佘曉偉,孫 黎,胡俊波,徐 豐

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院胃腸外科,武漢 430030

單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)體(monocarboxylate transporters,MCTs)是由溶質(zhì)載體蛋白家族16(solute carrier 16 family)編碼的一組跨膜蛋白,在哺乳動(dòng)物中廣泛表達(dá),主要負(fù)責(zé)乳酸、丙酮酸、酮體等單羧酸的轉(zhuǎn)運(yùn)[1]。單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(monocarboxylate transporter 1,MCT1)是單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)體中尤為重要的一員,包含N-端、C-端和12次跨膜結(jié)構(gòu)域。它通過將乳酸運(yùn)輸?shù)窖趸芰?qiáng)的組織中氧化利用從而維持機(jī)體內(nèi)在平衡[2]。研究證實(shí),MCT1在多種惡性腫瘤如乳腺癌、肺癌、宮頸癌、骨肉瘤中明顯高表達(dá),并且與腫瘤的臨床分期、分級(jí)以及患者預(yù)后密切相關(guān)[3-6]。有研究發(fā)現(xiàn),在骨肉瘤細(xì)胞中沉默MCT1會(huì)抑制NFκB通路,進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞的遷移,并增加其對(duì)化療藥物的敏感性。MCT1能夠調(diào)節(jié)腫瘤內(nèi)多種信號(hào)通路,參與能量代謝、侵襲轉(zhuǎn)移、血管生成、免疫耐受等多種腫瘤生物學(xué)過程[7-10]?！澳鎃arburg效應(yīng)”是近年來解釋腫瘤能量代謝共生的一種理論,即乏氧區(qū)癌細(xì)胞利用糖酵解供能并釋放乳酸,常氧區(qū)癌細(xì)胞利用乳酸通過三羧酸循環(huán)供能。而MCT1在這一過程中扮演重要角色[11-13]。有研究發(fā)現(xiàn),腫瘤內(nèi)常氧區(qū)癌細(xì)胞依靠MCT1攝入乳酸以維持腫瘤旺盛的代謝需要[14]。然而,MCT1作為乳酸轉(zhuǎn)運(yùn)的關(guān)鍵蛋白,其對(duì)結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的影響目前尚不清楚。

CRISPR/Cas9技術(shù)是一種區(qū)別于鋅指核酸酶(ZFN)和類轉(zhuǎn)錄激活因子核酸酶(TALEN)的新興基因編輯技術(shù),最早于研究細(xì)菌和古細(xì)菌抵御外來病毒和質(zhì)粒入侵時(shí)的獲得性免疫防御機(jī)制研究中被發(fā)現(xiàn)[15]。目前該技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于基因篩選、分子記錄、細(xì)胞成像、基因治療等領(lǐng)域[16]。本研究利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建穩(wěn)定敲除MCT1基因結(jié)腸癌RKO細(xì)胞系,通過靶向干預(yù)MCT1基因的表達(dá),為進(jìn)一步探索MCT1在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展過程中的功能和分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

結(jié)腸癌RKO細(xì)胞系由本實(shí)驗(yàn)室前期保存;CRISPR-v2載體來自美國(guó)維克森林大學(xué)Hui-Kuan Lin實(shí)驗(yàn)室;大腸埃希菌DH5α感受態(tài)、PCR試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、基因組DNA提取試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒均購(gòu)自諾維贊公司;DMEM高糖培養(yǎng)液、Opti-MEM無血清培養(yǎng)液、胎牛血清均購(gòu)自Gibco公司;嘌呤霉素、乳酸購(gòu)自Sigma公司;TurboFect轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自Thermo Fisher Scientific公司;乳酸檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物科技有限公司;CCK-8(cell counting kit-8)試劑購(gòu)自MCE公司;MCT1抗體購(gòu)自Santa Cruz公司;GAPDH抗體購(gòu)自ABclonal公司;BbsⅠ限制性核酸內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶購(gòu)自Takara公司;4%多聚甲醛購(gòu)自武漢谷歌生物有限公司;山羊抗鼠Ig G紅色Dylight488熒光標(biāo)記二抗、DAPI、青霉素以及鏈霉素均購(gòu)自武漢啟動(dòng)子生物有限公司;sg RNA序列合成、PCR引物合成以及基因測(cè)序均由奧科鼎盛(武漢)生物科技有限公司完成。

