嚴(yán)涵鵬,吳 齊,邵勝利,馮永東

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院胃腸腫瘤研究所/分子醫(yī)學(xué)中心/胃腸外科,武漢 430030

腫瘤發(fā)生的原因至今還沒有定論。癌基因的激活,或者抑癌基因的失活是目前所知最為根本的原因。隨著癌癥發(fā)病率不斷攀升,結(jié)直腸癌(colorectal cancer,CRC)已成為全球第四大致命癌癥;每年造成約90萬人死亡[1]。因而了解結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的分子基礎(chǔ),從而找到結(jié)直腸癌治療靶點已成為結(jié)直腸癌研究的主要目的之一。

心肌素(myocardin,MYOCD)是一種主要存在于心肌與平滑肌細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄共激活因子,主要通過與血清反應(yīng)因子(serum response factor,SRF)的直接相互作用,調(diào)控離子通道、細(xì)胞骨架、鈣轉(zhuǎn)運調(diào)控蛋白等大量相關(guān)基因的表達(dá),在心肌細(xì)胞與平滑肌細(xì)胞的分化過程中發(fā)揮重要作用[2]。但對該轉(zhuǎn)錄因子的研究多集中在心血管系統(tǒng)[3-5]。研究顯示MYOCD在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中也起著重要的作用;其在平滑肌肉瘤中經(jīng)常表達(dá)異常;分化良好、侵襲性強(qiáng)的腹膜后平滑肌肉瘤中MYOCD呈高表達(dá)狀態(tài)[6],而人子宮平滑肌肉瘤細(xì)胞中呈低表達(dá)[7];有報道認(rèn)為其發(fā)揮了癌基因的作用。比如,在肺癌細(xì)胞中MYOCD高表達(dá)可以促進(jìn)TGF-β誘導(dǎo)的肺癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-to-mesenchymal transition,EMT)和侵襲遷移[8];也有報道MYOCD在腫瘤中扮演抑癌基因的角色[7,9],可抑制子宮平滑肌肉瘤的生長[7]。但是,關(guān)于該基因在結(jié)直腸癌中的作用知之甚少。有研究報道,MYOCD可抑制多種類型癌細(xì)胞的生長[9-10],這引起我們對該基因在結(jié)直腸癌中所扮演角色的興趣。本文主要通過基本的分子生物學(xué)技術(shù)研究其在結(jié)直腸癌中的作用,初步探討其對結(jié)直腸癌增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移的作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與試劑

人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116、Lo Vo以 及HEK293T細(xì)胞株由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院分子生物中心保種培養(yǎng)傳代;過表達(dá)人MYOCD質(zhì)粒以及對照質(zhì)粒購于上海吉凱基因科技有限公司;人MYOCD基因慢病毒過表達(dá)PLVXpuro質(zhì)粒由本實驗室提供模板后由啟動子公司構(gòu)建;過表達(dá)對照質(zhì)粒由啟動子公司提供;包膜質(zhì)粒p MD2.G與包裝質(zhì)粒psPAX2由本實驗提供;培養(yǎng)液DMEM高糖(2×)購于吉諾生物公司;DMEM培養(yǎng)液、OptiMEM培養(yǎng)液、McCoy’s 5A培養(yǎng)液、NP-40裂解液、Turbo Fect Transfection Reagent購于賽默飛世爾科技公司;Cell Max胎牛血清購于賽澳美細(xì)胞技術(shù)(北京)有限公司,CCK-8檢測試劑盒(Cell counting kit-8)、MYOCD一抗、β-actin一抗、CD133一 抗、ABScriptⅢRT Master Mix for qPCR with gDNA remove試劑盒購于愛博泰克生物公司;qPCR SYBR Green Master Mix、ECL化學(xué)發(fā)光超敏顯色試劑盒購于上海翊圣生物科技有限公司;辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗購于西酶科技有限公司;Matrigel基質(zhì)凝膠購于康寧(中國上海)公司;Agarose L.M.P低熔點瓊脂糖購于Biosharp公司;Transwell 24孔(8μm孔徑)板購于武漢啟動子公司。

