楊麗敏,魏 巍,劉 璐,陳志海,張 鈺△
1蘇州大學附屬第一醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科,蘇州 215006
2蘇州大學附屬無錫九院呼吸與危重癥醫(yī)學科,無錫 214062
近年來,慢性阻塞性肺疾病(chronic obstruc-tive pulmonary disease,COPD)發(fā)病率持續(xù)增加,已成為全球人類第三大死因,極高的COPD發(fā)病率和病死率給社會帶來巨大的經(jīng)濟負擔[1]。COPD是一種進展性炎癥性肺病,氣道炎癥是其主要特征之一[2]。據(jù)報道,各種顆粒或氣體吸入可能導致COPD,特別是香煙煙霧的吸入被認為是其發(fā)展最重要的危險因素[3]。煙霧能夠引起中性粒細胞和淋巴細胞的浸潤,并且誘導促炎因子包括白細胞介素-6(interleukin-6,IL-6)和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)等的變化[4]。有研究發(fā)現(xiàn)脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)能觸發(fā)轉錄因子NF-κB的激活,進而轉錄產(chǎn)生多種炎癥介質,在COPD氣道炎癥中起著舉足輕重的作用[5]。
盡管在COPD的治療方面已經(jīng)取得了一些成效,但是傳統(tǒng)藥物,尤其是皮質類固醇等藥效非常有限。因此,開發(fā)COPD的預防性藥物具有重要意義。姜黃素(curcumin),俗稱姜黃,是一種從姜黃根中提取的酚類色素,常用作香料。越來越多的證據(jù)表明姜黃素具有多種潛在藥理特性,如抗腫瘤、抗氧化、抗炎等[6]。研究顯示,NF-κB與COPD氣道炎癥相關,NF-κB抑制劑可能成為氣道炎癥性疾病一種新的治療方法[7]。此前,有文獻證明姜黃素可能抑制哮喘模型中NF-κB通路活性[8-9]。然而,人們對姜黃素在LPS誘導的COPD模型中的作用知之甚少。有學者研究發(fā)現(xiàn)lncRNA NNT-AS1在COPD肺組織和支氣管上皮細胞炎性損傷中發(fā)揮重要作用[10]。
本實驗研究了姜黃素對LPS誘導BEAS-2B細胞炎癥性損傷的影響,分子機制可能與其通過lncRNA NNT-AS1抑制NF-κB通路有關。本研究結果為深入探究姜黃素對COPD治療作用的潛在機制提供新的線索。
以2021年3月至2021年7月在蘇州大學附屬無錫市第九人民醫(yī)院呼吸科就診的30例急性加重期COPD患者作為試驗組,以及同一時期30例健康體檢者作為對照組。收集所有入組對象一般臨床資料,并于入組當天采集外周血標本。排除標準:①合并惡性腫瘤或其他嚴重的肺部疾病;②充血性心力衰竭,入組前3個月內心肌梗死或入組前1個月內不穩(wěn)定型心絞痛;③入組前12個月內癲癇發(fā)作,既往有腦卒中病史或神經(jīng)系統(tǒng)疾病影響下肢活動者。
本研究獲得蘇州大學附屬無錫市第九人民醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審核批準,取得受試者或其授權家屬知情同意并簽署知情同意書。
支氣管上皮細胞BEAS-2B購自中國科學院上海生物化學與細胞生物學研究所。RPMI 1640培養(yǎng)液、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶、青霉素-鏈霉素(雙抗)混合溶液購自美國Hyclone公司;熒光定量試劑盒SYBR Premix Ex Taq TM(Tli RNase HPlus)和反轉錄試劑盒One Step PrimeScript cDNA Synthesis Kit購自大連寶生物有限公司;兔源一抗GAPDH、NF-κB p65、IκBα以及HRP標記的二抗均購自武漢三鷹生物技術有限公司;CCK-8檢測試劑盒和Ed U購自南京曼夫特生物科技有限公司;姜黃素(≥98.0%)購自美國Sigma公司。
