高瀾 李心璇 范欣雨

作者單位：310058 浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生系

當(dāng)前糖尿病在全球范圍內(nèi)已成為人類健康首要威脅之一。截至2021 年，全球大約有5.37 億20～79 歲成年人患有糖尿病，我國糖尿病患者已達(dá)1.409 億，居世界首位［1］。2 型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus，T2DM）是以β 細(xì)胞功能障礙、胰島素抵抗為特征的代謝性疾病［2］，慢性炎癥在驅(qū)動胰島素抵抗和2 型糖尿病發(fā)病中起關(guān)鍵作用［3］。近年來研究發(fā)現(xiàn)Th17 細(xì)胞、Treg 細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞因子與T2DM 發(fā)病有關(guān)［4］。Th17 細(xì)胞和Treg細(xì)胞是CD4+T 細(xì)胞亞群，在獲得性免疫中起重要作用。Th17 細(xì)胞促進(jìn)炎癥發(fā)展［5］，而Treg 細(xì)胞可抑制過強(qiáng)的免疫反應(yīng)［6］。研究表明，合適強(qiáng)度的運(yùn)動有利于改善Treg/Th17 比例失衡［7］?？紤]到高強(qiáng)度運(yùn)動對免疫功能可能的抑制作用，本研究選取中等強(qiáng)度運(yùn)動作為干預(yù)方式。目前運(yùn)動對糖尿病Treg、Th17 細(xì)胞失衡的影響尚未見報(bào)道。本研究擬通過檢測中等強(qiáng)度運(yùn)動對糖尿病小鼠血糖、體重、胸腺系數(shù)、脾系數(shù)、Treg/Th17 細(xì)胞比值的影響，探討運(yùn)動對糖尿病血糖的影響及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 db/db 小鼠是Leptin 受體點(diǎn)突變小鼠，出生后6 周出現(xiàn)明顯肥胖和高血糖癥狀，常用作2 型糖尿病研究模型［8］。野生型小鼠20 只［7 周齡，雄性，體重（21.63±2.72）g，血糖（8.34±1.71）mmol/L）］、db/db 小鼠16 只［7 周齡，雄性，體重（43.60±4.54）g，血糖（27.97±5.72）mmol/L）］，購自江蘇集萃藥康生物科技股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)器材及試劑 GA-3 型血糖儀及試紙，購自三諾生物傳感股份有限公司；cytoFLEX LX 流式細(xì)胞儀，購自Beckman Coulter 國際貿(mào)易（上海）有限公司、；ZH-PT 型動物實(shí)驗(yàn)跑臺；小鼠Th17 染色試劑盒、Treg細(xì)胞染色試劑盒，購自杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司；4%甲醛固定液、1%戊巴比妥鈉麻醉藥、PBS 灌流液。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 （1）動物分組：野生型小鼠與db/db 小鼠隨機(jī)分為四組，分別為野生型小鼠非運(yùn)動（WT）組10 只和野生型小鼠運(yùn)動（WTE）組10 只、db/db 小鼠非運(yùn)動（DM）組8 只、db/db 小鼠運(yùn)動（DME）組8 只。運(yùn)動干預(yù)期間，野生型小鼠運(yùn)動組、db/db 小鼠非運(yùn)動組、db/db 小鼠運(yùn)動組分別死亡2 只、3 只、1 只。（2）中等運(yùn)動強(qiáng)度的確定及運(yùn)動干預(yù)：以5 m/min 為初始跑步速度，每3 min 增加1 m/min。各組小鼠以相同速度奔跑至少10 min 且無法以更高速度奔跑，視作達(dá)到最大運(yùn)動速度。取最大運(yùn)動速度測量值60%，結(jié)合文獻(xiàn)及小鼠運(yùn)動實(shí)際情況，確定中等運(yùn)動強(qiáng)度為12 m/min，坡度0°，每次共運(yùn)動45 min（期間休息三次，每次5 min）。小鼠適應(yīng)跑臺一周后，進(jìn)行為期5 周，每周5次的正式運(yùn)動干預(yù)。（3）小鼠體重及餐后血糖測定：每周進(jìn)行一次小鼠體重及餐后血糖測定。按摩小鼠尾靜脈，75%乙醇消毒，待干后剪尾尖采血1 滴于血糖試紙上。使用GA-2 型快速血糖儀檢測末梢靜脈全血中葡萄糖濃度。（4）胸腺指數(shù)與脾系數(shù)測定：實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，稱取四組小鼠體重，皮下1%戊巴比妥麻醉后手術(shù)。打開胸腔，心尖插入導(dǎo)管針頭進(jìn)行灌流。取出并稱量胸腺及脾臟重量，計(jì)算胸腺系數(shù)及脾系數(shù)。

