覃先蓬,趙高平,楊 春,朱學(xué)強,劉 浩,楊 洲△
四川省人民醫(yī)院1胃腸外科 2腫瘤科 成都 610072
結(jié)直腸癌(colorectal cancer,CRC)作為臨床惡性腫瘤類疾病之一,在醫(yī)療技術(shù)水平不斷提高的背景下,與之相關(guān)的治療方式也呈現(xiàn)多元化并對臨床診療有效性產(chǎn)生積極影響,但對處于中晚期的結(jié)直腸癌患者進行觀察研究發(fā)現(xiàn)該類患者人群預(yù)后效果仍未見明顯改善,目前競爭內(nèi)源性RNA(competitive endogenous RNA,ceRNA)成為探究結(jié)直腸癌發(fā)病機制的基礎(chǔ)[1-2]。環(huán)狀RNA(circular RNA,circRNA)屬非編碼序列RNA分子,且不具備5′端帽子結(jié)構(gòu)與3′端多聚腺苷酸尾巴結(jié)構(gòu),其中包含微小RNA(microRNA,miRNA)的反應(yīng)元件并可競爭結(jié)合miRNA,還可能參與結(jié)直腸癌發(fā)生及發(fā)展過程[3-4]。針對宮頸癌組織細胞的觀察研究發(fā)現(xiàn)circ_0000745顯著上調(diào),且宮頸癌細胞增殖、遷移和侵襲活動更為活躍[5]。但circ_0000745與結(jié)直腸癌相關(guān)研究報道相對較少。Circular RNA Interactome研究資料中針對circ_0000745與miR-296-5p的預(yù)測結(jié)果表明兩者存在結(jié)合位點。研究表明miR-296-5p在結(jié)直腸癌變細胞所呈現(xiàn)的表達變化一定程度上會對癌變細胞活躍度帶來影響,當(dāng)其表達呈上升趨勢時結(jié)直腸癌變細胞增殖活動減弱,提示miR-296-5p對結(jié)直腸癌細胞增殖活躍度具有一定抑制作用,可進一步縮短細胞凋亡時間[6]。但miR-296-5p上游的ceRNA分子機制尚未闡明。因此,本研究主要探討circ_0000745是否可通過靶向調(diào)控miR-296-5p表達而調(diào)節(jié)結(jié)直腸癌細胞增殖及轉(zhuǎn)移。
選取2013年3月~2016年7月本院收治且術(shù)中切除組織經(jīng)病理確診的結(jié)直腸癌患者65例作為研究對象,男35例,女30例,年齡56~67歲,平均年齡(60.21±3.16)歲。病理分級:Ⅰ~Ⅱ級45例,Ⅲ~Ⅳ級20例;所有患者均未合并癌栓;臨床分期:Ⅰ~Ⅱ期40例,Ⅲ~Ⅳ期25例。將癌組織及癌旁組織制作石蠟標(biāo)本。參與本研究的患者或其近親家屬知情并同意參與本研究,本研究內(nèi)容及各項流程均滿足《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會赫爾辛基宣言》審核標(biāo)準(zhǔn)要求,并經(jīng)院倫理委員會審批同意。隨訪5年,65例患者中死亡9例,存活56例。
人結(jié)直腸癌細胞HCT-116及HT-29均購自美國ATCC;DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清、CCK-8均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;LipofectamineTM3000 Transfection Reagent購自美國Invitrogen公司;Trizol試劑購自美國Thermo Fisher公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green試劑盒購自北京天根生化公司;si-NC、si-circ_0000745、miR-NC、miR-296-5p mimics、anti-miR-NC、anti-miR-296-5p等購自廣州瑞博生物;Transwell小室、Matrigel基質(zhì)膠、酶活性雙熒光素酶檢測試劑盒等購自北京索萊寶公司;雙熒光素酶報告基因載體購自美國Promega公司;兔抗人基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2,MMP-2)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9,MMP-9)、山羊抗兔IgG與HRP標(biāo) 記 的二抗均購自美國Abcam公司。
1.2.1 實驗篩選 HCT-116及HT-29細胞分別置入含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)液,放在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),觀察細胞生長融合狀態(tài),當(dāng)細胞生長融合面積占培養(yǎng)液面積70%。采用“1.2.3”項下方法檢測兩種細胞的circ_0000745 mRNA、miR-296-5p mRNA表達。
