溫晉鋒 戴澤 鄧凱莉 楊冬雪 楊萍 唐春蘭 周玉平*

非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）已經(jīng)成為全球主要的慢性肝?。?］。NAFLD 為一組疾病，具體包括非酒精性肝脂肪變、非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）、肝硬化和肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）［2］。目前對于NAFLD 還沒有批準的治療藥物［3］，而對于NASF、HCC 的治療更是缺乏有效手段［4］。本課題組前期研究證實，基于浙江道地藥材為主的驗方“浙八味煎劑”對NAFLD 及相關的肝纖維化具有明顯的干預效應［5-6］，并獲得了國家發(fā)明專利授權［7］，但其機制尚待進一步研究。孤兒核受體TR4（Testicular orphan nuclear receptor 4，TR4）與糖脂代謝紊亂及胰島素抵抗密切相關［8］，基因敲除小鼠模型研究證實TR4 與肝臟脂肪代謝有關［9］，但尚未進一步深入研究其在脂肪肝中的作用及機制。本研究擬通過小鼠模型，探究TR4 蛋白在非酒精性脂肪性肝病動物模型中的表達變化及“浙八味煎劑”的干預作用，旨在進一步探尋NAFLD 的干預靶標，并探究中藥驗方“浙八味煎劑”對NAFLD的療效和機制，為研發(fā)安全有效的中藥新藥進行實驗研究。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 6～8 周齡SPF 級C57BL/6J ♂小鼠，體重（24±3）g，共32 只，購自江蘇集萃藥康生物科技有限公司，生產(chǎn)許可證號SCXK（蘇）2018-0008。動物實驗在寧波大學實驗動物中心進行，動物使用許可證號SYXK（浙）2019-0005，本研究經(jīng)寧波大學實驗動物倫理委員會批準。

1.2 藥物與試劑 蛋氨酸-膽堿缺乏飼料（MCD，批號TP3005G）及對照飼料（MCS，批號TP3005Gs）購自南通特洛菲飼料科技有限公司；甘油三酯（TG，批號A110-1-1）、谷丙轉氨酶（ALT，批號C009-2-1）、谷草轉氨酶（AST，批號C010-2-1）、總膽紅素（TBIL，批號C019-1-1）均購自南京建成生物工程研究所。TNF-α（F2163-A）、IL-1β（F2040-A）、IL-6（F2132-A）購自上?？婆d。BCA 蛋白定量試劑盒（BCA Protein Assay Kit，批號E-BC-K318-M，Elabscience）；油紅O 染色液（批號G1261）購自北京索萊寶科技有限公司；Rabbit Anti TR4（PP-H0107B-00）購自美國RnD Systems 公司；Mouse Monoclonal Anti-GAPDH（批號HC301-01）、辣根酶標記山羊抗鼠IgG（H+L）（批號HS201-01）、辣根酶標記山羊抗兔IgG（H+L）（批號HS101-01），購自北京全式金生物技術有限公司。

