李新愛(ài)，郭文秀，張燁，張旭，尹勝，王欣宇，郭大樂(lè)*，鄧赟*

1(成都中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，四川 成都，611137)2(會(huì)東高川天源農(nóng)業(yè)科技有限公司，四川 涼山彝族自治州，615000)

塊菌，又稱松露，隸屬Tuber屬塊菌科Tuberaceae，是一類著名的菌根型野生食藥用菌，研究表明塊菌含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及生物活性物質(zhì)，主要含有17種氨基酸、8種維生素、以及多糖、蛋白質(zhì)、雄性酮、甾醇、多酚、鞘脂、脂肪酸、微量元素等。具有增強(qiáng)免疫力、抗氧化、抗腫瘤、益胃、清神、止血、療痔等多種生物活性，是藥物的潛在替代品[1]。研究發(fā)現(xiàn)塊菌中具有活性的多糖和次生代謝產(chǎn)物(多酚、甾醇及黃酮類成分)，能抑制或減緩其他分子氧化，能夠有效清除DPPH自由基、ABTS陽(yáng)離子自由基、羥自由基等自由基，具有較好的抗氧化能力。人體進(jìn)行代謝時(shí)，自由基在線粒體內(nèi)產(chǎn)生，多余的自由基可以被抗氧化劑清除進(jìn)而維持其在體內(nèi)的代謝平衡。但是，一些外部因素，如吸煙、環(huán)境污染、工業(yè)溶劑、臭氧、一些藥品和農(nóng)藥等，可促進(jìn)自由基的產(chǎn)生，打破體內(nèi)平衡，進(jìn)而引發(fā)機(jī)體衰老以及癌癥、動(dòng)脈粥樣硬化、肺氣腫等疾病[2-3]。因此，天然氧化劑的發(fā)現(xiàn)，有助于延緩人的衰老，降低這些疾病出現(xiàn)的概率。

據(jù)估計(jì)，塊菌屬在全球有180種之多，我國(guó)目前已報(bào)道有60余種。目前關(guān)于塊菌研究，多集中于物種多樣性、生態(tài)學(xué)、遺傳學(xué)、人工栽培等方面，化學(xué)成分方面多聚焦于多糖及其揮發(fā)性成分，至今尚無(wú)其系統(tǒng)化學(xué)成分分析的研究，且多集中于印度塊菌，會(huì)東塊菌等[1]?；诖耍緦?shí)驗(yàn)采用超高效液相色譜-四極桿-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜法(ultra-performance liquid chromatography- tandem q-exactive quadrupole-electrostatic field track trap high resolution mass spectrometry，UPLC-Q-Orbitrap HRMS)借助Compound Discoverer 3.0軟件，根據(jù)化合物的精確相對(duì)分子質(zhì)量、色譜保留時(shí)間、特征離子碎片信息，并結(jié)合數(shù)據(jù)庫(kù)和相關(guān)文獻(xiàn)比對(duì)，對(duì)假喜馬拉雅塊菌的營(yíng)養(yǎng)成分進(jìn)行鑒定，根據(jù)化合物的質(zhì)譜信息，結(jié)合對(duì)照品、數(shù)據(jù)庫(kù)及文獻(xiàn)信息對(duì)假喜馬拉雅塊菌中的化學(xué)成分進(jìn)行鑒定，以期為其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)、質(zhì)量評(píng)價(jià)及物種鑒定方面提供參考，通過(guò)對(duì)其抗氧化能力進(jìn)行研究，為資源的有效利用提供幫助。充分挖掘塊菌的食藥用價(jià)值，把塊菌中的有效成分應(yīng)用于食品、藥品、保健品及化妝品中，進(jìn)一步推進(jìn)塊菌產(chǎn)業(yè)發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 藥材

假喜馬拉雅塊菌于2020年12月采集于四川省攀之花市會(huì)東縣(20200806)，將其進(jìn)行測(cè)序，根據(jù)形態(tài)特征和18S rRNA基因序列比對(duì)，鑒定為T.pesudohimalayense。該菌種現(xiàn)保存于成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院生化制藥實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 試劑

