馬曉佳，楊璐妍，黃冬涵，李本發(fā)，黃 敏

（1.云南省中醫(yī)醫(yī)院/云南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，昆明 650000；2云南中醫(yī)藥大學(xué)，昆明 650000）

乳腺炎屬于乳房化膿性炎癥，是一種最常見的乳腺疾病，主要特征為乳腺水腫，組織內(nèi)皮和上皮完整性破壞，多發(fā)生于女性產(chǎn)后哺乳期，由病原微生物感染所致[1-2]。MAP激酶（MAPK）信號通路與p38蛋白在炎癥反應(yīng)的調(diào)控中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[3-5]。有研究報(bào)道磷酸化p38蛋白參與了金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)小鼠乳腺炎和肺炎的形成[6]。因?yàn)榕R床上乳腺炎多由細(xì)菌感染引起，所以抗生素治療成為了治療急性乳腺炎的主要方法[7]。但長期廣泛使用抗生素會導(dǎo)致病原菌產(chǎn)生耐藥，也易導(dǎo)致炎癥組織機(jī)化遺留冷性僵塊，遷延難愈，逐漸成為制約乳腺炎治療的瓶頸。

中醫(yī)將急性乳腺炎歸屬于“乳癰”范疇，在用藥治療方面積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)[8]，多治以清熱解毒、通乳散結(jié)，具有療效好，不良反應(yīng)少等優(yōu)點(diǎn)[9]，記載于《醫(yī)宗金鑒》的瓜蔞牛蒡湯屬于治療乳癰經(jīng)典名方，具有清熱散邪、疏肝解郁等作用，多用于早期乳癰[10-11]。疏肝解郁湯在瓜蔞牛篣湯的基礎(chǔ)上進(jìn)行重新組方，既加強(qiáng)了疏肝清胃通乳的功效，又避免了原方過于寒涼，易形成冷性僵塊的弊端。本科室使用疏肝解郁湯數(shù)年，臨床療效顯著，患者獲益頗豐，但詳細(xì)機(jī)制不明，因此本研究從“疏肝解郁”方面探究重組方劑對乳腺炎的治療效果及其機(jī)制，為治療乳腺炎的提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 清潔級SD雌性孕期大鼠，8～10周齡，體質(zhì)量200～220 g，購自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動物有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK（川）2020-030，使用許可證號：SYXK（川）2019-189。疏肝解郁湯方劑組成：全瓜蔞15 g，炒柴胡10 g，牛蒡子15 g，重樓10 g，蒲公英15 g，制香附10 g，炒青皮10 g，郁金10 g，陳皮10 g，玫瑰花5 g，絲瓜絡(luò)10 g，鹿角霜10 g。將藥物在清水中浸泡0.5～1 h，煎取2次，第一次為0.5 h，第二次為0.3 h，混合兩次藥液，濃縮過濾至1 g/mL，冷藏備用，由云南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科提供，給藥時(shí)使用生理鹽水進(jìn)行稀釋。大鼠IL-1、IL-6、TNF-α免疫酶聯(lián)試劑盒購自上海茁彩生物科技有限公司。p38、p-p38、β-actin抗體購自艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司。MAPKAPK2、p-MAPKAPK2抗體購自美國Cell Signaling Technology公司。SpectraMAX Plus384酶標(biāo)儀（美谷分子儀器有限公司）；STM7顯微鏡（日本Olympus公司）；多功能凝膠成像儀（美國Bio-Rad公司）；JY-SCZ4+垂直電泳槽、JY200C電泳儀（北京君意東方電泳設(shè)備有限公司）；5200化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀（上海天能科技有限公司）。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 LPS大鼠乳腺炎模型構(gòu)建及藥物干預(yù)[12]大鼠分娩后泌乳第5～7天，隨機(jī)分為空白組、模型組、疏肝解郁中藥湯劑低劑量組（2.5 mg/kg）、疏肝解郁中藥湯劑中劑量組（5 mg/kg）、疏肝解郁中藥湯劑高劑量組（10 mg/kg），每組10只。與幼鼠隔離1 h后，將疏肝解郁中藥湯劑分別稀釋為0.125、0.25、0.5 mg/mL，給藥容積為20 mL/kg，進(jìn)行灌胃，空白組和模型組灌胃生理鹽水，每天1次，持續(xù)5 d。末次灌胃1 h后腹腔注射戊巴比妥鈉（0.6 g/kg）進(jìn)行麻醉，取仰臥位置于體視顯微鏡下，乙醇消毒第4對乳頭并使其充分暴露，鑷子固定乳頭，用眼科剪剪去乳頭尖端處，暴露乳導(dǎo)管，然后用微量注射器緩慢插入乳導(dǎo)管并灌注LPS（0.2 mg/mL），空白組灌注生理鹽水，停留數(shù)秒后再緩慢抽出針頭。12 h后各劑量組再次灌胃疏肝解郁湯，空白組和模型組灌胃相同劑量的生理鹽水。LPS刺激24 h后腹腔注射戊巴比妥鈉（0.6 g/kg）麻醉后進(jìn)行頸椎脫臼處死大鼠，采集指標(biāo)供后續(xù)測定。