1.3 方法 （1）動物分組和造模：適應性喂養(yǎng)5 d 后，實驗小鼠隨機分成4 組即正常組（N）、模型組（M）、浙八味煎劑高劑量組（H）、低劑量組（L），每組8 只。除正常組外的小鼠均進行造模，采用蛋氨酸-膽堿缺乏（MCD）飲食誘導+每周一次腹腔注射10% CCl4-橄欖油溶液，劑量為2 mL/kg，共6 周。正常組小鼠僅給予MCS 飼料常規(guī)喂養(yǎng)。（2）浙八味煎劑制備及給藥方法：按本課題組建立的方法［7］，浙八味煎劑成人一日劑量：浙貝母12 g、溫郁金12 g、白術15 g、杭白菊12 g、白芍12 g、杭麥冬12 g、玄參12 g、延胡索9 g，生藥量共96 g。取兩劑生藥，常規(guī)水煎兩次混合，旋蒸發(fā)至濃度為0.7、0.35 g/mL 兩種濃度。按70 kg 成人與小鼠體表面積換算法，小鼠每日每千克體重的高、低劑量分別為14 g 和7 g 生藥量，每日灌胃兩種濃度的藥液為20 mL/kg，自造模第3 周首日開始，每日灌胃一次，共4 周。（3）標本留取方法：6 周末各組動物禁食12 h，麻醉后打開腹腔，下腔靜脈采血，切取肝臟，選1 塊置于10%中性福爾馬林溶液中固定，用于石蠟包埋；另取一葉切成方形，OTC 包埋后液氮速凍用于制備冰凍切片；其余液氮速凍后-70℃保存。（4）生化指標和炎癥因子檢測：炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6 均采用ELISA 試劑盒，操作步驟根據(jù)說明書進行。血清、TG 含量檢測及ALT、AST、TBil 活性檢測均采用生化試劑盒進行。（5）組織病理學觀察：制作肝組織石蠟切片，行HE 染色、Masson 染色觀察組織炎癥和膠原增生情況。制作肝組織冰凍切片，油紅O 染色觀察肝組織脂肪沉積情況。（6）Western blott：提取組織蛋白，根據(jù)BCA 試劑盒測定蛋白濃度。蛋白變性，上樣，進行凝膠電泳2 h，后轉PVDF 膜2 h，孵育TR4 一抗，4℃過夜；孵育二抗溶液，室溫放置60 min，化學發(fā)光法檢測條帶。軟件分析抗體條帶灰度值，再進行半定量統(tǒng)計。（7）免疫組化：石蠟切片經(jīng)烤片、脫蠟、水化、抗原修復、消除內源性過氧化物酶、通透預處理后，每張玻片滴加足夠量的稀釋好的一抗TR4（1 ∶100），放入濕盒中，4℃孵育過夜，取出4℃孵育過夜?jié)窈?，室溫靜置45 min，PBS 浸洗玻片3 次，每次5 min，滴加HRP（m）（1 ∶100），37℃孵育30 min，PBS 充分淋洗。DAB 顯色5～10 min，在顯微鏡下掌握染色程度，PBS 或自來水沖洗1 min 后蘇木精復染3 min，鹽酸酒精分化，返藍，自來水沖洗1 min，脫水、透明、封片、鏡檢。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用GraphPad 9.0 統(tǒng)計軟件。計量資料符合正態(tài)分布以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用LSD 檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 浙八味煎劑對肝組織病理的影響 HE 染色顯示，模型組肝組織可見大量脂肪變性，胞質內充滿脂滴空泡，匯管區(qū)炎癥細胞浸潤嚴重，浙八味煎劑干預后脂肪變性和炎癥反應程度都明顯減輕，其中高劑量組效果更好，見圖1。Masson 染色顯示，模型組肝組織膠原沉積明顯增加，竇周可見膠原纖維形成細絲狀甚至粗索狀分布，肝小葉結構紊亂，局部可見纖維組織增生；浙八味煎劑高劑量組干預后膠原沉積明顯減少，見圖2。

圖1 浙八味煎劑對模型小鼠肝臟纖維化的影響。A. Masson染色（×100倍）膠原纖維呈藍色；N：正常組，M：模型組，H：浙八味煎劑高劑量組，L：浙八味煎劑低劑量組。B. 膠原容積分數(shù)，與正常組相比，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001。

圖2 浙八味煎劑對模型小鼠肝功能和總膽固醇水平的影響。高脂飲食誘導的脂肪肝小鼠、藥物處理后的脂肪肝小鼠與正常組的血清TG含量（A）、肝組織TG含量（B）、血清AST（C），血清ALT（D）以及Tbil（E）的比較；N：正常組，M：模型組，H：浙八味煎劑高劑量組，L：浙八味煎劑低劑量組。注：TG，甘油三酯；ALT谷丙轉氨酶；AST谷草轉氨酶；TBil總膽紅素。與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

2.2 浙八味煎劑對肝組織脂質代謝和肝功能的影響 與正常組相比，模型組肝臟中TG 含量、ALT 與AST 活性和TBil 含量顯著升高（P＜0.01），表明模型小鼠出現(xiàn)了脂代謝紊亂和肝臟脂質蓄積，并造成了肝臟損傷；小鼠經(jīng)浙八味煎劑連續(xù)灌胃給藥4 周后，肝組織TG 含量、ALT 與AST 活性和TBil 含量降低，與模型組相比具有差異（P＜0.05 或P＜0.01），提示了浙八味煎劑可以逆轉模型小鼠的肝細胞脂肪變性與損傷，見圖3。