（5）脾組織單細(xì)胞懸液制備3 mL DMEM 培養(yǎng)基中加入3 mg 木瓜蛋白酶、3 mg 膠原酶、10U DNA 水解酶。脾組織剪碎后置于37℃恒溫消化15 min，吹打細(xì)胞使充分混合。重復(fù)上述步驟3 次，至無肉眼可見的組織塊。通過200 目尼龍網(wǎng)過濾后置于離心管中，2,000 rpm 離心5 min，棄上清液。加入含10%胎牛血清PBS 2 mL，2,000 rpm 離心5 min，棄上清液；加入1 mL PBS 培養(yǎng)液，吹打細(xì)胞至單細(xì)胞懸液。（6）Treg 細(xì)胞染色及百分比檢測：流式管中加入1～10×106脾細(xì)胞、5μL Anti-Mouse CD4，F(xiàn)ITC 和5μL Anti-Mouse CD25，APC。渦旋震蕩混勻，室溫避光孵育15 min。每管加入2 mL 1×FCM Lysing Solution 工作液，渦旋震蕩混勻，室溫避光孵育15 min。室溫300～400×g 離心5 min 棄上清。每管加入2 mL 1×Flow Cytometry Staining Buffer，渦旋震蕩混勻。室溫300～400×g 離心5 min，棄上清。每管加入1 mL Fixation/Permeabilization 工作液，渦旋震蕩混勻。室溫避光孵育30～60 min。每管加入2 mL 1×Permeabilization Buffer。室溫300～400×g 離心5 min，棄上清。100μL 1×Permeabilization Buffer 重懸沉淀。加入5μL Anti-Mouse Foxp3，震蕩混勻，室溫避光孵育至少30 min。每管加入2 mL 1×Permeabilization Buffer，室溫300～400×g離心5 min，棄上清。每管加入500 μL 1×Flow Cytometry Staining Buffer 重懸，使用流式細(xì)胞儀檢測Treg 細(xì)胞比例。（7）Th17 細(xì)胞染色及百分比檢測：流式管中加入100μL 細(xì)胞懸液，加入5μL Anti-Mouse CD3ε，F(xiàn)ITC和5μL Anti-Mouse CD4，PerCP-Cy5.5。震蕩混勻，室溫避光孵育15 min。每管加入100μL FIX ＆ PERM Medium A，震蕩混勻，室溫避光孵育15 min。每管加入2 mL預(yù)冷1× Flow Cytometry Staining Buffer，300×g 離心5 min，棄上清。每管加入100μL FIX ＆ PERM Medium B 和5 μlAnti-Mouse IL-17A，PE。震蕩混勻，室溫避光孵15 min。每管加入2 mL 1×Flow Cytometry Staining Buffer，300×g 離心5 min，棄上清。每管加入500μL 1×Flow Cytometry Staining Buffer 重懸，使用流式細(xì)胞儀檢測Th17 細(xì)胞。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用IBM SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料符合正態(tài)分布以（±s）表示，不符合正態(tài)分布以［M（P25，P75）］表示，多組數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，涉及兩個因素采用雙因素方差分析。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 中等強(qiáng)度運(yùn)動對db/db 小鼠體重與血糖的影響 db/db 小鼠各時(shí)間點(diǎn)餐后血糖均顯著高于野生型小鼠。與運(yùn)動干預(yù)前相比，運(yùn)動后野生型小鼠血糖（6.92±1.29 mmol/LVS. 7.25±0.77 mmol/L，P＞0.05）和體重（24.59±2.19 gVS. 22.51±2.48 g，P＞0.05）均無顯著變化，而db/db 小鼠血糖（17.37±3.50 mmol/LVS.28.71±3.69 mmol/L，P＜0.01）和體重（38.26±6.33 gVS.46.31±3.90 g，P＜0.01）均顯著下降。

2.2 中等強(qiáng)度運(yùn)動對胸腺系數(shù)的影響 db/db 小鼠非運(yùn)動組胸腺系數(shù)顯著小于野生型小鼠非運(yùn)動組（1.40±0.32VS. 1.92±0.30，P＜0.01）。與運(yùn)動干預(yù)前相比，運(yùn)動后野生型小鼠（1.93±0.40VS. 1.92±0.30，P＞0.05）、db/db 小鼠（1.55±0.45VS. 1.40±0.32，P＞0.05）胸腺系數(shù)均增高，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，見圖1。

圖1 胸腺系數(shù)

2.3 中等強(qiáng)度運(yùn)動對脾系數(shù)的影響 db/db 小鼠非運(yùn)動組脾系數(shù)顯著小于野生型小鼠非運(yùn)動組（1.89±0.41VS. 4.15±0.39，P＜0.01）。與運(yùn)動干預(yù)前相比，運(yùn)動后野生型小鼠（3.55±0.42VS. 4.15±0.39，P＞0.05）、db/db 小鼠（1.81±0.33VS. 1.89±0.41，P＞0.05）脾系數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖2。