苯丙氨酸、亮氨酸、L-酪氨酸對(duì)照品，中國(guó)食品藥品檢定研究院；L-谷氨酸對(duì)照品，成都市科隆化學(xué)品有限公司；腺苷，英國(guó)PureChemLand公司；苯甲酸、油酰胺、沒(méi)食子酸對(duì)照品(對(duì)照品純度均>98%)，成都克洛瑪生物科技有限公司；碳酸鈉、水楊酸鈉、硫酸亞鐵、過(guò)氧化氫、鐵氰化鉀、三氯乙酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氯化鐵、碳酸鈉，北京化工廠；福林酚試劑，北京索萊寶試劑公司；水為娃哈哈純凈水；乙腈、甲醇(色譜純)，成都科隆化學(xué)品有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Vanquish型超高效液相色譜聯(lián)用Q-Exactive型四極桿-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜儀、Varioskan LUX多功能酶標(biāo)儀，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；SL302 N萬(wàn)分之一電子天平，上海民僑精密科學(xué)儀器有限公司；QE-50型高速粉碎機(jī)，浙江屹立工貿(mào)有限公司；SCIENTZ-10 N冷凍干燥機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；超聲波清洗機(jī)，成都雅源科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 UPLC-Q-Orbitrap HRMS分析

1.3.1.1 供試品溶液

將新鮮假喜馬拉雅塊菌，冷凍干燥，將凍干的假喜馬拉雅塊菌粉碎，稱取適量本品粉末(過(guò)二號(hào)篩)約1 g，精密稱定，置50 mL錐形瓶中，精密加入80%甲醇25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，浸泡1 h，超聲處理(150 W，40 kHz)30 min，放冷，稱定質(zhì)量，用80%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過(guò)0.22 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液[4-6]，備用。

1.3.1.2 對(duì)照品溶液

取苯丙氨酸、亮氨酸、L-谷氨酸、L-酪氨酸、腺苷、苯甲酸、油酰胺、吡嗪對(duì)照品適量，加甲醇超聲使溶解并定容至25 mL，配制成質(zhì)量濃度約0.05 g/L的混合對(duì)照品，溶液置于4 ℃冰箱中保存，使用時(shí)過(guò)0.22 μm 微孔濾膜。

1.3.1.3 檢測(cè)條件

(1)色譜條件

Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)，流動(dòng)相0.1%乙酸水溶液(A相)-乙腈(B相)梯度洗脫:(0～4 min，5% B；4～7 min，5%～10% B；7～10 min，10%～16% B；10～20 min，16～32% B；20～24 min，32%～60% B；24～30 min，60% B；30～36 min，60%～70% B；36～43 min，70%～95% B；43～46 min， 95% B，流速0.3 mL/min，進(jìn)樣量3 μL，柱溫30 ℃。

(2)質(zhì)譜條件

離子源：采用電噴霧離子源(ESI)，掃描方式：正、負(fù)離子監(jiān)測(cè)模式，正負(fù)離子源電壓：3 500～3 000 V，質(zhì)量掃描范圍：m/z100～1 500；裂解電壓：(ESI+)3.5 kV和(ESI-)3.0 kV，鞘氣流速：35 L/min，輔助氣流量：10 L/min，離子傳輸管溫度：300 ℃，輔助氣溫度：350 ℃。掃描模式為全掃描/數(shù)據(jù)依賴二級(jí)掃描(Full MS/dd-MS 2)，一級(jí)分辨率70 000，二級(jí)分辨率17 500。MS/MS模式時(shí)，正、負(fù)離子模式下的碰撞能量梯度為20、40、60 eV。

1.3.1.4 數(shù)據(jù)處理

將UPLC-Q-Orbitrap HRMS所采集的原始數(shù)據(jù)導(dǎo)入到Compound Discoverer 3.0軟件進(jìn)行計(jì)算，對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行峰對(duì)齊和峰提取，利用Compound Discoverer 3.0將提取得到的分子離子色譜峰、同位素峰擬合出分子式，將所得結(jié)果與數(shù)據(jù)庫(kù)mzCloud，mzVault及本地中藥成分高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)OTCML進(jìn)行匹配，對(duì)匹配結(jié)果設(shè)置過(guò)濾參數(shù)為峰面積閾值8萬(wàn)，一級(jí)準(zhǔn)分子離子及二級(jí)碎片離子質(zhì)量偏差5 ppm(1 ppm=1×106)，匹配度分值>80。對(duì)過(guò)濾后的目標(biāo)化合物的質(zhì)譜信息與對(duì)照品、相關(guān)文獻(xiàn)信息比對(duì)，進(jìn)行化合物的鑒定[7-8]。

