張 黎,周 英,全 晶,何 旭,陳 軍

昆明理工大學(xué)附屬醫(yī)院,云南省第一人民醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)科,昆明 650032

急性肺栓塞(acute pulmonary embolism,APE)是臨床常見(jiàn)的急危重癥,具體指來(lái)自體循環(huán)的各種栓子堵塞肺動(dòng)脈及其分支并引起呼吸循環(huán)衰竭的臨床病理生理綜合征,救治難度大、病死率高[1]。在APE的發(fā)病過(guò)程中,血栓阻塞肺動(dòng)脈是直接的病理生理改變,與這一改變相關(guān)的因素包括血小板的活化和聚集、炎癥反應(yīng)的激活等,但具體的分子機(jī)制尚不十分清楚,臨床上也缺乏靶向治療的手段。心型脂肪酸結(jié)合蛋白(heart-type fatty acid binding protein,H-FABP)是最早在心肌中發(fā)現(xiàn)的脂肪酸結(jié)合蛋白,可作為評(píng)價(jià)心肌損傷的標(biāo)志物。近些年腎臟相關(guān)的研究發(fā)現(xiàn)H-FABP的高表達(dá)與急性腎損傷的發(fā)生有關(guān),抑制H-FABP的表達(dá)能夠減輕腎臟足細(xì)胞的損傷[2-3];APE相關(guān)的研究發(fā)現(xiàn),血清HFABP對(duì)APE的發(fā)病具有預(yù)測(cè)價(jià)值[4]。但APE發(fā)病過(guò)程中H-FABP表達(dá)的變化及意義尚不清楚。因此,本研究將通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)探究APE大鼠肺組織中H-FABP的表達(dá)及其與血小板活化、炎癥反應(yīng)激活的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)SD雄性大鼠、體質(zhì)量180～200 g、8～10周齡,購(gòu)自上海斯萊克公司,許可證:SCXK(滬)2017-0005。

1.2 試劑與儀器

陰性對(duì)照(negative control,NC)-shRNA腺病毒、H-FABP-shRNA腺病毒購(gòu)自上海吉瑪公司,蘇木精-伊紅(HE)染色試劑盒購(gòu)自上海碧云天公司,血小板活化指標(biāo)及細(xì)胞因子的酶聯(lián)免疫吸附法試劑盒購(gòu)自上海西唐生物公司,H-FABP、核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)的一抗購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物分組、造模、干預(yù)及取材 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為對(duì)照組、APE組、NC-sh RNA組、NC-sh RNA+APE組、H-FABP-sh RNA+APE組,每 組各10只。采用自體血栓法建立APE模型:經(jīng)大鼠自身眶靜脈取血0.5 m L,凝血后制成直徑0.5 mm的顆粒狀血栓混懸液;而后鈍性分離右側(cè)頸總靜脈,迅速注入0.5 m L血栓混懸液,當(dāng)大鼠出現(xiàn)明顯發(fā)紺和呼吸加快、加深時(shí),則視為造模成功。為敲低HFABP的表達(dá),本研究設(shè)計(jì)了H-FABP sh RNA的腺病毒、通過(guò)尾靜脈注射的方式進(jìn)行H-FABP的敲低,同時(shí)以注射NC-shRNA腺病毒的動(dòng)物作為對(duì)照。NC-shRNA組、NC-shRNA+APE組、H-FABP-shRNA+APE組在造模前3 d給予腺病毒,劑量為109pfu/只尾靜脈注射。造模后6 h,麻醉大鼠并取肺組織、血液樣本;肺組織分為兩份,一份用4%多聚甲醛固定后石蠟包埋保存,一份用液氮冷凍后放置在-80℃保存;血液樣本離心分離血清,放置在-80℃保存。

1.3.2 血清指標(biāo)檢測(cè) 取血清標(biāo)本,采用酶聯(lián)免疫吸附法試劑盒檢測(cè)血栓素A2(TXA2)、P-選擇素(CD62P)、血清溶酶體顆粒糖蛋白63(CD63)的含量,按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.3.3 肺組織病理改變的檢測(cè) 取肺組織蠟塊標(biāo)本,制作病理切片后采用HE染色試劑盒進(jìn)行染色,按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作,染色后在顯微鏡下觀察肺組織病理改變。