1.2 臨床樣本收集和細(xì)胞培養(yǎng)

臨床樣本來自于診斷為結(jié)直腸癌患者的癌組織與配對的癌旁正常組織;結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞與Lo Vo細(xì)胞培養(yǎng)在含有5%CO2的37℃恒溫箱中,細(xì)胞傳代時,使用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞數(shù)分鐘,加入培養(yǎng)液(含10%胎牛血清)中和胰蛋白酶,離心后將細(xì)胞輕柔吹打成單細(xì)胞懸液。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

將細(xì)胞鋪于6孔板中,加入2 m L完全培養(yǎng)液培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁,融合度達(dá)70%時進(jìn)行轉(zhuǎn)染。分別將質(zhì)粒和TurboFect轉(zhuǎn)染試劑溶于250μL Opti-MEM培養(yǎng)液中,輕柔混合再次靜置20 min。棄6孔板中細(xì)胞培養(yǎng)液,加入1.5 m L完全培養(yǎng)液。20 min后,將質(zhì)粒和TurboFect轉(zhuǎn)染試劑混懸液輕柔加入6孔板中,繼續(xù)放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.4 Western blot檢測蛋白表達(dá)

細(xì)胞鋪于6孔板中培養(yǎng),蛋白提取時將細(xì)胞置于冰上,以NP-40細(xì)胞裂解液冰上裂解30 min,刮取細(xì)胞置于1.5 m L EP管中,高速低溫離心(4℃,12000 r/min)15 min,取上清液測蛋白濃度,計算樣品濃度及蛋白上樣量。加樣,以SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白,濕轉(zhuǎn)至PVDF膜,5%脫脂牛奶封閉2 h。分別加入一抗(1∶1000)后孵育過夜,TBST緩沖液漂洗后,辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗室溫孵育2 h,再次TBST漂洗后在Western blot曝光機(jī)下利用ECL發(fā)光顯色,組織蛋白灰度值測量運用Image J軟件。

1.5 熒光實時定量RT-PCR檢測

總RNA提取采用Trizol法,ABScriptⅢRT Master Mix for aPCR with gDNA remove逆轉(zhuǎn)錄試劑用于合成cDNA,qPCR SYBR Green Master Mix試劑用于定量PCR,均按說明書操作。β-actin用作內(nèi)參基因,相對雙Delta Ct法用于相對定量結(jié)果分析。引物序列:MYOCD上游引物,ACGGATGCTTTTGCCTTTGAA;MYOCD下游引物,AACCTGTCGAAGGGGTATCTG;β-actin上 游 引 物,CATGTACGTTGCTATCCAGGC;β-actin下 游 引物,CTCCTTAATGTCACGCACGAT;CD133上游引物,AGTCGGAAACTGGCAGATAGC;CD133下游引物,GGTAGTGTTGTACTGGGCCAAT。

1.6 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖

細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后,將各組細(xì)胞鋪于96孔板,采用細(xì)胞計數(shù)板計數(shù),每孔約5000個細(xì)胞(體積100 μL),每組設(shè)置3個復(fù)孔。待細(xì)胞貼壁后,分別于0、24、48、72 h在每孔中加入10μL CCK-8,孵育1.5 h后,使用酶標(biāo)儀檢測細(xì)胞在450 nm波長處的吸光度,繪制各組細(xì)胞生長曲線。

1.7 劃痕實驗

將CRC細(xì)胞種植在6孔板中,100%融合后。用200μL移液管尖端繪制線性劃痕。然后用磷酸鹽緩沖液(PBS)輕輕沖洗細(xì)胞,用無血清培養(yǎng)液抑制細(xì)胞增殖,用顯微鏡拍照,培養(yǎng)24 h后,通過比較起始時間點(0 h)和最后時間點(24 h)的圖像,計算細(xì)胞遷移面積(運用Image J軟件),再轉(zhuǎn)化為平均遷移距離。