1.3.2 抗氧化活性測(cè)試

1.3.2.1 塊菌提取物的制備

將新鮮的假喜馬拉雅塊菌，冷凍干燥，后將凍干的假喜馬拉雅塊菌粉碎，稱取適量本品粉末(過(guò)二號(hào)篩)約2 g，精密稱定，置100 mL錐形瓶中，精密加入80%甲醇(純水)50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，浸泡1 h，超聲處理(150 W，40 kHz)30 min，放冷，稱定質(zhì)量，用80%甲醇(純水)補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過(guò)濾，重復(fù)上述操作，合并2次濾液后，旋轉(zhuǎn)濃縮至10 mL。后將提取物配制成所需濃度[3]。

1.3.2.2 DPPH自由基清除活性測(cè)定

DPPH自由基清除能力測(cè)定根據(jù)文獻(xiàn)描述方法稍作修改[3]。將甲醇、水提取物的不同質(zhì)量濃度(1～65 mg/mL)的等分試樣80 μL與1 mL 25 μg/mL DPPH甲醇溶液混合，劇烈搖動(dòng)混合物，黑暗條件下，靜置30 min，以96孔板為反應(yīng)載體，酶標(biāo)儀在517 nm 處檢測(cè)其OD值。以維生素C為陽(yáng)性對(duì)照，每個(gè)樣品平行測(cè)定3次，取平均值。根據(jù)公式(1)計(jì)算塊菌提取物對(duì)DPPH自由基的清除率：

(1)

式中：A0為空白對(duì)照的OD值，Ai為加入樣品或者陽(yáng)性對(duì)照后的OD值。

1.3.2.3 ABTS陽(yáng)離子自由基清除活性測(cè)定

ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力測(cè)定參照文獻(xiàn)稍作改動(dòng)[3]，配制7 mmol/L ABTS陽(yáng)離子和4.9 mmol/L過(guò)硫酸鉀溶液，等體積混合均勻，室溫避光貯存12 h以上，根據(jù)吸光度用無(wú)水乙醇稀釋40～60倍至吸光度為0.7±0.02，即為ABTS陽(yáng)離子儲(chǔ)備液。將 0.2 mL ABTS陽(yáng)離子儲(chǔ)備液與10 μL不同質(zhì)量濃度(0.0625、0.125、0.25、0.5、1、2、4 mg/mL)的塊菌提取液混合，常溫避光靜置6 min，以96孔板為反應(yīng)載體，酶標(biāo)儀734 nm處測(cè)定OD值，每個(gè)樣品平行測(cè)定3次，取平均值，用等量的超純水代替樣品作為空白對(duì)照，維生素C作陽(yáng)性對(duì)照，根據(jù)公式(2)計(jì)算ABTS陽(yáng)離子自由基清除率。

(2)

式中：A0為空白對(duì)照的OD值，Ai為加入樣品或者陽(yáng)性對(duì)照后的OD值。

1.3.2.4 羥自由基清除活性測(cè)定

羥自由基清除能力測(cè)定參照文獻(xiàn)的方法稍作修改[3]。分別移取20 mmol/L水楊酸鈉0.3 mL和1.5 mmol/L的硫酸亞鐵1.0 mL于各試管中，再分別加入不同質(zhì)量濃度(2～12 mg/mL)的塊菌樣品提取液1.0 mL，最后加入0.7 mL mmol/L H2O2，迅速混勻，37 ℃恒溫水浴1 h，以96孔板為反應(yīng)載體，酶標(biāo)儀在510 nm下測(cè)定其OD值。每個(gè)樣品平行測(cè)定3次，取其平均值。以80%甲醇作為空白對(duì)照，維生素C作為陽(yáng)性對(duì)照。根據(jù)公式(3)計(jì)算塊菌提取物對(duì)羥自由基的清除率：