1.3.4 肺組織中蛋白表達(dá)的檢測(cè) 取液氮冷凍的肺組織標(biāo)本,加入裂解液提取蛋白,蛋白樣本加入聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行Western blot檢測(cè),電泳、電轉(zhuǎn)移至PVDF膜,5%脫脂牛奶室溫封閉PVDF膜1 h,1∶2000稀釋的H-FABP、NF-κB一抗或1∶5000稀釋的β-actin一抗4℃孵育PVDF膜過(guò)夜;1∶2000稀釋的二抗室溫孵育PVDF膜1 h,在凝膠成像系統(tǒng)中顯影得到蛋白條帶,根據(jù)條帶的灰度值以β-actin為內(nèi)參計(jì)算目標(biāo)蛋白H-FABP、NF-κB的表達(dá)水平。

1.3.5 肺組織中細(xì)胞因子含量的檢測(cè) 取液氮冷凍的肺組織標(biāo)本,加入裂解液后勻漿,采用酶聯(lián)免疫吸附法試劑盒檢測(cè)單核細(xì)胞趨化蛋白(MCP-1)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)的含量,按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均為計(jì)量資料,兩組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn),多組間均數(shù)比較采用方差分析,以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 APE組大鼠肺組織中H-FABP表達(dá)的變化

APE組大鼠肺組織中H-FABP的表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)圖1。

圖1 APE組大鼠與對(duì)照組大鼠肺組織中H-FABP表達(dá)水平的比較Fig.1 Comparison of H-FABP in lung tissue of rats between APE group and control group

2.2 尾靜脈注射H-FABP shRNA腺病毒敲低APE大鼠肺組織中H-FABP表達(dá)的效果

NC-sh RNA+APE組大鼠肺組織中H-FABP的表達(dá)水平顯著高于NC-sh RNA組(P＜0.05);HFABP-sh RNA+APE組大鼠肺組織中H-FABP的表達(dá)水平顯著低于NC-sh RNA+APE組(P＜0.05)。見(jiàn)圖2。

圖2 NC-shRNA組、NC-sh RNA+APE組、H-FABP-sh RNA+APE組大鼠肺組織中H-FABP表達(dá)水平的比較Fig.2 Comparison of H-FABP in lung tissue of rats among NC-sh RNA group,NC-sh RNA+APE group,and H-FABP-shRNA+APE group

2.3 敲低H-FABP對(duì)APE大鼠血清中血小板活化指標(biāo)的影響

NC-sh RNA+APE組大鼠的血清CD62P、CD63、TXA2含量顯著高于NC-sh RNA組(均P＜0.05);H-FABP-sh RNA+APE組大鼠的血清CD62P、CD63、TXA2含量顯著低于NC-sh RNA+APE組(均P＜0.05)。見(jiàn)表1。

表1 NC-shRNA組、NC-shRNA+APE組、H-FABP-sh RNA+APE組大鼠血小板活化指標(biāo)的比較Table 1 Comparison of platelet activation indicators of rats among NC-shRNA group,NC-shRNA+APE group,and H-FABP-shRNA+APE group

2.4 敲低H-FABP對(duì)APE大鼠肺組織病理改變的影響

NC-shRNA組肺組織的結(jié)構(gòu)形態(tài)正常,未出現(xiàn)病理改變;NC-sh RNA+APE組大鼠肺組織出現(xiàn)肺動(dòng)脈內(nèi)血栓形成、肺泡內(nèi)滲出物增多、肺泡間隔內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等APE典型病理改變;H-FABP-sh RNA+APE組大鼠肺組織的病理改變較NC-sh RNA+APE組改善。見(jiàn)圖3。

圖3 NC-shRNA組、NC-shRNA+APE組、H-FABP-shRNA+APE組大鼠肺組織病理改變的比較(蘇木精-伊紅染色,×400)Fig.3 Comparison of lung tissue pathological changes of rats among NC-shRNA group,NC-shRNA+APE group,and H-FABP-shRNA+APE group(HE staining,×400)

2.5 敲低H-FABP對(duì)APE大鼠肺組織中炎癥反應(yīng)的影響

NC-sh RNA+APE組大鼠肺組織中NF-κB的表達(dá)水平及MCP-1、TNF-α、IL-1β的含量顯著高于NC-sh RNA組(均P＜0.05);H-FABP-sh RNA+APE組大鼠肺組織中NF-κB的表達(dá)水平及MCP-1、TNF-α、IL-1β的 含 量 顯 著 低 于NC-sh RNA+APE組(均P＜0.05)。見(jiàn)圖4、表2。

表2 NC-shRNA組、NC-shRNA+APE組、H-FABP-shRNA+APE組大鼠肺組織炎癥細(xì)胞因子的比較Table 2 Comparison of inflammation cytokines of rats among NC-shRNA group,NC-shRNA+APE group,and H-FABP-shRNA+APE group

圖4 NC-shRNA組、NC-shRNA+APE組、H-FABP-shRNA+APE組大鼠肺組織中NF-κB的比較Fig.4 Comparison of NF-κB in lung tissue of rats among NC-shRNA group,NC-shRNA+APE group,and H-FABP-shRNA+APE group