1.2.2 分組 HCT-116細胞置入含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)液,放在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),觀察細胞生長融合狀態(tài),當(dāng)細胞生長融合面積占培養(yǎng)液面積70%,嚴(yán)格按照LipofectamineTM3000 Transfection Reagent說明書作轉(zhuǎn)染操作,根據(jù)是否經(jīng)轉(zhuǎn)染操作,將HCT-116細胞分為沉默對照 組(si-NC)、沉 默circ_0000745組(si-circ_0000745)、空白轉(zhuǎn)染組(miR-NC)、miR-296-5p過表達組(miR-296-5p mimics)、沉 默circ_0000745及抗-miR-296-5p對照組(si-circ_0000745+anti-miRNC)和 沉 默circ_0000745及 抗-miR-296-5p組(sicirc_0000745+anti-miR-296-5p),各組細胞經(jīng)轉(zhuǎn)染操作后以DMEM完全培養(yǎng)液并加10%濃度的胎牛血清培養(yǎng)48 h后進行指標(biāo)檢測。
1.2.3 實時定量PCR(qRT-PCR)檢測circ_0000745、miR-296-5p的表達水平 結(jié)直腸癌組織、癌旁組織與各組HCT-116細胞研磨后加入Trizol試劑提取總RNA,以2μg RNA進行逆轉(zhuǎn)錄及cDNA的逆轉(zhuǎn)錄合成,反應(yīng)條件:95℃持續(xù)預(yù)變性反應(yīng)2 min,變性反應(yīng)持續(xù)60 s,60℃退火30 s,72℃延伸30 s,40次循環(huán)。GAPDH為內(nèi)參,基因相對表達量的計算采用2-ΔΔCt法。各引物序列如下,GAPDH上 游:5′-GGGAAACTGTGGCGTGAT-3′,下游:5′-GAGTGGGTGTCGCTGTTGA-3′;circ_0000745上 游:5′-ATGTTGAAAGTAGCCCGAGCAG-3′,下游:5′-TGGGAGTGTTGGAAGAAGTTGG-3′;miR-296-5p上游:5′-ATGGCGGACGAGGAGAAGCTGC-3′,下游:5’-TCACTCAGTGCGGAGGATGATG-3’。比較癌組織、癌旁組織及各組HCT-116細胞circ_0000745、miR-296-5p相對表達,考察circ_0000745、miR-296-5p表達與預(yù)后的關(guān)系。
1.2.4 CCK-8實驗檢測細胞增殖活動 將各組細胞置于96孔板中,每孔加入CCK-8溶液10μL,2 h后在450 nm波長處以酶標(biāo)儀完成對吸光度(A)值的檢測,計算細胞存活率:存活率=實驗組A值/對照組A值×100%。
1.2.5 平板細胞克隆形成實驗 將各組細胞置于6孔板中,于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)14 d,應(yīng)用預(yù)冷PBS洗滌,-20℃下甲醇固定20 min,37℃下以1%結(jié)晶紫染色液染色15 min,蒸餾水洗滌并晾干,觀察并記錄細胞克隆數(shù)量。
1.2.6 Transwell實驗檢測細胞遷移與侵襲 遷移實驗:收集各組細胞,濃度調(diào)節(jié)至2×105個/m L,按照200μL/孔方式置于上室,600μL含10%胎牛血清的培養(yǎng)液置于下室,37℃、5%CO2培養(yǎng)24 h,多聚甲醛固定20 min,采用0.1%結(jié)晶紫染液染色10 min,鏡下觀察遷移細胞并計數(shù)。侵襲實驗:用Matrigel基質(zhì)膠稀釋液包被Transwell小室并置于培養(yǎng)箱內(nèi),持續(xù)5 h,后續(xù)步驟同遷移實驗。
1.2.7 雙熒光素酶報告實驗檢測circ_0000745與miR-296-5p的靶向關(guān)系 將circ_0000745與miR-296-5p的結(jié)合位點克隆至p GL3質(zhì)粒中構(gòu)建野生型載體WT-circ_0000745,點突變試劑盒將結(jié)合位點進行突變后克隆至p GL3質(zhì)粒中構(gòu)建突變型載體MUT-circ_0000745,采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將熒光素酶報告基因載體分別與miR-NC或miR-296-5p mimics行轉(zhuǎn)染操作,置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h,采用雙熒光素酶檢測試劑盒檢測熒光素酶活性。