(3)

1.3.2.5 還原能力測(cè)定

還原能力測(cè)定參照文獻(xiàn)[3]方法。將不同濃度的塊菌樣品提取液1 mL與2.5 mL磷酸緩沖液(200 mmol/L，pH 6.6)混合，加入10 g/L鐵氰化鉀溶液2.5 mL，混合物于50 ℃恒溫20 min后加入1 mL 100 g/L三氯乙酸，3 000 r/min離心分離10 min，取上層清液2.5 mL，加入去離子水2.5 mL以及1 g/L新鮮配制的三氯化鐵溶液0.5 mL，酶標(biāo)儀700 nm處測(cè)定其OD值。OD值越高，說(shuō)明反應(yīng)混合物的還原性越強(qiáng)，每個(gè)樣品平行測(cè)3次，取其平均值。用維生素C作為陽(yáng)性對(duì)照，用等量的超純水代替樣品作為空白對(duì)照。

1.3.2.6 總酚含量的測(cè)定

總酚含量測(cè)定參照文獻(xiàn)[3]方法稍作修改。將1 mL 質(zhì)量濃度為8 mg/mL的塊菌樣品溶液與1 mL福林酚混合，靜置3 min后，加入1 mL 350 g/L碳酸鈉，然后加入去離子水使反應(yīng)體系稀釋至10 mL?；靹颍覝叵潞诎堤幏胖?0 min，酶標(biāo)儀725 nm處測(cè)定其OD值。利用不同質(zhì)量濃度(0.005、0.01、0.02、0.03、0.04 mg/mL)的沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品(gallic acid equivalent, GAE)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算塊菌樣品溶液中相應(yīng)的總酚含量。每個(gè)樣品平行測(cè)定3次，取其平均值。

1.3.2.7 數(shù)據(jù)處理

本文所用數(shù)據(jù)為3次平行測(cè)量，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。各個(gè)數(shù)據(jù)均用Origin 9.0軟件處理作圖，采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05時(shí)認(rèn)為樣本間具有顯著性差異；采用Pearson′s相關(guān)分析抗氧化活性與活性成分含量之間相關(guān)性[3]。

2 結(jié)果與分析

2.1 假喜馬拉雅塊菌的化學(xué)成分分析

假喜馬拉雅塊菌作為一種食藥用真菌，不僅風(fēng)味獨(dú)特，也具有極高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，采用UPLC-Q-Orbitrap HRMS分析假喜馬拉雅塊菌80%甲醇提取物的營(yíng)養(yǎng)成分，根據(jù)化合物的保留時(shí)間、一級(jí)準(zhǔn)分子離子及二級(jí)碎片離子質(zhì)量等信息，結(jié)合參考文獻(xiàn)和數(shù)據(jù)庫(kù)(mzCloud，mzVault)對(duì)其成分進(jìn)行初步鑒定。初步鑒定出51種化合物，包括13個(gè)氨基酸、11個(gè)有機(jī)酸、8個(gè)核苷類、9個(gè)酰胺類及10個(gè)其他類。經(jīng)與對(duì)照品比對(duì)其中8個(gè)成分可準(zhǔn)確鑒定，正負(fù)離子流圖見(jiàn)圖1、圖2，化合物的相關(guān)信息見(jiàn)表1。

圖1 假喜馬拉雅塊菌在UPLC-Q-Orbitrap HRMS 正離子模式下的總離子流Fig.1 Total ion chromatogram of Tuber pesudohimalayense by UPLC-Q-Orbitrap HRMS in positive ion mode

圖2 假喜馬拉雅塊菌在UPLC-Q-Orbitrap HRMS負(fù)離子 模式下的總離子流Fig.2 Total ion chromatogram of Tuber pesudohimalayense by UPLC-Q-Orbitrap HRMS in negative ion mode