1.8 Transwell遷移與侵襲實驗

在24孔培養(yǎng)皿中使用Transwell小室進(jìn)行侵襲實驗。轉(zhuǎn)染24 h后,細(xì)胞消化后用無血清培養(yǎng)液重懸,在上腔加入200μL(細(xì)胞數(shù)目約10萬),同時,將含20%胎牛血清(FBS)的培養(yǎng)液放入下腔。孵育24 h后,上室細(xì)胞用4%甲醛固定,0.05%結(jié)晶紫染色。用顯微鏡在200倍放大率下觀察并計數(shù)遷移的細(xì)胞數(shù)。

1.9 穩(wěn)定高表達(dá)細(xì)胞系的構(gòu)建

所有操作均在生物安全柜中進(jìn)行。運用HEK293T細(xì)胞進(jìn)行病毒顆粒的包裝,轉(zhuǎn)染12 h后換一次培養(yǎng)液;再過24 h后用針筒和0.45μm濾器將培養(yǎng)液過濾收集;隨后感染目的細(xì)胞,經(jīng)過嘌呤霉素篩選48 h得到MYOCD穩(wěn)定高表達(dá)的CRC細(xì)胞系用于后續(xù)實驗。

1.10 克隆形成實驗

用嘌呤霉素篩選后的CRC細(xì)胞消化計數(shù),每孔2000細(xì)胞接種于軟瓊脂或6孔板中;其中軟瓊脂需配置1.2% Argrose下膠和0.7% Argrose上膠,細(xì)胞均勻懸浮混于上層膠;再放入培養(yǎng)箱培養(yǎng),每2天換一次液,2周后取出棄上清;PBS清洗2遍,甲醇固定,結(jié)晶紫染色拍照。

1.11 臨床生物信息學(xué)

UALCAN分析工具(http://ualcan.path.uab.edu/)被用于分析TCGA數(shù)據(jù)庫(https://portal.gdc.com)中MYOCD基因在不同癌組織與癌旁正常組織基因表達(dá)差異。

在比較MYOCD表達(dá)量與p TNM stage分期的關(guān)系時,用到TCGA數(shù)據(jù)庫(https://portal.gdc.com)下載的620例結(jié)直腸癌RNA測序數(shù)據(jù)(第三級)的表達(dá)譜數(shù)據(jù)和相應(yīng)的臨床信息與779例TEGx數(shù) 據(jù) 庫(https://gtexportal.org/home/)中的正常組織樣品,R軟件V4.0.3進(jìn)行統(tǒng)計分析,以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

干細(xì)胞特性分析:從Genomic Data Commons(GDC)(https://portal.gdc.cancer.gov/)數(shù)據(jù)門戶網(wǎng)站下載腫瘤RNA-seq(FPKM)數(shù)據(jù)(TCGA),將FPKM數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為TPM并對數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理log2(TPM+1),同時保留記錄有臨床信息的樣本。使用OCLR算法來計算mRNAsi,基于mRNA表達(dá)的特征包含11774個基因的基因表達(dá)譜,使用相同的Spearman相關(guān)(RNA表達(dá)數(shù)據(jù)),隨后利用減去最小值并除以最大值的線性變換將干性指數(shù)映射到[0,1]范圍[11-12]。

1.12 統(tǒng)計學(xué)方法

Graphpad prism 9用于實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計學(xué)分析與繪圖,檢驗方法根據(jù)數(shù)據(jù)類型分別采用克魯斯卡爾-沃利斯檢驗(Kruskal-Wallis test)、t檢驗(Student’st-test)、卡方檢驗(chi-square test);每組實驗均進(jìn)行了3次獨立重復(fù)實驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MYOCD在癌組織中低表達(dá)