1.2 sgRNA設(shè)計(jì)及構(gòu)建CRISPR/Cas9重組質(zhì)粒

從NCBI中檢索人MCT1基因組序列(NCBI Entrez Gene:6566),根據(jù)靶點(diǎn)設(shè)計(jì)原則,并針對(duì)其第二號(hào)外顯子堿基序列于在線設(shè)計(jì)網(wǎng)站(http://www.e-crisp.org)設(shè)計(jì)一對(duì)single guide RNA(sgRNA),經(jīng)過脫靶效應(yīng)評(píng)價(jià)以及同源序列比對(duì)排除后,送至奧科鼎盛(武漢)生物科技有限公司合成單鏈DNA,序列如表1所示。合成后的單鏈DNA經(jīng)過磷酸化和程序性退火之后形成雙鏈DNA。

表1 靶向MCT1基因的sg RNA序列Table 1 The sequences of sgRNA targeting MCT1 gene

將酶切后的CRISPR-v2載體與磷酸化和退火后的雙鏈DNA室溫連接2 h,然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞,經(jīng)過含氨芐青霉素的LB平板篩選后,挑取5個(gè)單克隆菌落送至奧科鼎盛(武漢)生物科技有限公司測(cè)序。序列無誤的菌液搖菌后提取質(zhì)粒,獲得純化的重組質(zhì)粒CRISPRv2-MCT1-KO#1、CRISPRv2-MCT1-KO#2。

1.3 利用嘌呤霉素篩選MCT1基因穩(wěn)定敲除的RKO細(xì)胞系

1.3.1 測(cè)定嘌呤霉素在RKO細(xì)胞中的最小致死濃度 將RKO細(xì)胞用胰酶消化后接種于6孔板中,24 h后加入不同濃度梯度的嘌呤霉素,濃度依次為:0.5、1、2、4、8μg/m L。2 d觀察細(xì)胞全部死亡最小濃度為1μg/m L,即為嘌呤霉素在RKO細(xì)胞中的最小致死濃度。

1.3.2 嘌呤霉素篩選單克隆細(xì)胞株 將正常RKO細(xì)胞系鋪于6孔板內(nèi),待細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)70%后,將2μg的CRISPRv2-MCT1-KO #1和2μg的CRISPRv2-MCT1-KO#2質(zhì)粒加至250μL Opti-MEM無血清培養(yǎng)液中,同時(shí)將5μL TurboFect加至250μL Opti-MEM無血清培養(yǎng)液中充分混勻,靜置5 min后將上述液體輕柔混勻,室溫靜置15 min。將混合液加入對(duì)應(yīng)6孔板中,轉(zhuǎn)染6 h后更換新鮮培養(yǎng)液。轉(zhuǎn)染48 h后加入含1μg/m L嘌呤霉素的培養(yǎng)液進(jìn)行篩選,直至未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的細(xì)胞完全死亡。

用無菌PBS清洗6次6孔板內(nèi)細(xì)胞,顯微鏡下觀察未發(fā)現(xiàn)明顯懸浮、死亡細(xì)胞后,進(jìn)行消化及細(xì)胞計(jì)數(shù)。先計(jì)數(shù)約1×104cells/m L,再按照1∶10的比例進(jìn)行倍比稀釋,最后至終濃度為100 cells/10 m L。將10 m L細(xì)胞懸液按照每孔100μL加入至96孔板中,置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2周并定期更換培養(yǎng)液。2周后,逐一觀察每個(gè)孔細(xì)胞生長(zhǎng)情況,標(biāo)記單克隆生長(zhǎng)細(xì)胞孔,并消化后轉(zhuǎn)移至6孔板中進(jìn)一步生長(zhǎng)。等待細(xì)胞生長(zhǎng)至適當(dāng)密度后,取一部分細(xì)胞進(jìn)行Western blot檢測(cè)及基因組檢測(cè),一部分細(xì)胞傳代后繼續(xù)培養(yǎng)。