2.2 各類化合物的裂解特征

2.2.1 氨基酸

氨基酸分子含有氨基和羧基2種官能團(tuán)，保留時(shí)間主要集中在0.84～3.92 min，正離子模式下，氨基酸的準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+相對(duì)豐度較低，易失去H2O、CO、COOH、NH3(18、28、46、17)形成穩(wěn)定的特征碎片，通過(guò)與數(shù)據(jù)庫(kù)及參考文獻(xiàn)比對(duì)，在假喜馬拉雅塊菌中推斷出13個(gè)氨基酸，以DL-精氨酸為例，在ESI+模式下準(zhǔn)分子離子峰175.119 1 [M+H]+，推測(cè)分子式為C6H14N4O2，在該化合物的二級(jí)質(zhì)譜中丟失1個(gè)NH3，形成離子碎片為158.092 2 [M+H-NH3]，丟失1個(gè)羧基，形成離子碎片130.097 3 [M+H-COOH]，繼續(xù)高能碰撞連續(xù)裂解失去1個(gè)亞甲基，形成碎片離子116.070 7 [M+H-COOH-CH2]，綜上與文獻(xiàn)[4-8]報(bào)道一致，因此推斷該化學(xué)成分為DL-精氨酸。

應(yīng)用所提出的ACMLGD結(jié)合文本挖掘和情感分析技術(shù)，提取在線評(píng)論中正面評(píng)價(jià)、反面評(píng)價(jià)及綜合評(píng)分等信息開(kāi)發(fā)了自動(dòng)一致性系統(tǒng)，該一致性系統(tǒng)可集成到現(xiàn)有的ERP系統(tǒng)中，用于支持企業(yè)的大型群決策活動(dòng)，也可用于集結(jié)互聯(lián)網(wǎng)產(chǎn)品用戶偏好、挖掘發(fā)現(xiàn)客戶總的一致性意見(jiàn)。現(xiàn)以自動(dòng)計(jì)算面向在線客戶偏好的大群客戶偏好為例，說(shuō)明ACMLGD的應(yīng)用。

表1 假喜馬拉雅塊菌在UPLC-Q-Orbitrap HRMS正負(fù)離子模式下的化學(xué)成分鑒定Table 1 Identification of chemical constituents in Tuber pesudohimalayense by UPLC-Q-Orbitrap HRMS in positive and negative ion mode

續(xù)表1

2.2.2 有機(jī)酸

本實(shí)驗(yàn)中在正負(fù)離子模式下，通過(guò)與數(shù)據(jù)庫(kù)及參考文獻(xiàn)比對(duì)，共推斷出11個(gè)有機(jī)酸類化合物，有機(jī)酸類化合物易丟失H2O、HCOOH、CO2等中性分子形成穩(wěn)定的碎片離子。以化合物苯甲酸為例，在ESI+模式下準(zhǔn)分子離子峰123.043 9[M+H]+，推測(cè)分子式為C7H6O2，正離子模式下丟失1個(gè)H2O，形成離子碎片105.045 1[M+H-H2O]，連續(xù)裂解丟失1個(gè)CO，形成碎片離子95.049 4[M+H-CO]，通過(guò)與文獻(xiàn)[9-11,13]比對(duì)，推斷該化合物為苯甲酸。

2.2.3 核苷類

核苷類物質(zhì)是生命活動(dòng)過(guò)程中的重要代謝產(chǎn)物，具有多樣生理活性，在抗腫瘤、保護(hù)心肌損傷等生命調(diào)節(jié)過(guò)程中起著重要作用。根據(jù)堿基不同，將核苷類物質(zhì)分為嘧啶核苷及嘌呤核苷。本實(shí)驗(yàn)中核苷類成分保留時(shí)間在1.1～3.75 min，在正離子模式下根據(jù)文獻(xiàn)及數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)推斷出8種核苷類成分，以腺苷為例，在ESI+模式下準(zhǔn)分子離子峰268.104 3[M+H]+，根據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)匹配出分子式為C10H13N5O4，二級(jí)質(zhì)譜出現(xiàn)136.060 6、119.034 1質(zhì)譜峰，推測(cè)該化合物為腺苷，二級(jí)碎片離子為[M+H-C5H8O4]+、[M+H-C5H8O4-NH3]+，與文獻(xiàn)[12-13]報(bào)道一致，因此推斷該化學(xué)成分為腺苷。