取出凍存的BEAS-2B細胞,水浴鍋中復蘇后加入8 m L預熱的含有10%胎牛血清及1%青霉素-鏈霉素的培養(yǎng)液,離心后用新鮮培養(yǎng)液重懸細胞,將細胞轉移到細胞培養(yǎng)瓶,置于37℃,5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待細胞密度達約95%后用0.25%胰蛋白酶進行消化傳代。姜黃素和LPS分別用DMSO與PBS稀釋,按照1×105/孔的密度將細胞接種于6孔板內,待細胞貼壁后更換成無血清的培養(yǎng)液。次日將細胞分成3組:對照組、LPS處理組、LPS+Curcumin組。LPS組:用終濃度10μg/m L的LPS處理;LPS+Curcumin組:終濃度10μg/m L LPS處理30 min后用5μmol/L的姜黃素處理細胞。
將細胞按照每孔1×104/孔的密度接種到96孔板中,當孔內細胞密度達到50%左右進行處理(如1.3)。分別在處理后0、24、48、72 h,每孔加入5μL的CCK-8溶液,繼續(xù)培養(yǎng)2 h后加入DMSO終止反應,使用酶標儀在450 nm的波長下測定各孔內吸光度值,以空白為對照,根據(jù)各組細胞的平均吸光度值判斷各組細胞的增殖情況。
細胞爬片放在12孔板中,隨后將細胞按照1×105/孔的密度接種到培養(yǎng)孔中,常規(guī)培養(yǎng)待細胞貼壁后進行處理。待細胞處理后24 h,用預熱的PBS洗2次后用4%多聚甲醛固定2 h,加入Ed U染色液室溫孵育2 h,最后用DAPI進行核染色后在熒光顯微鏡下進行觀察并拍照。
外周血樣本離心后取上清,轉移到干凈的離心管中,-20℃長期保存或者直接用于后續(xù)實驗。細胞處理24 h后收集細胞上清液,用白細胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、IL-6、TNF-α和轉化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)ELISA檢測試劑盒檢測各組細胞上清中炎癥細胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α和TGF-β的含量。使用酶標儀在450 nm的波長下測定各孔內吸光度值,以空白為對照,根據(jù)說明書計算并判斷各組細胞的增殖情況。
細胞處理24 h后,向每孔細胞中加入800μL Trizol試劑提取細胞總RNA,選取1μg質量較好的RNA,使用反轉錄試劑盒合成cDNA,按照說明書步驟進行。然后以此cDNA為模板進行定量PCR檢測,目標基因的表達使用GAPDH作為內參,定量結果采用2-ΔΔCt表示。
引物序列為:lnc RNA NNT-AS1上游引物,5′-ACGTGCAGACAACATCTACCT-3′;下 游 引 物,5′-TACAACACCTTCCCGCAT-′3。GAPDH上游引物,5′-GTGAGGTGACCGCATCTTCT-3′;下游引物,5′-CTTGCCGTGGGTAGAGTCA-3′。
細胞處理24 h后,去除舊的培養(yǎng)液,用PBS洗2遍。向每孔細胞中加入150μL蛋白裂解液冰上孵育30 min后離心提取總蛋白。將樣本與SDS上樣緩沖液按照體積比4∶1混勻,沸水煮10 min使蛋白質變性。樣品通過SDS-PAGE電泳凝膠恒壓電泳,采用濕轉法將凝膠上的蛋白轉移至PVDF膜,然后將膜置于5%BSA中封閉2 h。TBST洗3次后4℃一抗(1∶1000)孵育過夜。TBST洗滌PVDF膜3次,每次5 min;第二天室溫孵育二抗(1∶4000)1 h。TBST洗滌PVDF膜3次,每次5 min;避光環(huán)境中ECL顯影,在化學發(fā)光儀中曝光并拍照。最終結果表示為目標條帶吸光度與內參GAPDH吸光度的比值。