1.4 MCT1基因敲除RKO細(xì)胞系中MCT1基因測(cè)序和蛋白表達(dá)檢測(cè)

將挑取的單克隆細(xì)胞根據(jù)基因組DNA提取試劑盒操作步驟提取基因組DNA,并設(shè)計(jì)相應(yīng)范圍的PCR引物,引物序列為:上游引物,5′-TGTCTTTTAGGTCCT-3′;下游引物,5′-CTCCAATGACTCCAA-3′。以基因組DNA為模板經(jīng)PCR擴(kuò)增后送至奧科鼎盛(武漢)生物科技有限公司測(cè)序鑒定,確定MCT1基因序列變化。

收取對(duì)照組與MCT1基因敲除的細(xì)胞提取總蛋白,經(jīng)BCA法測(cè)定細(xì)胞蛋白濃度后,選擇120 V恒壓進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳,轉(zhuǎn)膜后用5%脫脂牛奶室溫封閉1 h,TBST清洗3次;一抗4℃孵育過夜(MCT1,1∶1000;GAPDH,1∶1000),次日TBST清洗3次后室溫孵育二抗1 h;TBST清洗3次,ECL化學(xué)顯色,檢測(cè)MCT1蛋白表達(dá)情況。

1.5 免疫熒光技術(shù)檢測(cè)MCT1蛋白表達(dá)分布

將對(duì)照組與MCT1基因敲除組的細(xì)胞分別接種于24孔板內(nèi)爬片上,置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后,4%多聚甲醛室溫固定30 min;用1%BSA室溫封閉1 h;加入鼠抗人MCT1抗體,置于4℃冰箱孵育過夜;次日用1%BSA洗滌3次,加入山羊抗鼠IgG紅色Dylight熒光二抗室溫染色1 h;1%BSA洗滌3次后DPAI染核5 min,再清洗3次,最后用抗熒光淬滅劑封片。使用熒光顯微鏡觀察并拍照。

1.6 乳酸含量檢測(cè)

將對(duì)照組及MCT1基因敲除組細(xì)胞分別接種于6孔板中,待細(xì)胞完全貼壁后用無糖培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h,加入含有乳酸培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)4 h后,將6孔板中的細(xì)胞用胰酶消化;消化后的細(xì)胞按照乳酸測(cè)定試劑盒操作步驟檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)乳酸含量,測(cè)得的乳酸含量以相應(yīng)細(xì)胞蛋白濃度進(jìn)行校準(zhǔn)。

1.7 細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)以及CCK-8檢測(cè)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期對(duì)照組和MCT1基因敲除組細(xì)胞消化后細(xì)胞計(jì)數(shù),經(jīng)過稀釋后每組取500個(gè)細(xì)胞接種于6孔板中,待細(xì)胞貼壁后更換培養(yǎng)液,以后每2天更換1次新鮮培養(yǎng)液,2～3周后待培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見單克隆細(xì)胞,終止培養(yǎng);棄去培養(yǎng)液后用PBS清洗3次,4%多聚甲醛室溫固定15 min;棄去固定液后用1%結(jié)晶紫室溫染色30 min,然后緩慢沖洗染色液,空氣干燥后記錄克隆數(shù)并拍照。

同樣取上述細(xì)胞計(jì)數(shù)后接種于96孔板中(5000個(gè)/孔),每組分別設(shè)置5個(gè)復(fù)孔;等待細(xì)胞完全貼壁后吸去96孔板中培養(yǎng)液,第一排加入按1∶9配置的CCK-8工作液,其余孔更換新鮮培養(yǎng)液;并設(shè)置未接種細(xì)胞的對(duì)照孔,加入同樣條件配置的CCK-8工作液;避光放置于37℃培養(yǎng)箱中2 h后,450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定加入CCK-8試劑孔內(nèi)的吸光度值;按照上述操作測(cè)定培養(yǎng)24、48、72、96 h后細(xì)胞的吸光度值,減去對(duì)照組無細(xì)胞孔吸光度值后,根據(jù)所得值繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.8 GSEA分析

使用GSEA軟件(Version 4.0.3)、Molecular Signature Database(MsigDB)數(shù)據(jù)庫(kù)中的Hallmark gene sets(Version 7.1)數(shù)據(jù)集以及GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中結(jié)直腸癌數(shù)據(jù)集(GSE39582)對(duì)MCT1進(jìn)行GSEA分析[17]。隨機(jī)組合次數(shù)設(shè)為1000次,其他設(shè)置參數(shù)均按照軟件默認(rèn)。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行繪圖及數(shù)據(jù)處理。兩組間均數(shù)的比較采用t檢驗(yàn),以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 CRISPRv2-MCT1-KO質(zhì)粒測(cè)序鑒定