2.2.4 其他類

根據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)mzCloud，mzVault及本地中藥成分高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)OTCML與文獻(xiàn)進(jìn)行比對(duì)，從假喜馬拉雅塊菌中還推斷出芳香醛類、甾醇類、油脂類等一些化合物[13]。

2.3 假喜馬拉雅塊菌的抗氧化活性測(cè)試結(jié)果

2.3.1 DPPH自由基清除活性測(cè)定

由圖3可知，假喜馬拉雅塊菌醇提水提的提取液對(duì)DPPH自由基均有一定的清除能力，且隨著樣品質(zhì)量濃度的增大自由基清除率也隨之增加，在一定范圍內(nèi)存在量效關(guān)系。但與維生素C相比，維生素C的抗氧化能力要明顯強(qiáng)于塊菌提取物。由圖3可以看出，塊菌水提的DPPH自由基清除率的平均值要高于塊菌80%甲醇提取的平均值。表1列出了各不同溶劑提取物的EC50值(mg/mL)，塊菌水提液的EC50值平均為14.97 mg/mL，80%甲醇提取液的EC50值平均為20.90 mg/mL(表2)，對(duì)2組數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)，P<0.05，結(jié)果表明，塊菌水提DPPH抗氧化活性與80%甲醇提取抗氧化活性有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

圖3 甲醇提取物、水提物、維生素C的DPPH自由基清除能力Fig.3 DPPH radical scavenging activities of methanolic extracts, aqueous extracts and vitamin C

2.3.2 ABTS陽(yáng)離子自由基清除活性測(cè)定

由圖4可知，假喜馬拉雅塊菌80%甲醇和水提的提取液對(duì)ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力隨著樣品濃度的增大自由基清除率也隨之增加，在一定范圍內(nèi)存在量效關(guān)系。維生素C在0.062 5～4 mg/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，自由基清除率無(wú)較大波動(dòng)，維持在90%附近，說(shuō)明維生素C具有較強(qiáng)的抗氧化活性。假喜馬拉雅塊菌醇提水提后提取液雖然具有一定自由基清除效果，但是清除效果低于維生素C。由圖4可以看出，塊菌水提醇提的ABTS陽(yáng)離子自由基清除率相近，但是塊菌水提ABTS陽(yáng)離子自由基清除率的平均值要略高于塊菌80%甲醇提取的平均值。表2列出了各不同溶劑提取物的EC50值(mg/mL)，塊菌水提液的EC50值平均為0.19 mg/mL，80%甲醇提取液的EC50值平均為0.26 mg/mL，對(duì)2組數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)，P>0.05，結(jié)果表明，塊菌水提ABTS抗氧化活性與80%甲醇提取抗氧化活性無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

圖4 甲醇提取物、水提物、維生素C的ABTS陽(yáng)離子 自由基清除能力Fig.4 ABTS radical scavenging activities of methanolic extracts, aqueous extracts and vitamin C

2.3.3 羥自由基清除活性測(cè)定

由圖5可知，假喜馬拉雅塊菌羥自由基清除能力：維生素C>塊菌水提物>塊菌80%甲醇提取物,且隨著塊菌樣品濃度的增大自由基清除率也增加，存在量效關(guān)系。維生素C在2～12 mg/mL，自由基清除率穩(wěn)定維持在90%附近，說(shuō)明維生素C具有較強(qiáng)的抗氧化活性。假喜馬拉雅塊菌醇提水提后提取液雖然具有一定自由基清除效果，但是清除效果低于維生素C。表2列出了各不同溶劑提取物的EC50值(mg/mL)，塊菌水提液的EC50值平均為3.21 mg/mL，80%甲醇提取液的EC50值平均為4.71 mg/mL，對(duì)2組數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)，P<0.05，結(jié)果表明，塊菌水提抗氧化活性與80%甲醇提取抗氧化活性具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

圖5 甲醇提取物、水提物、維生素C的羥自由基清除能力Fig.5 Hydroxyl radical scavenging activities of methanolic extracts, aqueous extracts and vitamin C