本研究中所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 20.0軟件進行分析,作圖用GraphPad Prism 8軟件進行。計量資料采用(±s)表示,組間均數(shù)比較采用t檢驗,以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。
通過ELISA檢測COPD和對照組血清中IL-1β、IL-6、TNF-α和TGF-β的含量變化情況。結果顯示,COPD患者血清中IL-1β、IL-6、TNF-α和TGF-β含量顯著升高(均P<0.01)。見圖1。
圖1 COPD患者血清炎癥因子含量Fig.1 The levels of inflammatory factors in serums of COPD patients
通過定量PCR檢測發(fā)現(xiàn),LPS處理支氣管上皮細胞BEAS-2B后,細胞lncRNA NNT-AS1相對表達量顯著升高(P<0.01)。見圖2。
圖2 LPS處理對BEAS-2B細胞lncRNA NNT-AS1表達的影響Fig.2 Effect of LPSon lncRNA NNT-AS1 expression in BEAS-2B cells
為進一步研究LPS處理后BEAS-2B細胞的增殖活力變化情況,我們在LPS處理后通過CCK-8和Ed U實驗檢測各組細胞的增殖情況。
結果顯示,與對照組相比,LPS處理組細胞增殖活力顯著增強(P<0.01,圖3A),24 h后細胞中Ed U染色陽性率顯著增加(圖3B)。
圖3 LPS處理對BEAS-2B細胞增殖的影響Fig.3 Effect of LPS on proliferation of BEAS-2B cells
經(jīng)過LPS處理后,我們通過ELISA檢測各組細胞上清中IL-1β、IL-6、TNF-α和TGF-β的含量變化情況。
結果顯示,LPS處理后細胞上清中IL-1β、IL-6、TNF-α和TGF-β的含量升高(均P<0.01,圖4A~4D)。同時,Western blot檢測顯示,LPS處理后細胞中NF-κB p65表達顯著升高、IκBα表達顯著降低(圖4E)。
圖4 LPS處理對BEAS-2B細胞炎癥因子表達的影響Fig.4 Effect of LPS on inflammatory cytokines in BEAS-2B cells
為進一步探索姜黃素對LPS誘導的炎癥損傷的保護作用,我們在LPS處理后,加入姜黃素。隨后通過定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)姜黃素處理降低了LPS誘導支氣管上皮細胞BEAS-2B中l(wèi)ncRNA NNTAS1相對表達量的升高(P<0.01,圖5A)。另外,我們發(fā)現(xiàn)姜黃素處理減緩了LPS處理引起的細胞增殖能力升高(P<0.01,圖5B),24 h后細胞中Ed U染色的陽性率較LPS組減少(圖5C)。
圖5 姜黃素處理對LPS誘導BEAS-2B細胞增殖的影響Fig.5 Effect of curcumin on LPS-induced proliferation of BEAS-2B cells
為揭示姜黃素對LPS誘導的炎癥損傷的保護作用機制,我們在LPS處理后,加入姜黃素。通過ELISA檢測各組細胞上清中IL-1β、IL-6、TNF-α和TGF-β的含量變化情況。結果顯示,姜黃素處理后減弱了因為LPS處理引起的細胞中IL-1β、IL-6、TNF-α和TGF-β的含量變化(均P<0.01,圖6A~6D)。同時,Western blot檢測顯示,姜黃素處理后減緩了LPS處理引起的細胞中NF-κB p65表達的升高、IκBα表達的降低(圖6E)。
圖6 姜黃素處理對LPS誘導BEAS-2B細胞炎癥因子的影響Fig.6 Effect of curcumin on LPS-induced inflammatory cytokines in BEAS-2B cells