圖3 浙八味煎劑對小鼠肝臟炎癥因子的影響。高脂飲食誘導的脂肪肝小鼠、藥物處理后的脂肪肝小鼠與對照組的IL-1β表達（A）、IL-6 表達（B）、TNF-α表達（C）的比較；N：對照組，M：模型組，H：浙八味煎劑高劑量組，L：浙八味煎劑低劑量組。注：與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

2.3 浙八味煎劑對肝組織炎癥反應的影響 通過ELISA 檢測模型小鼠肝組織炎癥因子的表達水平，與正常組相比，模型小鼠肝組織中內IL-1β 表達上調（P＜0.05），浙八味煎劑高劑量組降低模型組IL-1β 的表達（P＜0.05）。IL-6 和TNF-α 的表達在本實驗中未見正常組和模型組有差異，但與模型組相比，浙八味煎劑高劑量組能降低兩個炎癥因子的表達水平，具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05 或P＜0.01），見圖4。

圖4 免疫組化檢測浙八味煎劑對肝組織TR4蛋白表達的影響。N：正常組，M：模型組，H：浙八味高劑量組，L：浙八味低劑量組

2.4 浙八味煎劑對肝組織TR4 蛋白表達的影響 通過Western blot 和免疫組化觀察了模型小鼠肝組織TR4 蛋白表達變化及浙八味煎劑的干預作用，與正常組相比，模型組肝組織中TR4 蛋白的表達明顯增多，陽性表達主要分布在肝細胞的細胞核及細胞漿（P＜0.01）。浙八味煎劑干預能降低TR4 蛋白的表達，與模型組相比具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖5。

圖5 蛋白免疫印跡檢測浙八味煎劑對肝組織TR4蛋白表達的影響。N：正常組，M：模型組，H：浙八味高劑量組，L：浙八味低劑量組。注：與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

3 討論

近年研究顯示，孤兒核受體TR4 與糖脂代謝紊亂及胰島素抵抗密切相關，但尚未進一步深入研究其在脂肪肝中的作用及機制。KIM 等［10］通過TR4 基因敲除小鼠體內實驗及原代肝細胞體外實驗發(fā)現(xiàn)，TR4 介導肝臟硬脂酰輔酶A 去飽和酶1（SCD1）基因表達，降低胰島素的敏感度，而敲除TR4 可以抑制SCD1 表達，并可以減少脂肪沉積及增加胰島素的敏感度。LIU 等［11］研究還發(fā)現(xiàn)，空腹和胰高血糖素介導的信號cAMP/PKA 和C/EBP 信號通路可以激活TR4 導致糖異生。此外，TR4在促進脂質代謝中也發(fā)揮了重要作用。YOSHIZAWA 研究發(fā)現(xiàn)，肝臟組蛋白去乙?；窼IRT7 基因敲除小鼠，由于TR4 表達水平的降低，表現(xiàn)出對高脂飲食誘導的肝臟脂肪變、肥胖、糖耐量受損的抵抗作用［12］。KIM等［13］通過基因敲除小鼠研究證實，TR4 調節(jié)ApoE 基因表達，TR4 的缺失下調肝細胞中載脂蛋白E/C-I 和C-II 基因表達。

綜上所述，TR4 能導致糖脂代謝紊亂，增加胰島素抵抗，促進甘油三酯在肝臟堆積，但既往的研究主要集中在代謝綜合征領域。由于胰島素抵抗及脂代謝紊亂在NASH 發(fā)病機制的關鍵作用，筆者推測TR4 蛋白可能是NAFLD 的發(fā)病機制之一。本研究通過建立NAFLD 疾病模型，研究發(fā)現(xiàn)在NAFLD 動物模型中，肝組織TR4 蛋白的表達較正常組明顯升高。浙八味煎劑能明顯減少脂肪在肝內沉積，逆轉TR4 蛋白的升高，減輕肝組織的炎癥反應。提示TR4 可能作為浙八味煎劑的效應靶點，從而緩解了非酒精性脂肪性肝病的發(fā)展。本研究不足之處為此次研究僅是對TR4 在NASF 模型中表達變化及中藥復方干預作用的一個初步觀察，推測TR4 可能的一個有效的干預靶標，如果需要更明確這一論點，還需要使用TR4-/-小鼠模型進行驗證。