2.3.4 還原能力測(cè)定

由圖6可知，在所測(cè)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，塊菌各提取物與維生素C，隨著質(zhì)量濃度的增加，還原能力都逐漸增強(qiáng)，并呈現(xiàn)出較好的量效關(guān)系。塊菌還原能力大小關(guān)系為：維生素C>塊菌水提物>塊菌80%甲醇提取物，對(duì)塊菌水提醇提2組數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)，P<0.05，結(jié)果表明，塊菌水提抗氧化活性與80%甲醇提取抗氧化活性具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

圖6 甲醇提取物、水提物、維生素C的還原能力Fig.6 Reducing power of methanolic extracts, aqueous extracts and vitamin C

2.3.5 總酚含量的測(cè)定

通過(guò)2種不同的提取溶劑對(duì)假喜馬拉雅塊菌的總酚進(jìn)行提取，塊菌水提總酚含量3.99 mg/g，塊菌80%甲醇提取總酚含量為1.87 mg/g(表2)，將不同提取物的總酚含量進(jìn)行t檢驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，塊菌水提物總酚的含量與80%甲醇提取物存在顯著性差異，水提物的總酚含量明顯高于甲醇提取，水提物的DPPH自由基、ABTS陽(yáng)離子自由基、羥自由基清除能力與還原能力也高于甲醇提取物，采用Pearson′s分析對(duì)抗氧化活性與總酚含量之間相關(guān)性進(jìn)行分析。結(jié)果表明酚類物質(zhì)含量與抗氧化活性存在一定相關(guān)性，總酚含量越高，抗氧化能力會(huì)越強(qiáng)。

3 結(jié)論

通過(guò)UPLC-Q-Orbitrap HRMS分析了假喜馬拉雅塊菌的化學(xué)成分，假喜馬拉雅塊菌中共鑒定出51種成分，其中氨基酸和有機(jī)酸含量較高，近年來(lái)，谷氨酸、精氨酸、天門冬氨酸、胱氨酸等氨基酸也單獨(dú)作用治療一些疾病，主要用于治療肝病疾病、消化道疾病、腦病、心血管病、呼吸道疾病以及用于提高肌肉活力、兒科營(yíng)養(yǎng)和解毒等[1,4,6]。有機(jī)酸一般無(wú)特殊生物活性，但是有些天然有機(jī)酸，則具有抑菌、降血糖、抗氧化以及調(diào)節(jié)機(jī)體免疫等作用，能夠增加冠狀動(dòng)脈血流量、抑制腦組織脂質(zhì)過(guò)氧化物生成、軟化血管、還有預(yù)防疾病和促進(jìn)新陳代謝等作用[10]。

表2 假喜馬拉雅塊菌提取物抗氧化能力的EC50值和總酚含量Table 2 EC50 values obtained in the antioxidant activity assays and contents of total phenolics of different extracts from Tuber pesudohimalayense

抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，同種塊菌選擇不同提取溶劑，可能會(huì)影響獲得的抗氧化代謝產(chǎn)物含量，進(jìn)而影響其抗氧化活性，假喜馬拉雅塊菌具有顯著的清除ABTS陽(yáng)離子自由基、DPPH自由基、羥自由基的能力，且水提物的自由基清除能力強(qiáng)于甲醇提取物，水提物的還原能力也強(qiáng)于甲醇提取物。通過(guò)對(duì)水提物和甲醇提取物的總酚含量測(cè)定發(fā)現(xiàn)，水提物的總酚含量明顯高于甲醇提取物，這也說(shuō)明塊菌的抗氧化活性與總酚含量成正相關(guān)。

綜上，通過(guò)對(duì)假喜馬拉雅塊菌的化學(xué)成分和抗氧化活性研究，發(fā)現(xiàn)塊菌可以作為天然抗氧化劑的來(lái)源，未來(lái)應(yīng)加快塊菌化學(xué)成分和藥理性質(zhì)的研究，充分挖掘塊菌的食藥用價(jià)值，把塊菌中的有效成分應(yīng)用于藥品、食品、保健品、化妝品中，推進(jìn)塊菌產(chǎn)業(yè)發(fā)展。