1.2.2 乳腺組織病理學(xué)檢測 乙醇消毒后使用解剖剪剪開大鼠腹部皮膚，使第4對乳腺組織充分暴露，剝離乳腺組織放置在4%多聚甲醛中固定過夜，各組標(biāo)本進(jìn)行脫水處理后制作石蠟切片，HE染色后使用顯微鏡在100、400倍放大倍數(shù)下觀察乳腺組織病理學(xué)變化。

1.2.3 Elisa 檢測收集各組動物血液與乳腺組織，血液經(jīng)離心后收集上層血清。乳腺組織制成10%組織勻漿液，離心后收集上清液，按Elisa試劑盒說明書分別測定血清與組織中IL-1、IL-6與TNF-α的含量。

1.2.4 Western Blot 收集各組乳腺組織，加入組織裂解液在冰上進(jìn)行蛋白質(zhì)提取，同時(shí)進(jìn)行蛋白定量。定量后加入Loading Buffer后97 ℃水浴10 min進(jìn)行蛋白變性，在4 ℃下保存?zhèn)溆谩０?0 μg蛋白進(jìn)行凝膠電泳，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜后在5%脫脂奶粉中室溫封閉2 h，轉(zhuǎn)移至一抗中4 ℃過夜孵育，TBST清洗3遍后室溫孵育二抗2 h，TBST清洗3遍后進(jìn)行ECL化學(xué)發(fā)光，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察條帶，并進(jìn)行拍照與灰度值分析，以β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算蛋白表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。所有數(shù)值均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較使用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較使用LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 疏肝解郁湯對乳腺炎大鼠乳腺組織影響 觀察發(fā)現(xiàn)，空白組大鼠乳腺組織中乳腺小葉結(jié)構(gòu)較為明顯，周圍腺泡數(shù)量較多，無明顯壞死或炎細(xì)胞浸潤；模型組大鼠乳腺組織導(dǎo)管部分上皮細(xì)胞壞死脫落于管腔內(nèi)，部分細(xì)胞崩解，胞核固縮、碎裂或溶解消失，管腔內(nèi)可見桿狀核中性粒細(xì)胞等炎細(xì)胞浸潤；疏肝解郁湯低劑量組大鼠活動期乳腺組織乳腺小葉結(jié)構(gòu)清晰，葉間間隙小，周圍腺泡數(shù)量較多，導(dǎo)管少量上皮細(xì)胞壞死，胞核溶解，管腔內(nèi)可見少量炎細(xì)胞浸潤，少量腺泡上皮細(xì)胞壞死；疏肝解郁湯中劑量組大鼠活動期乳腺組織乳腺小葉結(jié)構(gòu)清晰，葉間間隙小，周圍腺泡數(shù)量較多；導(dǎo)管少量上皮細(xì)胞空泡變性，管腔可見少量的淋巴細(xì)胞浸潤，部分腺泡上皮細(xì)胞空泡變性，腺泡腔內(nèi)少量的淋巴細(xì)胞浸潤；疏肝解郁湯高劑量組大鼠活動期乳腺組織乳腺小葉結(jié)構(gòu)清晰，周圍腺泡數(shù)量較多，導(dǎo)管結(jié)構(gòu)完整，無明顯壞死及炎細(xì)胞浸潤；少量腺泡上皮細(xì)胞空泡變性。具體見圖1。

圖1 各組大鼠乳腺組織變化情況（HE染色，放大倍數(shù)100、400倍）

2.2 疏肝解郁湯對乳腺炎大鼠血清與乳腺組織中IL-1、IL-6、TNF-α的影響 結(jié)果顯示，與空白組相比，模型組大鼠血清與組織中IL-1、IL-6、TNF-α的含量均升高（P＜0.01）；與模型組相比，疏肝解郁湯高劑量組血清與組織中IL-1、IL-6、TNF-α的含量均降低（P＜0.05），疏肝解郁湯中劑量組血清與組織中IL-1、組織中IL-6含量降低（P＜0.05），疏肝解郁湯低劑量組雖有降低趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具體結(jié)果見表1、表2。

