姚 菲,黃啟友,黃曉穎,張 玲,江 玨,王 強(qiáng),吳清明,2△

1武漢科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院感染免疫與腫瘤微環(huán)境研究所,武漢 430081

2武漢科技大學(xué)職業(yè)危害識(shí)別與控制湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,武漢 430081

結(jié)直腸癌(colorectal cancer,CRC)是常見的消化道惡性腫瘤,最新的全球癌癥數(shù)據(jù)顯示結(jié)直腸癌發(fā)病率位居世界第3位,病死率居第2位[1]。2020年中國(guó)癌癥統(tǒng)計(jì)報(bào)告顯示結(jié)直腸癌的發(fā)病率及死亡率不僅呈現(xiàn)逐年上升的趨勢(shì),還呈現(xiàn)出年輕化趨勢(shì)[2]?；瘜W(xué)治療是中晚期結(jié)直腸癌患者輔助治療的重要方式,目前常用的化療藥物包括氟尿嘧啶類藥物與鉑類藥物,臨床上通常將兩者聯(lián)合使用,可有效降低結(jié)直腸癌患者復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn),從而提高生存率[3]。但患者經(jīng)過一段時(shí)間治療后容易對(duì)這兩種結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制均不同的化療藥物產(chǎn)生交叉耐藥,導(dǎo)致化療效果不理想。因此深入分析結(jié)直腸癌患者化療耐藥性形成的原因并探索其作用機(jī)制成為目前研究的重難點(diǎn),對(duì)提高腫瘤化療敏感性具有重要意義。

微小RNA(microRNA,miRNA)是目前研究最成熟的一類非編碼RNA,長(zhǎng)度約有19～22個(gè)核苷酸,可作為癌基因或抑癌基因影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展[4]。miRNA與下游靶基因的3′非編碼區(qū)特異性結(jié)合抑制其表達(dá),從而參與對(duì)細(xì)胞增殖、遷移、侵襲等生物學(xué)過程的調(diào)控[5]?；熌退幮纬墒且粋€(gè)多步驟、多因素參與的復(fù)雜過程,目前涉及多種機(jī)制,例如膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白異常表達(dá)、細(xì)胞凋亡異常、DNA損傷修復(fù)增強(qiáng)、腫瘤微環(huán)境改變等[6]。前期已有研究顯示,miRNA可影響腫瘤的化療耐藥性[7-8]。然而,目前有關(guān)miRNA是否與結(jié)直腸癌氟尿嘧啶類及鉑類藥物的化療耐藥有關(guān),仍需進(jìn)一步研究。本課題以結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT8及其5-氟尿嘧啶耐藥細(xì)胞(HCT8/5-Fu)和順鉑耐藥細(xì)胞株(HCT8/DDP)為研究對(duì)象。前期我們已驗(yàn)證了結(jié)直腸癌耐藥細(xì)胞株HCT8/5-Fu及HCT8/DDP具有明顯的化療耐藥性[9]。通過RNA-seq測(cè)序發(fā)現(xiàn),miR-33a-3p在耐藥細(xì)胞株HCT8/5-Fu及HCT8/DDP中低表達(dá),因此我們推測(cè)miR-33a-3p可能與結(jié)直腸癌的化療耐藥性有關(guān),但目前有關(guān)miR-33a-3p的功能尚不明確。因此,本研究構(gòu)建miR-33a-3p模擬物(miR-33a-3p mimics)并轉(zhuǎn)染至結(jié)直腸癌耐藥細(xì)胞中,探討miR-33a-3p過表達(dá)對(duì)耐藥細(xì)胞的影響及可能的作用機(jī)制,為逆轉(zhuǎn)結(jié)直腸癌化療耐藥提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