3 討論

H-FABP又稱為FABP3,最早在心肌細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)并被用作評(píng)估心肌損傷的標(biāo)志物[5-6]。近年來(lái)的分子生物學(xué)研究證實(shí)H-FABP不僅參與心肌細(xì)胞能量代謝的調(diào)控[7-8],還在腎臟足細(xì)胞[3]、肺泡上皮細(xì)胞[9]的損傷中起重要作用。在脂肪酸引起腎臟足細(xì)胞損傷、脂多糖引起肺泡上皮細(xì)胞損傷的過(guò)程中,H-FABP表達(dá)增加并且促進(jìn)炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、細(xì)胞凋亡等生物學(xué)環(huán)節(jié)的發(fā)生。本研究以H-FABP作為標(biāo)志物,對(duì)APE的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行了探究。

在APE的發(fā)病過(guò)程中,血小板的活化和聚集、炎癥反應(yīng)的級(jí)聯(lián)放大激活是與病情發(fā)展變化密切相關(guān)的因素。當(dāng)來(lái)自體循環(huán)的各種栓子堵塞肺動(dòng)脈及其分支后,一方面直接造成動(dòng)脈栓塞、組織缺血壞死;另一方面則在栓塞局部大量招募血小板及炎癥細(xì)胞,進(jìn)而造成血栓加重、缺血壞死范圍擴(kuò)大,并且血小板的活化和炎癥細(xì)胞的激活具有相互促進(jìn)的作用[10-12]。目前,APE的發(fā)病機(jī)制尚不十分清楚,本研究以H-FABP作為靶點(diǎn),通過(guò)自體血栓法建立APE大鼠模型后檢測(cè)到APE大鼠肺組織中HFABP的表達(dá)水平明顯增加,表明H-FABP的高表達(dá)與APE的發(fā)病有關(guān)。

為了闡明H-FABP在APE發(fā)病中的作用,本研究通過(guò)尾靜脈注射sh RNA腺病毒的方式對(duì)APE大鼠肺組織中高表達(dá)的H-FABP進(jìn)行敲低,觀察了敲低H-FABP后肺組織的病理改變。與注射NC sh RNA腺病毒的大鼠比較,注射NC sh RNA腺病毒后進(jìn)行APE造模大鼠的肺組織出現(xiàn)了肺動(dòng)脈內(nèi)血栓形成、肺泡內(nèi)滲出增多、肺泡間隔內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等APE典型病理改變;注射H-FABP sh RNA腺病毒后進(jìn)行APE造模,大鼠肺組織的APE病理改變明顯減輕,表明敲低H-FABP能夠改善APE病理改變,高表達(dá)的H-FABP促進(jìn)APE的發(fā)生。

血小板的活化和聚集、炎癥反應(yīng)的級(jí)聯(lián)放大激活是與APE發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)的因素,Gao等[3]的研究已經(jīng)證實(shí)H-FABP對(duì)炎癥反應(yīng)的激活具有促進(jìn)作用,本研究進(jìn)一步分析了H-FABP在APE發(fā)病過(guò)程中對(duì)血小板活化及炎癥反應(yīng)激活的調(diào)控作用。CD62P、CD63是血小板活化后的表面標(biāo)志物,TXA2是血小板活化后脫顆粒釋放的產(chǎn)物。三者可作為評(píng)價(jià)血小板活化程度的指標(biāo),也有研究報(bào)道APE大鼠血清中上述三項(xiàng)指標(biāo)的含量增加[13]。本研究檢測(cè)到注射H-FABP shRNA腺病毒后APE大鼠血清中CD62P、CD63、TXA2的含量降低,表明敲低H-FABP抑制APE大鼠血小板活化。NF-κB是調(diào)控炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子,能夠啟動(dòng)下游促炎因子MCP-1、TNF-α、IL-1β的表達(dá)[14-15]。本研究檢測(cè)到注射H-FABP sh RNA腺病毒后APE大鼠肺組織中NF-κB的表達(dá)水平及MCP-1、TNF-α、IL-1β的含量均降低,表明敲低H-FABP抑制APE大鼠肺組織中炎癥反應(yīng)的激活。

綜上所述,本研究結(jié)果表明肺組織中H-FABP表達(dá)增加與APE的發(fā)病有關(guān),敲低H-FABP能夠抑制血小板活化及炎癥反應(yīng)激活,高表達(dá)的HFABP可能在APE的發(fā)病過(guò)程中促進(jìn)血小板的活化和聚集、炎癥反應(yīng)的級(jí)聯(lián)放大激活。