構(gòu)建的CRISPRv2-MCT1-KO#1、CRISPRv2-MCT1-KO #2重組質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果顯示,插入sgRNA的序列、位置、方向均符合預(yù)期(圖1),表明獲得正確表達(dá)的重組質(zhì)粒。

圖1 CRISPRv2-MCT1-KO重組質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果Fig.1 Sequencing results of CRISPRv2-MCT1-KO recombinant plasmids

2.2 MCT1基因敲除RKO細(xì)胞系中DNA測(cè)序鑒定以及MCT1蛋白表達(dá)水平檢測(cè)

收取對(duì)照組與MCT1基因敲除組細(xì)胞提取基因組DNA,經(jīng)PCR擴(kuò)增后測(cè)序,測(cè)序結(jié)果顯示MCT1敲除的細(xì)胞堿基序列在兩個(gè)sg RNA的PAM區(qū)之間與野生型相比出現(xiàn)缺失(圖2A)。提取細(xì)胞總蛋白,Western blot檢測(cè)顯示,MCT1基因敲除細(xì)胞未能檢測(cè)到MCT1蛋白表達(dá)(圖2B)。

圖2 MCT1基因敲除RKO細(xì)胞系中MCT1基因測(cè)序鑒定以及Western blot檢測(cè)Fig.2 Sequencing identification and Western blotting detection of MCT1 gene in MCT1-gene-knockout RKO cell lines

2.3 免疫熒光檢測(cè)MCT1基因敲除RKO細(xì)胞系中MCT1蛋白表達(dá)分布變化

通過免疫熒光觀察,相比對(duì)照組細(xì)胞,MCT1基因敲除細(xì)胞中細(xì)胞膜上未能檢測(cè)到MCT1蛋白表達(dá)分布(圖3),證明MCT1基因敲除成功。

圖3 免疫熒光檢測(cè)MCT1基因敲除RKO細(xì)胞系中MCT1蛋白表達(dá)分布Fig.3 Immunofluorescence detection of MCT1 protein in MCT1-knockout RKO cell line

2.4 MCT1基因敲除RKO細(xì)胞系乳酸攝入能力變化

加入外源性乳酸刺激后,通過比較對(duì)照組與MCT1基因敲除組細(xì)胞內(nèi)乳酸含量,發(fā)現(xiàn)MCT1基因敲除組細(xì)胞內(nèi)乳酸含量相比對(duì)照組細(xì)胞減少(圖4),表明在RKO細(xì)胞中敲除MCT1基因后影響細(xì)胞乳酸攝入。

圖4 敲除MCT1后RKO細(xì)胞系攝入乳酸能力檢測(cè)Fig.4 Determination of lactic acid uptake capacity of RKO cell lines after MCT1 knockout

2.5 MCT1基因敲除RKO細(xì)胞系增殖能力變化

細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)以及CCK-8檢測(cè)表明,MCT1基因敲除組細(xì)胞增殖能力減弱(圖5),提示MCT1基因的表達(dá)與結(jié)腸癌RKO細(xì)胞增殖能力相關(guān)。

圖5 敲除MCT1后RKO細(xì)胞系增殖能力檢測(cè)Fig.5 Evaluation of proliferation capacity of RKO cell lines after MCT1 knockout

2.6 GSEA分析結(jié)果

GSEA分析結(jié)果顯示,結(jié)直腸癌MCT1基因高表達(dá)樣本中氧化磷酸化通路和MYC信號(hào)通路被激活(圖6),這說明MCT1可能通過以上兩個(gè)通路促進(jìn)結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展。

圖6 GSEA分析結(jié)直腸癌中MCT1功能富集基因集Fig.6 GSEA analysis of MCT1 functional enrichment gene sets in colorectal cancer