人結(jié)直腸癌細(xì)胞系HCT8購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(中國(guó)武漢),5-氟尿嘧啶耐藥細(xì)胞系(HCT8/5-Fu)及順鉑耐藥細(xì)胞系(HCT8/DDP)購(gòu)自湖南豐暉生物科技有限公司(中國(guó)長(zhǎng)沙)。5-氟尿嘧啶(5-Fu)和順鉑(DDP)購(gòu)自Sigma公司,胎牛血清、0.25%胰酶和RPMI-1640培養(yǎng)液購(gòu)自Gibco公司,MTT購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。總RNA提取試劑TRIzol、轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體2000購(gòu)自Invitrogen公司,Real-time PCR逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試劑盒購(gòu)自TOYOBO公司,SYBR Green Supermix購(gòu)自Bio-Rad公司。BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Biosharp公司,AnnexinⅤ凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)于上海貝博生物公司,Eph A2抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公 司,β-actin抗 體 購(gòu) 自ABclonal公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) HCT8、HCT8/5-Fu和HCT8/DDP細(xì)胞用含有10%胎牛血清、100 U/m L青霉素和100μg/m L鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng),放置于37℃含5% CO2的培養(yǎng)箱中。HCT8/5-Fu和HCT8/DDP細(xì)胞在培養(yǎng)的過程中分別加入5 μg/m L 5-氟尿嘧啶和1μg/m L順鉑于培養(yǎng)液中以維持細(xì)胞耐藥性。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染前一天將兩種結(jié)直腸癌細(xì)胞分別接種于6孔板中,當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到50%～60%時(shí),更換培養(yǎng)液。每種耐藥細(xì)胞分為2組:NC mimics轉(zhuǎn)染組和miR-33a-3p mimics轉(zhuǎn)染組。NC mimics正義鏈序列為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,反義鏈序列為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′;miR-33a-3p mimics正義鏈序列為5′-CAAUGUUUCCACAGUGCAUCAC-3′,反義鏈序列為5′-GAUGCACUGUGGAAACAUUGUU-3′。按照Lipofection 2000說明書進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染,即各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染時(shí),分別將10μL Lipofection 2000和5μL mimics(濃度為10μmol/L)加入至100μL Opti-MEM培養(yǎng)液中,并將兩者混合后離心于室溫放置5 min,隨后將上述混合液滴加至6孔板中,于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6～8 h后更換正常培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)48～72 h后可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(q RT-PCR)檢測(cè)RNA的表達(dá) 采用Trizol法提取各組細(xì)胞的總RNA,并使用分光光度計(jì)檢測(cè)A260/A280比值,若值在1.8～2.2范圍內(nèi),則認(rèn)為RNA純度較高。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒使用說明將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA,隨后進(jìn)行q RT-PCR反應(yīng)。所有引物由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計(jì)合成,序列見表1。反應(yīng)條件設(shè)置為95℃反應(yīng)2 min,95℃反應(yīng)10 s,60℃持續(xù)30 s,40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后,miRNA以U6為內(nèi)參,m RNA以GAPDH為內(nèi)參基因,采用2-ΔΔCt法計(jì)算RNA相對(duì)表達(dá)量。