1.2.8 Western blot檢測MMP-2、MMP-9蛋白表達量 PBS對各組細胞洗滌,加入500μL RIPA裂解液提取細胞總蛋白,采用BCA法檢測細胞蛋白濃度,將細胞蛋白在100℃高溫下變性10 min,取40 μg蛋白進行SDS-PAGE電泳,轉(zhuǎn)膜,用5%脫脂牛奶封閉2 h,加入MMP-2(1∶1000)、MMP-9(1∶1000)一抗與內(nèi)參GAPDH抗體(1∶3000)稀釋液,4℃孵育過夜,加入二抗稀釋液(1∶5000)在37℃下孵育2 h,采用Quantity One軟件半定量MMP-2、MMP-9蛋白表達。
與癌旁組織比較,結(jié)直腸癌組織中circ_0000745表達明顯增高(P<0.05),miR-296-5p明顯降低(P<0.05),見圖1。隨訪5年,65例患者中死亡9例,存活56例。與存活患者相比,死亡患者的circ_0000745明顯增高(P<0.05),miR-296-5p明顯降低(P<0.05),見圖2。
圖1 circ_0000745與miR-296-5p在結(jié)直腸癌中的表達量比較Fig.1 Comparison of expression levels of circ_0000745 and miR-296-5p in colorectal cancer
圖2 circ_0000745與miR-296-5p在結(jié)直腸癌存活及死亡患者的表達量比較Fig.2 Comparison of the expression levels of circ_0000745 and miR-296-5p in colorectal cancer tissues of survival and dead patients
與HT-29細胞比較,HCT-116中circ_0000745與miR-296-5p表達明顯更高(均P<0.05),見圖3。
圖3 HCT-116及HT-29細胞circ_0000745與miR-296-5p表達Fig.3 circ_0000745 and miR-296-5p expression in HCT-116 and HT-29 cells
與si-NC組比較,si-circ_0000745組細胞circ_0000745被明顯敲低,且細胞存活率降低(均P<0.05),細胞克隆形成數(shù)量減少(P<0.05),見圖4。
圖4 沉默circ_0000745對HCT-116細胞增殖能力的影響Fig.4 The effect of silencing circ_0000745 on the proliferation of HCT-116 cells
si-circ_0000745組較si-NC組細胞遷移及侵襲活躍度降低,發(fā)生遷移及侵襲的細胞數(shù)量明顯減少(均P<0.05),MMP-2、MMP-9蛋白表達水平降低(均P<0.05),見圖5。
圖5 沉默circ_0000745對HCT-116細胞遷移及侵襲的影響Fig.5 The effect of silencing circ_0000745 on the migration and invasion of HCT-116 cells
circ_0000745與miR-296-5p具備共有序列段表現(xiàn)。miR-296-5p過表達引起野生型載體WT-circ_0000745的熒光素酶活性下降(P<0.05)。與si-NC組的miR-296-5p進行比較,si-circ_0000745組呈現(xiàn)更高表現(xiàn)(P<0.05);與pcDNA組就miR-296-5p展開比較,pcDNA-circ_0000745組呈低表現(xiàn)(P<0.05)。見圖6。
圖6 雙熒光素酶報告實驗驗證circ_0000745與miR-296-5p的靶向調(diào)控作用Fig.6 The dual luciferase report experiment verified the targeted regulation of circ_0000745 and miR-296-5p
過表達miR-296-5p mimics的miR-296-5p組較miR-NC組細胞存活率下降,且MMP-2、MMP-9蛋白表達水平下降(均P<0.05),細胞克隆形成數(shù)下降,且遷移和侵襲細胞數(shù)量減少(均P<0.05),見圖7。
圖7 miR-296-5p過表達對HCT-116細胞增殖、遷移及侵襲活動的影響Fig.7 Effect of miR-296-5p overexpression on HCT-116 cell proliferation,migration and invasion
與si-circ_0000745+anti-miR-NC組比較,sicirc_0000745+anti-miR-296-5p組細胞存活率和MMP-2、MMP-9蛋白水平升高(均P<0.05),細胞克隆形成數(shù)量、遷移及侵襲細胞數(shù)量明顯增多(均P<0.05),見圖8。