為了闡明MYOCD在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用,我們使用UALCAN分析工具[13],在TCGA數(shù)據(jù)庫中分析了MYOCD在癌組織和癌旁正常組織中的表達(dá)水平,如圖1A～1F,與癌旁正常組織相比,MYOCD在乳腺癌、肺腺癌、前列腺癌、胃腺癌、食管癌、結(jié)直腸腺癌中,m RNA表達(dá)量明顯下調(diào)。為進(jìn)一步驗證,我們收集了4例臨床癌組織與配對的癌旁組織樣本,用實時熒光定量PCR檢測MYOCD mRNA的表達(dá)量(圖1G),可以看到,與癌旁正常組織相比,結(jié)直腸癌組織MYOCD的m RNA表達(dá)量均明顯下降。進(jìn)一步,我們用Western blot檢測蛋白水平的變化,并用Image J分析,得到了相同的結(jié)果(圖1H)。

圖1 MYOCD在多種類型的癌組織中表達(dá)下調(diào)Fig.1 MYOCD expression was down-regulated in different carcinoma tissues

2.2 MYOCD可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖

為研究MYOCD基因在CRC細(xì)胞中的功能,我們在結(jié)直腸癌細(xì)胞株HCT116、Lo Vo中瞬時轉(zhuǎn)染高表達(dá)MYOCD質(zhì)粒與對照質(zhì)粒(NC)。如圖2所示,轉(zhuǎn)染后48 h后,用實時熒光定量PCR分別檢測高表達(dá)組與對照組MYOCD mRNA的水平(圖2A,2B),用Western blot檢測高表達(dá)組與對照組MYOCD蛋白水平(圖2C、2D)?？梢钥吹?與對照組相比,HCT116、Lo Vo細(xì)胞的MYOCD基因在mRNA和蛋白水平均明顯增加。用CCK-8實驗檢測高表達(dá)對CRC細(xì)胞增殖能力的影響(圖2E、2F),可見高表達(dá)MYOCD后CRC細(xì)胞增殖能力明顯低于對照組。

圖2 MYOCD可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖Fig.2 Overexpression of MYOCD inhibited the proliferation of colorectal cancer cells

2.3 高表達(dá)MYOCD對CRC遷移與侵襲無明顯影響

為了進(jìn)一步研究MYOCD的功能,我們分別使用劃痕實驗與Transwell實驗研究高表達(dá)MYOCD對CRC遷移與侵襲能力的影響。如圖3所示,高表達(dá)MYOCD對HCT116與Lo Vo細(xì)胞的遷移與侵襲能力均無明顯影響。運用生物信息學(xué)工具,我們將TCGA數(shù)據(jù)中結(jié)腸癌與直腸癌組織MYOCD表達(dá)量根據(jù)四分位數(shù)分組(圖4),運用卡方檢驗比較臨床信息百分比例是否有差異;發(fā)現(xiàn)癌組織MYOCD的表達(dá)水平與p TNM stage分期無顯著相關(guān)性(結(jié)腸癌低表達(dá)組vs.結(jié)腸癌高表達(dá)組P=0.291;直腸癌低表達(dá)組vs.直腸癌高表達(dá)組P=0.300)。

圖3 MYOCD高表達(dá)對結(jié)直腸癌細(xì)胞遷移及侵襲的影響Fig.3 Effect of overexpression of MYOCD on migration and invasion of colorectal cancer cells

圖4 MYOCD對CRC干細(xì)胞特性的影響Fig.4 MYOCD inhibited the stem cell properties of colorectal cancer cells