表1 qRT-PCR使用引物序列Table 1 Sequences of the primers in qRT-PCR

1.2.4 MTT檢測(cè)細(xì)胞的化療敏感性及增殖能力將轉(zhuǎn)染了miR-33a-3p模擬物和其陰性對(duì)照的HCT8/5-Fu或HCT8/DDP細(xì) 胞 接種于96孔板內(nèi),每孔5000個(gè)細(xì)胞,待細(xì)胞密度達(dá)70%時(shí)加入不同濃度梯度的5-氟尿嘧啶或順鉑處理,繼續(xù)培養(yǎng)72 h,加入100μL MTT試劑(5 mg/m L)后繼續(xù)培養(yǎng)4 h,吸棄上清液,每孔加入150μL DMSO,在搖床上搖晃10 min后,用酶標(biāo)儀在490 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度,并計(jì)算細(xì)胞存活率。在檢測(cè)細(xì)胞增殖能力過程中,當(dāng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞接種于96孔板后,分別于第24、48、72 h加入100μL MTT溶液(5 mg/m L)后繼續(xù)培養(yǎng)4 h,吸棄上清液,每孔加入150μL DMSO,在搖床上搖晃10 min后,用酶標(biāo)儀在490 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度,以A值為y軸,時(shí)間為x軸繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線,評(píng)估細(xì)胞增殖能力。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡及周期 將轉(zhuǎn)染了miR-33a-3p模擬物和陰性對(duì)照的兩種耐藥細(xì)胞,胰酶消化后用培養(yǎng)液重懸于離心管中,以1500 r/min速度離心5 min,隨后用預(yù)冷的PBS重懸細(xì)胞后計(jì)數(shù),取含有(1～5)×105個(gè)細(xì)胞的懸液離心棄上清,加入500μL 1×Binding buffer重懸細(xì)胞,并加入5μL AnnexinⅤ-FITC及10μL碘化丙啶(PI),室溫避光15 min后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。檢測(cè)細(xì)胞周期時(shí),向收集于離心管中的細(xì)胞加入1 m L預(yù)冷的70%乙醇溶液,混合均勻后4℃固定過夜,吸棄固定液后用PBS洗2遍,4℃,1200 r/min,離心5 min,棄上清。每個(gè)樣品加入500μL配制好的PI染色工作液[包含10μL RNase A Solution(50×)和25μL PI染液],輕輕重懸細(xì)胞沉淀,置于37℃避光水浴30 min,4℃避光放置30 min后利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)周期變化。

1.2.6 Western blot檢測(cè)Caspase-3和Eph A2蛋白的表達(dá) 收集轉(zhuǎn)染后細(xì)胞于1.5 m L EP管中,PBS洗滌2遍后加入RIPA裂解液,使用超聲破碎儀破碎細(xì)胞,離心后取上清,運(yùn)用BCA方法檢測(cè)蛋白濃度。蛋白上樣量一般定為20μg,隨后加入5×SDS蛋白上樣緩沖液,并置于95℃變性5 min。經(jīng)SDS-PAGE電泳后,將獲得的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,5%脫脂牛奶封閉1 h后,孵育抗體cleaved Caspase-3、Eph A2及β-actin(體積稀釋比例均為1∶1000)于4℃過夜。次日收集一抗并用TBST洗膜3次,分別加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶5000),室溫孵育1 h,再用TBST洗膜3次,隨后用ECL試劑顯影。以β-actin為內(nèi)參,使用Image J軟件分析Eph A2蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 25.0軟件和Graph Pad Prism 5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析和做圖,計(jì)量資料均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。兩組間均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn),以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-33a-3p在結(jié)直腸癌耐藥細(xì)胞中低表達(dá)

前期工作我們已證實(shí)結(jié)直腸癌耐藥細(xì)胞株HCT8/5-Fu和HCT8/DDP具有化療耐藥性,可以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。通過RNA-seq測(cè)序我們發(fā)現(xiàn)與結(jié)直腸癌親本株相比,miR-33a-3p在兩種耐藥細(xì)胞中均出現(xiàn)顯著低表達(dá),隨后我們進(jìn)一步采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)結(jié)直腸癌親本株及兩種耐藥細(xì)胞株中miR-33a-3p的相對(duì)表達(dá)水平。檢測(cè)結(jié)果與測(cè)序結(jié)果一致,即miR-33a-3p在兩種耐藥細(xì)胞中表達(dá)水平明顯低于親本株(均P＜0.01,圖1)。

圖1 miR-33a-3p在結(jié)直腸癌親本株及耐藥株中的表達(dá)水平Fig.1 The expression level of miR-33a-3p in colorectal cancer parental and chemoresistant cell lines