3 討論

MCT1是由SLC16A1基因編碼的12次跨膜蛋白,主要參與細(xì)胞內(nèi)外乳酸、丙酮酸、酮體等單羧酸的轉(zhuǎn)運(yùn)。隨著對(duì)MCT1在腫瘤中研究的深入,MCT1在腫瘤中的作用越來越被重視。乳酸一直被當(dāng)作是一種代謝廢物,而近年來有研究證實(shí)乳酸能夠作為腫瘤組織三羧酸循環(huán)的代謝底物,在腫瘤的生長(zhǎng)過程中發(fā)揮重要作用[18],MCT1在腫瘤利用乳酸進(jìn)行三羧酸循環(huán)的過程中起著決定性作用,Faubert等[7]在肺癌中證實(shí)癌細(xì)胞對(duì)乳酸的利用依賴于MCT1。多項(xiàng)研究表明,腫瘤微環(huán)境中經(jīng)MCT1攝入的乳酸通過乳酸脫氫酶氧化為丙酮酸后,可競(jìng)爭(zhēng)性抑制脯氨酰羥化酶(prolyl hydroxylases,PHDs)與HIF-1α的結(jié)合,從而使HIF-1α不能被羥基化誘導(dǎo)降解,進(jìn)而促進(jìn)一些血管生長(zhǎng)因子的表達(dá),如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子-A(vascular endothelial growth factor-A,VEGF-A)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2(vascular endothelial growth factor receptor 2,VEGFR2)和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor,b FGF),促進(jìn)腫瘤血管生成[19-21]。在腫瘤微環(huán)境中,免疫細(xì)胞內(nèi)MCT1介導(dǎo)的乳酸攝入改變伴隨著M2型巨噬細(xì)胞的極化增加及Treg細(xì)胞抑制功能增強(qiáng),進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的免疫逃逸[22-23]。同樣有研究證實(shí),高表達(dá)MCT1的黑色素瘤細(xì)胞通過攝入循環(huán)系統(tǒng)中的乳酸拮抗氧化應(yīng)激,促進(jìn)循環(huán)黑色素瘤細(xì)胞的生存,從而增加腫瘤的轉(zhuǎn)移的概率[24]。已有研究表明,氧化磷酸化能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖,MYC也參與了正常細(xì)胞的增殖調(diào)控[25-26]。我們的GSEA富集分析結(jié)果表明,MCT1可能通過調(diào)控腫瘤細(xì)胞的氧化磷酸化和MYC信號(hào)通路,進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖。簡(jiǎn)而言之,MCT1在腫瘤多種生物學(xué)功能中發(fā)揮極其重要的作用。

隨著基因編輯技術(shù)的蓬勃發(fā)展,基因編輯領(lǐng)域產(chǎn)生了由RNA引導(dǎo)的核酸酶基因編輯技術(shù)——CRISPR/Cas9技術(shù),相比于ZFN和TALEN技術(shù),它具有組成簡(jiǎn)單、精確性高、操作方便等特點(diǎn)[15]。CRISPR/Cas9系統(tǒng)通過Cas9蛋白結(jié)合靶基因并進(jìn)行切割,利用非同源末端連接使靶基因出現(xiàn)堿基缺失或者插入,從而實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因的定點(diǎn)敲除或者大片段的刪除。在使用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建基因敲除細(xì)胞系時(shí),常用的方法有慢病毒法、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染法、核糖核蛋白法(ribonucleoprotein,RNP)等[27]。慢病毒法在感染細(xì)胞過程中可能會(huì)影響其他基因的表達(dá),并且持續(xù)表達(dá)Cas9蛋白會(huì)對(duì)基因編輯過程中的脫靶效應(yīng)有累積作用;質(zhì)粒轉(zhuǎn)染法對(duì)其他基因影響較小且更容易實(shí)施,但其轉(zhuǎn)染效率受到的影響因素較多,并且可能存在一定的免疫原性;RNP法通過電刺激等方法將復(fù)合物轉(zhuǎn)染至細(xì)胞,Cas9蛋白瞬時(shí)表達(dá),脫靶效率低,但可能會(huì)導(dǎo)致切割效率降低[28]。

本研究利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建了穩(wěn)定敲除人MCT1基因的結(jié)直腸癌RKO細(xì)胞系,并檢測(cè)到MCT1基因敲除后RKO細(xì)胞對(duì)乳酸攝取能力減弱。為進(jìn)一步研究MCT1對(duì)RKO細(xì)胞的增殖能力是否存在影響,我們通過克隆形成以及CCK-8實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)敲除MCT1后RKO細(xì)胞增殖能力減弱。綜上所述,我們的研究為今后深入研究MCT1在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展過程中的功能及其機(jī)制提供了良好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。