2.4 MYOCD與腫瘤干細(xì)胞特性

大多數(shù)人類癌癥是由干細(xì)胞和祖細(xì)胞群通過各種遺傳和表觀遺傳改變的順序積累而發(fā)展起來的,其進(jìn)展包括分化表型的逐漸喪失和祖細(xì)胞及干細(xì)胞樣特征的獲得,因而干細(xì)胞特性與腫瘤密切相關(guān)。為了進(jìn)一步研究MYOCD在腫瘤中所起的作用,我們運用TCGA數(shù)據(jù)庫分析MYOCD表達(dá)與干細(xì)胞特性的關(guān)系,可見MYOCD表達(dá)越高,結(jié)直腸癌組織干性評分越低,MYOCD表達(dá)越低,結(jié)直腸癌組織干性評分越高,且均高于正常組織樣本的干性評分(圖4A),提示MYOCD可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的干細(xì)胞特性。為進(jìn)一步驗證其對CRC干細(xì)胞特性的影響,我們檢測了高表達(dá)MYOCD后對其CD133表達(dá)的影響(圖4B～4E),發(fā)現(xiàn)高表達(dá)MYOCD后CD133在m RNA水平(圖4B、4C)與蛋白水平(圖4D、4E)表達(dá)均下降(均P＜0.01)。

2.5 高表達(dá)MYOCD抑制CRC細(xì)胞的克隆形成能力

為了進(jìn)一步驗證MYOCD對CRC干細(xì)胞特性的調(diào)控作用,我們利用慢病毒構(gòu)建了MYOCD高穩(wěn)定表達(dá)的Lo Vo細(xì)胞系;并對其在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平進(jìn)行了驗證(圖5A、5B);隨后用此細(xì)胞分別進(jìn)行平板克隆形成實驗與軟瓊脂成球?qū)嶒?圖5C、5D)。結(jié)果表明,高表達(dá)MYOCD可明顯抑制CRC細(xì)胞的克隆形成能力。

圖5 高表達(dá)MYOCD可抑制CRC細(xì)胞的克隆形成能力Fig.5 Overexpression of MYOCD inhibited the colony forming ability of colorectal cancer cells

3 討論

癌癥干細(xì)胞(CSC)的概念于40年前提出,該理論認(rèn)為,腫瘤的生長由隱藏在癌組織中的少量腫瘤干細(xì)胞推動,并由此解釋了許多臨床現(xiàn)象,包括腫瘤在最初成功的化療和放療后幾乎不可避免地復(fù)發(fā)、腫瘤休眠現(xiàn)象、轉(zhuǎn)移等[14-17]。用于分離CSC生物標(biāo)志物之一的CD133是一種5次跨膜糖蛋白,與CSC在腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和化療耐藥中的作用密切相關(guān),廣泛參與腫瘤發(fā)生、代謝、凋亡和自噬等,被認(rèn)為是CSC的“阿喀琉斯之踵”[18]。實驗中我們發(fā)現(xiàn),MYOCD在結(jié)直腸癌細(xì)胞中發(fā)揮著腫瘤抑制基因(TSG)的作用,抑制了CRC的增殖,對CRC細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力無明顯影響,并發(fā)現(xiàn)在腫瘤細(xì)胞高表達(dá)MYOCD后,出現(xiàn)了CD133的表達(dá)降低,提示MYOCD可能通過降低腫瘤細(xì)胞的干細(xì)胞特性從而發(fā)揮TSG的作用。