2.2 過表達(dá)miR-33a-3p可明顯抑制結(jié)直腸癌耐藥細(xì)胞增殖

在結(jié)直腸癌耐藥細(xì)胞HCT8/5-Fu和HCT8/DDP中分別轉(zhuǎn)染miR-33a-3p mimics及NC mimics,轉(zhuǎn)染72 h后使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)耐藥細(xì)胞中miR-33a-3p的表達(dá)水平,結(jié)果顯示,與NC mimics組相比,轉(zhuǎn)染了miR-33a-3p mimics組的miR-33a-3p表達(dá)水平顯著增高,提示轉(zhuǎn)染成功(圖2A)。隨后,對(duì)成功轉(zhuǎn)染mimics的耐藥細(xì)胞分別在24、48、72 h進(jìn)行增殖能力檢測(cè),可觀察到轉(zhuǎn)染了miR-33a-3p mimics耐藥細(xì)胞的增殖能力明顯被抑制(圖2B、2C)。

圖2 轉(zhuǎn)染miR-33a-3p模擬物及陰性對(duì)照對(duì)結(jié)直腸癌耐藥株增殖能力的影響Fig.2 Effects of transfection of miR-33a-3p mimics and negative control(NC)mimics on the proliferation of colorectal cancer chemoresistant cell lines

2.3 過表達(dá)miR-33a-3p可明顯促進(jìn)結(jié)直腸癌耐藥細(xì)胞凋亡

使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染miR-33a-3p mimics及NC mimics后各組細(xì)胞凋亡率,在HCT8/5-Fu細(xì)胞中轉(zhuǎn)染NC mimics后細(xì)胞凋亡率為(13.28±1.25)%,而轉(zhuǎn)染miR-33a-3p mimics的細(xì)胞凋亡率為(22.51±2.18)%,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(圖3A)。在HCT8/DDP細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-33a-3p mimics時(shí)細(xì)胞凋亡率為(19.5±0.82)%,較NC組(10.1±0.35)%凋亡率顯著增加(P＜0.05)(圖3B)。同時(shí),我們發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染了miR-33a-3p mimics的兩種細(xì)胞的凋亡蛋白cleaved Casapase-3水平明顯升高(圖3C),提示miR-33a-3p可明顯增加耐藥細(xì)胞的凋亡。

圖3 轉(zhuǎn)染miR-33a-3p模擬物及陰性對(duì)照對(duì)結(jié)直腸癌耐藥株凋亡的影響Fig.3 Effects of transfection of miR-33a-3p mimics and negative control(NC)mimics on the apoptosis of colorectal cancer chemoresistant cell lines

2.4 過表達(dá)miR-33a-3p對(duì)結(jié)直腸癌耐藥細(xì)胞周期的影響

在耐藥細(xì)胞中檢測(cè)轉(zhuǎn)染miR-33a-3p mimics及NC mimics后分析各組細(xì)胞周期分布情況。如圖4所示,與對(duì)照組相比,轉(zhuǎn)染了miR-33a-3p mimics的兩種耐藥株細(xì)胞處于G1期的百分比與NC mimics轉(zhuǎn)染組相比無明顯變化(均P＞0.05),但處于S期細(xì)胞數(shù)顯著降低,且G2/M期的細(xì)胞數(shù)明顯增加(均P＜0.05),說明miR-33a-3p可使結(jié)直腸癌耐藥細(xì)胞阻滯于G2/M期,從而抑制細(xì)胞增殖。

圖4 轉(zhuǎn)染miR-33a-3p模擬物及陰性對(duì)照對(duì)結(jié)直腸癌耐藥株細(xì)胞周期的影響Fig.4 Effects of transfection of miR-33a-3p mimics and negative control(NC)mimics on the cell cycle of colorectal cancer chemoresistant cell lines

2.5 過表達(dá)miR-33a-3p增加結(jié)直腸癌耐藥細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性