圖8 抑制miR-296-5p表達聯(lián)合沉默circ_0000745對HCT-116細胞增殖、遷移及侵襲的影響Fig.8 The effect of inhibiting the expression of miR-296-5p and silencing circ_0000745 on the proliferation,migration and invasion of HCT-116 cells
circ RNA是由外顯子或內(nèi)含子的套索驅(qū)動活動而形成的一類具備閉合環(huán)狀特征的共價結(jié)構(gòu),核酸外切酶對其影響甚微,因此circRNA可作為miRNA的海綿分子而充當(dāng)miRNA的ceRNA。關(guān)于結(jié)直腸癌的臨床研究數(shù)據(jù)顯示,該部位出現(xiàn)癌變的組織細胞中可見circRNA存在異常表達現(xiàn)象,提示circRNA的表達變化會對結(jié)直腸組織癌變及其發(fā)展帶來一定影響,還可能作為結(jié)直腸癌治療的潛在靶點[7-10]。
針對宮頸癌的研究顯示,circ_0000745呈現(xiàn)高表達時會促進宮頸癌變細胞的增殖及轉(zhuǎn)移[11]。而針對急性白血病的研究中觀察到淋巴細胞及白血病細胞的circ_0000745呈現(xiàn)高水平表達,提示該現(xiàn)象發(fā)生會誘導(dǎo)急性淋巴細胞白血病細胞增殖活躍度增強[12]。針對口腔鱗狀癌變細胞觀察circ_0000745變化發(fā)現(xiàn)其呈現(xiàn)高表達水平,并可通過充當(dāng)miR-488的ceRNA對CCND1的表達作正向調(diào)控,該研究結(jié)果提示其對口腔鱗狀細胞癌細胞增殖及細胞轉(zhuǎn)移能力增強起推動作用[13]。但circ_0000745在結(jié)直腸癌中的作用尚未可知。本研究結(jié)果顯示,結(jié)直腸癌組織中circ_0000745的表達量升高,5年隨訪結(jié)果亦顯示,死亡患者結(jié)直腸癌組織中circ_0000745的表達量更高。沉默circ_0000745可降低結(jié)直腸癌細胞存活率,細胞克隆形成活躍度降低、數(shù)量隨之減少,提示沉默circ_0000745可顯著抑制結(jié)直腸癌HCT-116細胞增殖。MMP-2、MMP-9是具備金屬離子特性的蛋白酶,可提升細胞轉(zhuǎn)移活躍度[14]。本研究結(jié)果表明,沉默circ_0000745可抑制結(jié)直腸癌HCT-116細胞遷移及侵襲,還可抑制MMP-2、MMP-9的表達,提示circ_0000745在維持結(jié)直腸癌細胞活力、遷移及侵襲能力方面具有重要作用。
本研究初步證實circ_0000745可充當(dāng)miR-296-5p的ceRNA,負向調(diào)控miR-296-5p的表達。研究表明采用miR-296-5p可靶向HMGA1抑制結(jié)直腸癌變細胞增殖[15],降低肝臟及周邊具備癌變表現(xiàn)細胞的遷移活躍度[16]。miR-296-5p可對SND1實現(xiàn)有效靶向調(diào)控,進而對骨肉瘤細胞增殖及轉(zhuǎn)移活動進行有效抑制[17]。本研究離體HCT-116細胞研究顯示,circ_0000745與miR-296-5p呈負相關(guān)關(guān)系,circ_0000745可通過負向調(diào)節(jié)miR-296-5p表達而抑制結(jié)直腸癌變組織細胞活躍度,提示circ_0000745可充當(dāng)miR-296-5p的ceRNA,進一步,通過調(diào)節(jié)或沉默circ_0000745表達可影響結(jié)直腸癌細胞增殖及轉(zhuǎn)移活動。
有研究證實MMP-2和MMP-9可由miR-296靶向調(diào)控,而miR-296參與脈絡(luò)膜黑色素瘤細胞增殖、細胞周期進程、遷移、侵襲病理進程[18]。進一步的研究有必要考察miR-296-5p與MMP-2、MMP-9的聯(lián)系,為結(jié)直腸癌的診治提供更多信息。
綜上所述,結(jié)直腸癌組織中circ_0000745呈高表達,miR-296-5p呈低表達,高表達circ_0000745及低表達miR-296-5p可用于評估結(jié)直腸癌預(yù)后。沉默circ_0000745可上調(diào)miR-296-5p表達以抑制結(jié)直腸癌細胞增殖、克隆形成、遷移及侵襲,circ_0000745/miR-296-5p分子軸在結(jié)直腸癌發(fā)生及發(fā)展過程中可發(fā)揮重要調(diào)控作用,為后續(xù)臨床針對結(jié)直腸癌癥疾病治療研究提供新的靶向目標(biāo)和方向。但circ_0000745具有多個miRNA的結(jié)合位點,其是否可通過靶向調(diào)控其他miRNA而發(fā)揮作用尚需進一步探究。
華中科技大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版)2022年1期