表1 各組動物血清中IL-1、IL-6、TNF-α變化情況（，n =10） pg/mL

表1 各組動物血清中IL-1、IL-6、TNF-α變化情況（，n =10） pg/mL

注：與空白組比較，## P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

表2 各組動物乳腺組織中IL-1、IL-6、TNF-α變化情況（，n =10） pg/mL

表2 各組動物乳腺組織中IL-1、IL-6、TNF-α變化情況（，n =10） pg/mL

注：與空白組比較，## P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

2.3 疏肝解郁湯對乳腺炎大鼠乳腺組織中p38、p-p38、MAPKAPK2與p-MAPKAPK2蛋白表達(dá)的影響 與空白組相比，各組大鼠乳腺組織中p38與MAPKAPK2蛋白表達(dá)水平無變化（P＞0.05），其中模型組p-p38與p-MAPKAPK2蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.01）；與模型組相比，疏肝解郁湯高、中、低劑量組p-p38蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.01），高劑量組p-MAPKAPK2蛋白水平下降（P＜0.05），中、低劑量組p-MAPKAPK2無明顯變化（P＞0.05），具體見圖2。

圖2 各組大鼠乳腺組織蛋白表達(dá)水平變化情況

3 討論

LPS能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生急性炎癥反應(yīng)，因此被用于構(gòu)建多種動物乳腺炎模型中[13-15]。本實(shí)驗(yàn)通過病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)模型組乳腺組織中存在大量中性粒細(xì)胞等炎性細(xì)胞聚集的情況，符合乳腺炎的癥狀[16-17]，說明動物乳腺炎模型構(gòu)建成功。而使用疏肝解郁湯后，乳腺組織中腺泡數(shù)量與導(dǎo)管結(jié)構(gòu)開始恢復(fù)，中性粒細(xì)胞與淋巴細(xì)胞消失，說明疏肝解郁湯具有緩解乳腺組織病變效果。

IL-1是一種炎癥介質(zhì)，具有IL-1α與IL-1β兩種亞型[18]。IL-1β被外來抗原刺激后分泌量急劇增加；IL-6是一種多功能細(xì)胞因子，參與免疫反應(yīng)與急性期炎癥反應(yīng)[19]；TNF-α是TNF家族的促炎癥成員，在組織損傷、內(nèi)毒素刺激和感染時(shí)產(chǎn)生[20-22]。已有研究證實(shí)，減少促炎細(xì)胞因子如IL-1、IL-6、TNF-α的產(chǎn)生可以降低乳腺炎的影響[23]。本實(shí)驗(yàn)使用疏肝解郁湯后，組織與血清的炎癥因子含量降低，結(jié)合病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)組織的炎癥癥狀開始消失，乳腺炎得到好轉(zhuǎn)，高劑量效果最好，由此說明疏肝解郁湯可能通過減少炎癥因子產(chǎn)生起到抗炎效果。

MAPK信號通路廣泛參與機(jī)體的炎癥和應(yīng)激反應(yīng)，并提供關(guān)鍵的抗炎藥物靶點(diǎn)[24]。MAPKAPK2是MAPK通路的下游表達(dá)產(chǎn)物，參與調(diào)控炎癥因子如TNF-α、IL-6、IL-1β的表達(dá)，主要由p38調(diào)控激活[25]。本研究發(fā)現(xiàn)，LPS誘導(dǎo)的乳腺炎可以促進(jìn)p38與MAPKAPK2蛋白的磷酸化激活，使炎癥因子的分泌增多（P＜0.05）；給藥后p38與MAPKAPK2蛋白磷酸化水平降低（P＜0.05），說明疏肝解郁湯可能通過抑制p38/MAPKAPK2通路產(chǎn)生抗炎的作用。

本方對瓜蔞牛蒡湯進(jìn)行重新組方并添加了重樓，現(xiàn)代藥理研究表明，重樓皂苷具有消炎、鎮(zhèn)痛、止血、抗感染的效果[26]，加味后疏肝清胃通乳的功效更上一層樓。炒青皮、制香附、郁金、玫瑰花有疏肝理氣的效果，絲瓜絡(luò)有通乳消癰的療效，陳皮和胃散結(jié)，鹿角霜運(yùn)用其中，防止寒涼過重使腫塊難消，形成冷性僵塊。數(shù)藥合用共奏疏肝解郁，清熱消癰之效。

綜上所述，疏肝解郁湯具有抗炎消癰的效果，能減少LPS誘導(dǎo)的大鼠乳腺炎乳腺組織的炎癥反應(yīng)，降低血清與組織中的炎癥因子，作用機(jī)制可能是抑制p38/MAPKAPK2通路。