本研究通過ELISA檢測30例COPD患者和30例健康對照人群血清中細胞炎癥因子含量的變化情況,發(fā)現(xiàn)COPD患者血清中IL-1β、IL-6、TNF-α和TGF-β含量均顯著升高。COPD患者體內的內毒素和免疫復合物能夠刺激巨噬細胞系統(tǒng)和內皮細胞不斷地產(chǎn)生IL-1β、IL-6和TNF-α因子,進而直接啟動炎癥反應損傷內皮細胞,或者通過刺激其他炎癥因子,引起機體炎癥級聯(lián)反應[11-13]。因此COPD患者不僅表現(xiàn)出氣道炎癥,同時也表現(xiàn)出輕度全身炎癥[14]。支氣管上皮細胞主要參與COPD氣道病理進程的免疫和炎癥反應[15]。為研究COPD氣道炎癥的病理機制,本研究利用LPS刺激支氣管上皮細胞構建氣道炎癥模型。結果顯示LPS增加了IL-1β、IL-6、TNF-α和TGF-β的水平,同時NF-κB p65表達升高,而IκBα表達降低。Jang等[16]證實LPS刺激支氣管上皮細胞會釋放包括IL-1β、IL-6、TNFα等炎癥介質。NF-κB已被報道在多種炎癥性疾病中發(fā)揮重要作用,NF-κB p65和IκBα是其中關鍵因子[17-19]。我們的結果提示LPS能夠激活NF-κB信號,誘導細胞炎性因子表達。越來越多的證據(jù)支持NF-κB在COPD的發(fā)病機制中起重要作用,且IL-1β、IL-6、TNF-α等炎癥因子的升高,能夠進一步活化NF-κB信號,促進炎癥反應[20]。
很多研究已經(jīng)證明傳統(tǒng)中草藥姜黃素可調節(jié)多種轉錄因子、炎癥調節(jié)因子、細胞粘附因子活性,具有抗炎作用[21]。在本研究中,我們發(fā)現(xiàn)姜黃素顯著抑制LPS誘導的BEAS-2B細胞的增殖,有效地減輕由支氣管上皮細胞釋放的炎癥介質IL-1β、IL-6、TNF-α和TGF-β的增加。氣道壁厚由上皮細胞增生引起,與COPD的嚴重程度密切相關[22]。研究顯示,姜黃素能夠緩解小鼠氣道炎癥反應、阻止氣道重建,延緩COPD進展[23]。提示姜黃素對COPD的保護作用可能與抑制支氣管上皮細胞的增殖有關。我們還發(fā)現(xiàn)姜黃素明顯抑制LPS刺激的BEAS-2B細胞中NF-κB的表達升高和IκBα的表達降低,說明姜黃素能夠抑制NF-κB信號、調控支氣管上皮細胞炎癥損傷。研究顯示LPS能夠通過IκB激酶依賴性磷酸化降解IκBα,激活NF-κB信號,引起炎癥損傷[24-25]。IL-6與TGF-β共同作用誘導氣道炎癥和氣道改造,而姜黃素能夠抑制中性粒細胞的募集和TGF-β的表達,緩解LPS誘導的氣道炎癥[26-27],與本研究結論一致。
lncRNAs的異常表達已被證實是多種肺部疾病的分子特征。已有l(wèi)ncRNA被報道在肺炎中能介導LPS誘導的細胞凋亡和炎癥損傷[28]。本研究結果顯示,LPS能夠促進支氣管上皮細胞BEAS-2B中l(wèi)nc RNA NNT-AS1的表達,而姜黃素抑制了LPS誘導的BEAS-2B細胞中l(wèi)ncRNA NNT-AS1的表達。之前的研究顯示lnc RNA NNT-AS1在COPD組織和支氣管上皮細胞炎性損傷中異常上調,下調lncRNA NNT-AS1可減弱支氣管上皮細胞異常增殖,抑制氣道炎癥反應[10]。以上研究提示姜黃素可能通過下調lncRNA NNT-AS1減輕支氣管上皮細胞炎性損傷。
綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)COPD患者血清中IL-1β、IL-6、TNF-α和TGF-β含量升高,可能引起級聯(lián)反應導致患者支氣管上皮細胞炎性損傷。姜黃素則能夠通過下調lncRNA NNT-AS1表達,抑制NFκB信號活性,緩解LPS誘導的炎癥因子釋放,保護支氣管上皮細胞。本研究結果可以為姜黃素治療COPD患者氣道炎癥的研究提供理論基礎。