有研究發(fā)現(xiàn)MYOCD可通過招募PRMT5/MEP50甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物通過表觀遺傳修飾TGFBR2啟動子區(qū)域以沉默其在肺癌細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄,降低Smad3的磷酸化,抑制TGFBR信號,從而發(fā)揮TSG的作用;并發(fā)現(xiàn)MYOCD缺失的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞對于轉(zhuǎn)化生長因子受體(TGFR)抑制劑更加敏感,提示MYOCD缺失在臨床上的應(yīng)用價值[19];此外還可抑制ALDH1的表達(dá),而ALDH1也作為一種CSC的標(biāo)志物,在腫瘤中發(fā)揮重要的功能[20]。有趣的是,另有文獻(xiàn)報道MYOCD可促進(jìn)TGF-β誘導(dǎo)的EMT和非小細(xì)胞肺癌的轉(zhuǎn)移,與SMAD3/SMAD4結(jié)合形成的正反饋環(huán)路促進(jìn)snail的表達(dá)誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞的EMT。但在結(jié)直腸癌細(xì)胞中,我們并未發(fā)現(xiàn)其對細(xì)胞遷移侵襲有顯著影響。值得注意的是TGF-β可促進(jìn)MYOCD的表達(dá)[2,8],然而TGF-β信號通路在腫瘤發(fā)展前期抑制腫瘤生長,后期該功能丟失[21]。一個重要的原因是其喪失對下游基因如CDKN2B,CDKN1A和CDKN1C等抑癌基因的調(diào)控,而該過程仍然有待徹底闡明。有研究發(fā)現(xiàn)淋巴瘤激酶(ALK)可磷酸化Smad4的酪氨酸殘基,使癌細(xì)胞阻斷TGF-β介導(dǎo)腫瘤抑制信號[22];而在TGF-β信號中起到中心轉(zhuǎn)導(dǎo)作用的Smad4突變在結(jié)直腸癌中更是高達(dá)10%[21]?？梢酝茰y,MYOCD表達(dá)降低可能與TGF-β的細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)阻斷有關(guān)。此外,在數(shù)種鼻咽癌細(xì)胞系中觀察到MYOCD的低表達(dá)與其啟動子高甲基化有關(guān),用去甲基化劑5-氮雜胞苷處理這些癌細(xì)胞,可以增加MYOCD的表達(dá)[23]。在乳腺癌中,MYOCD可以促進(jìn)乳腺絲抑蛋白(Maspin)的表達(dá),而Maspin可誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞的凋亡[9]。除了癌組織中MYOCD表達(dá)普遍降低,在其他類型腫瘤細(xì)胞的惡變中,MYOCD表達(dá)經(jīng)常受抑制,導(dǎo)致細(xì)胞分化障礙,MYOCD重新表達(dá)又可引起細(xì)胞分化,抑制腫瘤增殖[7,9-10]。同時還可激活CNN1和一些平滑肌細(xì)胞收縮基因,而這些基因在轉(zhuǎn)移瘤中表達(dá)量減少[24-25]。值得注意的是血管平滑肌表型具有較強(qiáng)的可塑性,而血管平滑肌肉瘤卻極其罕見[26],該原因的分子基礎(chǔ)還不是很清楚,可能與平滑肌限制性MYOCD亞型有關(guān),該亞型與心肌細(xì)胞內(nèi)的亞型相比有著更強(qiáng)的生長抑制作用[27]。

然而,任何研究均有其局限性,本實驗中我們用到了TCGA數(shù)據(jù)庫與臨床組織樣本檢測癌組織與癌旁組織的MYOCD的表達(dá),但組織在除外癌細(xì)胞外還存在其他間質(zhì)細(xì)胞,腫瘤組織中存在的血管可表達(dá)MYOCD,而血管又在腫瘤的生長與轉(zhuǎn)移中起著重要的作用[17],從而影響結(jié)果分析;此外,體內(nèi)外實驗也有很大的不同,在遷移侵襲實驗中,缺少了腫瘤間質(zhì),而腫瘤微環(huán)境在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中起著非常重要的作用[28],腫瘤細(xì)胞EMT程序的激活通常需要癌細(xì)胞和鄰近基質(zhì)細(xì)胞(如免疫細(xì)胞等)之間的信號傳遞[29],因而無法完全反映體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的真實生物學(xué)行為。

總之,我們的研究發(fā)現(xiàn)MYOCD在結(jié)直腸癌組織中低表達(dá),高表達(dá)MYOCD后可抑制CRC細(xì)胞的增殖,而對其遷移與侵襲無明顯影響。此外,生物信息學(xué)方法提示MYOCD表達(dá)與結(jié)直腸癌組織的干細(xì)胞特性呈負(fù)相關(guān),高表達(dá)MYOCD可抑制CD133的表達(dá),并顯著抑制CRC細(xì)胞的克隆形成能力,提示MYOCD可能通過影響CRC細(xì)胞的干細(xì)胞特性在結(jié)直腸癌中發(fā)揮TSG的作用。