圖2 脾系數(shù)

2.4 中等強(qiáng)度運(yùn)動對db/db 小鼠Treg/Th17 細(xì)胞比值的影響 與野生型小鼠非運(yùn)動組相比，db/db 小鼠非運(yùn)動組Treg 細(xì)胞（7.27%±1.59%VS. 8.44%±2.64%，P＞0.05）、Th17 細(xì)胞（2.19%±1.59%VS. 2.40%±1.50%，P＞0.05） 百 分 比、Treg/Th17 細(xì) 胞 比 值（2.99±1.34VS. 4.13±2.73，P＞0.05） 差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。運(yùn)動干預(yù)后，db/db 小鼠Th17 細(xì)胞百分比（1.48%±0.76%VS. 2.19%±1.59%，P＞0.05），Treg 細(xì)胞百分比（7.91%±0.76%VS.7.27%±1.59%，P＞0.05），db/db小鼠運(yùn)動組Treg/Th17 細(xì)胞比值與非運(yùn)動組小鼠比（4.79±2.29VS. 2.99±1.34，P＞0.05），差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖3。

圖3 Treg/Th17細(xì)胞比值

3 討論

2 型糖尿病是一種代謝性疾病，其病理機(jī)制包括胰島β 細(xì)胞功能障礙和胰島素抵抗［2］。慢性炎癥在驅(qū)動胰島素抵抗（insulin resistance，IR）和導(dǎo)致2 型糖尿病中起關(guān)鍵作用［3］。T 細(xì)胞調(diào)控在IR 的發(fā)病機(jī)制及其相關(guān)疾病之間存在聯(lián)系。Th17 和Treg 是CD4+T 細(xì)胞的亞群，負(fù)責(zé)獲得性免疫［9］，IL-6 通過與TGF-β 的協(xié)同誘導(dǎo)Th17 細(xì)胞分化［10］，Th17 細(xì)胞通過分泌IL-17A/F、IL-22、IL-21、TNF-α 和其他炎癥相關(guān)細(xì)胞因子而導(dǎo)致炎癥和許多自身免疫性疾病包括T2DM 的發(fā)生［11］；而Treg 細(xì)胞具有免疫負(fù)性調(diào)節(jié)功能，在維持免疫穩(wěn)態(tài)和耐受中發(fā)揮關(guān)鍵作用［12］。T2DM 患者的Th17 細(xì)胞百分比、IL-17 水平顯著升高，Treg 細(xì)胞百分比、Treg/Th17 比值顯著下降［13］，IL-17 降低糖耐量和胰島素敏感度［14］。Th17 細(xì)胞、Treg 細(xì)胞失衡及其對胰島β 細(xì)胞和相關(guān)組織的炎癥作用促使T2DM 的發(fā)生發(fā)展［15］。

合適強(qiáng)度的運(yùn)動有利于改善Treg/Th17 比例失衡，研究發(fā)現(xiàn)高強(qiáng)度游泳6 周后自身免疫性腦脊髓炎小鼠模型（EAE）中樞神經(jīng)系統(tǒng)Th1 和Th17 細(xì)胞減少，IFN-γ 和IL-17 降低，Treg 細(xì)胞增加，IL-10 和TGF-β升高。

本研究觀察了中等強(qiáng)度運(yùn)動對db/db 小鼠血糖、體重及免疫系統(tǒng)的影響，發(fā)現(xiàn)中等強(qiáng)度運(yùn)動可顯著降低db/db 小鼠餐后血糖；運(yùn)動后db/db 小鼠體重亦有顯著下降。本研究顯示，運(yùn)動干預(yù)前db/db 小鼠胸腺系數(shù)、脾指數(shù)均小于正常小鼠，與正常小鼠相比，db/db 小鼠Treg 細(xì)胞、Th17 細(xì)胞百分比降低，Treg/Th17 比值降低，出現(xiàn)Treg 與Th17 比例失調(diào)，提示T2DM 小鼠免疫系統(tǒng)異常。雖然沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但運(yùn)動干預(yù)后db/db 小鼠胸腺系數(shù)有上升趨勢；運(yùn)動干預(yù)后db/db 小鼠Treg/Th17比值有明顯增高、接近正常小鼠趨勢，而正常小鼠運(yùn)動干預(yù)前后Treg/Th17 比值無明顯變化研究結(jié)果提示中等強(qiáng)度運(yùn)動調(diào)節(jié)糖尿病小鼠Treg/Th17 比值失衡、抑制炎癥反應(yīng)可能是其預(yù)防、治療糖尿病的機(jī)理之一。