使用miRanda及TargetScan網(wǎng)站預(yù)測(cè)miR-33a-3p下游靶基因,預(yù)測(cè)結(jié)果顯示,Eph A2可能是miR-33a-3p的下游重要靶基因。因此,我們使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)轉(zhuǎn)染mimics的HCT8/5-Fu和HCT8/DDP細(xì)胞中Eph A2的表達(dá)水平。結(jié)果顯示,與NC mimics轉(zhuǎn)染組相比,上調(diào)miR-33a-3p表達(dá)后,兩種耐藥細(xì)胞內(nèi)Eph A2的m RNA及蛋白表達(dá)水平均明顯降低(均P＜0.05)(圖5)。故我們推測(cè)miR-33a-3p可抑制Eph A2表達(dá),對(duì)其產(chǎn)生負(fù)調(diào)控作用。文獻(xiàn)報(bào)道顯示Eph A2高表達(dá)與多種腫瘤化療耐藥密切相關(guān)[10-11],因此,我們使用MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞化學(xué)敏感性變化,結(jié)果顯示,對(duì)照組與過表達(dá)組耐藥細(xì)胞株的細(xì)胞活力均隨著給藥濃度的增加而降低,當(dāng)給藥濃度相同時(shí),過表達(dá)組存活率明顯低于對(duì)照組(圖6A、6C)。IC50計(jì)算結(jié)果顯示,當(dāng)使用5-氟尿嘧啶干預(yù)HCT8/5-Fu細(xì)胞時(shí),轉(zhuǎn)染NC-mimics組細(xì)胞的IC50值為(158.2±1.37)μg/m L,轉(zhuǎn) 染miR-33a-3p mimics組 細(xì) 胞 的IC50值為(77.02±0.23)μg/m L,較對(duì)照組顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖6B)。HCT8/DDP耐藥細(xì)胞轉(zhuǎn)染NC-mimics及miR-33a-3p mimics組的IC50值分別為(9.80±0.97)μg/m L和(4.60±0.18)μg/m L(圖6D)。這些結(jié)果均提示過表達(dá)miR-33a-3p可能通過抑制Eph A2表達(dá)增加結(jié)直腸癌耐藥細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。

圖5 結(jié)直腸癌耐藥細(xì)胞株中轉(zhuǎn)染miR-33a-3p模擬物及陰性對(duì)照后Eph A2表達(dá)水平Fig.5 The expression level of Eph A2 in colorectal chemoresistant cell lines transfected with miR-33a-3p mimics and negative control(NC)mimics

圖6 結(jié)直腸癌耐藥細(xì)胞株中轉(zhuǎn)染miR-33a-3p模擬物及陰性對(duì)照后化療敏感性變化情況Fig.6 The sensitivity to 5-Fu or DDP of colorectal cancer chemoresistant cell lines transfected with miR-33a-3p mimics and negative control(NC)mimics

3 討論

化療是結(jié)直腸癌患者治療的重要手段,可有效延長(zhǎng)患者生存時(shí)間,但腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性是化療失敗的重要原因。目前,結(jié)直腸癌化療耐藥的具體機(jī)制尚未完全清楚,主要涉及DNA損傷修復(fù)增強(qiáng)、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族表達(dá)和功能異常、腫瘤干細(xì)胞特性、拓?fù)洚悩?gòu)酶活性改變、細(xì)胞凋亡或周期再分布、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路異常激活等[12-13]?，F(xiàn)階段有文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)iRNA異常表達(dá)與腫瘤耐藥產(chǎn)生密切相關(guān)。因此,本課題從miRNAs入手研究結(jié)直腸癌化療耐藥,為探索耐藥機(jī)制開辟新的道路。

miRNA是一類長(zhǎng)度在19～22個(gè)核苷酸的非編碼RNA,可以作為癌基因或抑癌基因影響腫瘤的發(fā)生與發(fā)展。miR-33a位于第22號(hào)染色體,成熟的miR-33a長(zhǎng)度為22 bp,人體內(nèi)含有兩種同源miR-33a,即hsa-miR-33a-5p和hsa-miR-33a-3p。前 期miR-33a已被報(bào)道作為脂質(zhì)代謝重要的調(diào)節(jié)分子,近期研究顯示miR-33a參與腫瘤生物學(xué)過程[14]。如miR-33a在乳腺癌中低表達(dá),當(dāng)在乳腺癌細(xì)胞中過表達(dá)miR-33a時(shí)可明顯抑制細(xì)胞生長(zhǎng)和遷移,并誘導(dǎo)細(xì)胞阻滯在G1期,提示miR-33a作為抑癌基因發(fā)揮功能[15]。此外,有文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)iR-33a-5p在結(jié)直腸癌細(xì)胞與組織中均低表達(dá),體外實(shí)驗(yàn)過表達(dá)miR-33a-5p后,結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、克隆形成及遷移能力被顯著抑制,提示miR-33a-5p與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展過程有關(guān)[16]。然而,目前有關(guān)miRNA-33a-3p是否與腫瘤化療耐藥有關(guān)聯(lián)還有待證實(shí)。

