在與番茄紅素AG-4和辣椒紅素的對(duì)抗試驗(yàn)中可以誘導(dǎo)植物抗性[17]。稻瘟病菌中的Pth11 蛋白參與附著孢子的形成，在寄主定殖中發(fā)揮作用，這表明tacfem1可能在植物和真菌的寄主定殖中發(fā)揮作用。

2.7 絲氨酸蛋白酶

絲氨酸蛋白酶種類豐富，它的酶催化活性位點(diǎn)上包含絲氨酸，通過斷裂大分子蛋白質(zhì)中的肽鍵使之成為小分子，參與真菌代謝和附著胞形成[18]。絲氨酸蛋白酶家族的tvsep1 在木霉與植物接觸時(shí)和接觸之前表達(dá)上調(diào)，tvsep3 僅在接觸時(shí)表達(dá)上調(diào)。由于絲氨酸蛋白酶能夠降解肽鍵中的水解活性，tvsep1 和tvsep3 可能參與保護(hù)木霉菌菌絲免受宿主催化酶的侵害。Pozo等研究發(fā)現(xiàn)，用過表達(dá)絲氨酸蛋白酶的綠色木霉感染棉花幼苗，棉花幼苗表現(xiàn)出較少的病癥，表明其可能在誘導(dǎo)植物抗性中發(fā)揮作用[19]。

2.8 硫氧還蛋白

硫氧還蛋白是植物與真菌互作過程中產(chǎn)生的效應(yīng)物和抗氧化劑，是一種NADPH 依賴的二聚體硒酶，通過半胱氨酸-巰基-二硫化物交換促進(jìn)其他蛋白質(zhì)的還原[20]。其家族中有2 種重要的硫氧還蛋白：硫氧還蛋白1（Trx1）和硫氧還蛋白2（Trx2）。由于硫氧還蛋白能夠直接與凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1-ask1 結(jié)合，從而抑制導(dǎo)致凋亡的應(yīng)激信號(hào)激活。研究表明，深綠木霉與擬南芥互作過程中，Trx2 表達(dá)上調(diào)，說明這種蛋白可能參與共生關(guān)系的建立，誘導(dǎo)植物的抗性[21]。

3 小結(jié)

目前，木霉是應(yīng)用最為廣泛的生物防治真菌之一，不僅可以直接抑制病原菌的生長(zhǎng)，還可以通過誘導(dǎo)植物系統(tǒng)抗性來應(yīng)對(duì)病蟲害的威脅。此外，木霉的使用大大減少了化學(xué)農(nóng)藥對(duì)環(huán)境的危害。關(guān)于木霉與植物互作機(jī)理的研究是熱點(diǎn)，植物系統(tǒng)抗性的產(chǎn)生與木霉產(chǎn)生的許多物質(zhì)有關(guān)，通過了解木霉與植物的互作過程可以更加清楚木霉的生物防治機(jī)理，提高木霉生物防治的效果?，F(xiàn)關(guān)于木霉與植物互作相關(guān)效應(yīng)蛋白的研究較少，對(duì)接種木霉后植物轉(zhuǎn)錄組、蛋白組的改變的報(bào)道也比較少，而且研究的植物也比較受限制，大部分是在木霉與擬南芥、水稻、番茄及玉米等植物上，對(duì)于園林觀賞植物的應(yīng)用較少。隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展，關(guān)于木霉與植物互作產(chǎn)生的效應(yīng)子研究將不斷增多，對(duì)這一過程產(chǎn)生的分泌蛋白功能將進(jìn)一步明確，這將有利于明確木霉與植物互作過程中信號(hào)傳遞，從而探明木霉與植物互作的機(jī)理，為木霉的高效開發(fā)利用提供理論依據(jù)。