本課題組前期通過RNA-seq測(cè)序發(fā)現(xiàn)與親本株相比,miRNA-33a-3p在5-氟尿嘧啶及順鉑結(jié)直腸癌耐藥細(xì)胞中均低表達(dá),并進(jìn)一步使用熒光定量PCR驗(yàn)證測(cè)序結(jié)果。為了進(jìn)一步研究miRNA-33a-3p在結(jié)直腸癌化療耐藥中的作用,本課題將合成的miR-33a-3p mimics轉(zhuǎn)染至結(jié)直腸癌耐藥細(xì)胞HCT8/5-Fu和HCT8/DDP,實(shí)現(xiàn)在耐藥細(xì)胞中過表達(dá)miR-33a-3p。分別采用MTT方法與流式細(xì)胞術(shù) 檢 測(cè)miR-33a-3p模 擬 物 對(duì)HCT8/5-Fu和HCT8/DDP細(xì)胞增殖、凋亡和周期分布及化療敏感性變化情況,我們發(fā)現(xiàn)與NC mimics轉(zhuǎn)染組相比,過表達(dá)miR-33a-3p能夠顯著抑制HCT8/5-Fu和HCT8/DDP細(xì)胞增殖能力,同時(shí)可增加細(xì)胞凋亡,使周期明顯阻滯于G2/M期,我們也發(fā)現(xiàn)外源增加miR-33a-3p表達(dá)明顯提高了HCT8/5-Fu細(xì)胞對(duì)5-氟尿嘧啶的敏感性,也可增加HCT8/DDP細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性。為了探索miR-33a-3p增加結(jié)直腸癌化療敏感性的機(jī)制,本研究進(jìn)一步通過生物信息學(xué)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)Eph A2可能是miR-33a-3p下游分子靶標(biāo)。Eph A2是酪氨酸激酶受體家族中重要成員,已被報(bào)道在許多腫瘤中高表達(dá),廣泛參與腫瘤發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移及血管生成過程[17-18],Eph A2高表達(dá)與患者不良預(yù)后密切相關(guān)[19]。此外,最新研究報(bào)道Eph A2抗體DS-8895a及ALW-Ⅱ-41-27均可有效逆轉(zhuǎn)結(jié)直腸癌西妥昔單抗繼發(fā)耐藥,另有文獻(xiàn)表明沉默Eph A2可有效恢復(fù)結(jié)腸癌耐藥細(xì)胞株細(xì)胞Lo Vo/5-FU對(duì)化療藥物的敏感性,這表明Eph A2可參與結(jié)直腸癌化療耐藥過程[20-22]。隨后本研究發(fā)現(xiàn)上調(diào)miR-33a-3p可明顯抑制Eph A2的表達(dá),于是我們推測(cè)miR-33a-3p可能通過調(diào)控Eph A2逆轉(zhuǎn)結(jié)直腸癌化療耐藥,但具體的調(diào)控機(jī)制還有待更進(jìn)一步的研究。

綜上所述,miR-33a-3p在結(jié)直腸癌耐藥細(xì)胞株中低表達(dá),過表達(dá)miR-33a-3p可顯著提高耐藥細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性,可能與降低Eph A2的表達(dá)有關(guān),這將為逆轉(zhuǎn)結(jié)直腸癌化療耐藥提供新的理論依據(jù)。