洪 冕，黃佳敏，陳冬梅,2，謝書宇*

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)國家獸藥殘留基準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室(HZAU)，武漢 430070；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)國家獸藥安全評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)室(HZAU)，武漢 430070)

細(xì)菌感染對(duì)動(dòng)物健康造成了嚴(yán)重威脅，抗生素因具有高效抗菌特性而成為細(xì)菌性疾病治療的首選方案。自1928年亞歷山大·弗萊明發(fā)現(xiàn)青霉素以來，諸多抗生素被發(fā)現(xiàn)并用于細(xì)菌性疾病治療。20世紀(jì)30—60年代被稱為抗生素“黃金時(shí)代”，這個(gè)時(shí)期涌現(xiàn)出大批抗生素，但在之后幾十年新發(fā)現(xiàn)的抗生素種類大幅減少[1]。同時(shí)，由于抗生素的過度使用，耐藥細(xì)菌不斷出現(xiàn)，這使得細(xì)菌性疾病的發(fā)病率及死亡率不斷攀升。治療成本的增加和畜禽生產(chǎn)力的下降，給養(yǎng)殖業(yè)造成了高額經(jīng)濟(jì)損失。2015年，世界衛(wèi)生組織(WHO)宣布將抗微生物藥物耐藥性(AMR)列為全球十大健康威脅之一[2]。

納米技術(shù)，即對(duì)納米材料的研究及運(yùn)用。納米材料具有獨(dú)特的物理、化學(xué)和生物特性，可通過破壞細(xì)胞壁及細(xì)胞膜、抑制外排泵、抑制滅活酶以及阻礙生物被膜形成等機(jī)制來對(duì)抗耐藥細(xì)菌，提高抗菌藥物療效。將納米技術(shù)運(yùn)用于抗菌藥物研發(fā)，可為對(duì)抗耐藥菌提供新途徑。本文將對(duì)納米技術(shù)的發(fā)展歷程、對(duì)抗耐藥細(xì)菌策略以及對(duì)抗耐藥性的機(jī)制進(jìn)行總結(jié)，希望能為解決細(xì)菌耐藥性問題提供有效應(yīng)對(duì)方案。

1 納米技術(shù)發(fā)展歷程

1959年，現(xiàn)代納米技術(shù)之父Richard Feynman在加州理工學(xué)院舉辦的美國物理學(xué)會(huì)年會(huì)上進(jìn)行了名為“物質(zhì)底層大有空間”的演講，并描述出一個(gè)利用微型元件構(gòu)建分子水平儀器的愿景[3]。這是對(duì)納米概念的首次引入。1981年，掃描隧道顯微鏡(STM)的發(fā)明使得人們第一次觀察并操縱單個(gè)原子，這為促進(jìn)納米領(lǐng)域研究發(fā)展提供了可視化的直接證據(jù)[4]。隨后，原子力顯微鏡(AFM)、掃描探針顯微鏡(SPM)等儀器的相繼發(fā)明更是推動(dòng)納米觀測及加工研究的不斷深入。

“納米醫(yī)學(xué)”概念源于納米技術(shù)與醫(yī)學(xué)的融合。納米材料具有小尺度、電化學(xué)等性質(zhì)并易于表面修飾，可通過改變?nèi)芙舛取⑻岣甙邢蛐?、緩釋、控釋等方式提高藥物治療效果。而隨著耐藥菌的不斷出現(xiàn)，納米材料也開始被廣泛應(yīng)用于細(xì)菌性疾病的治療。最開始，人們將抗生素裝載于納米載藥系統(tǒng)中以提高其抗菌效果，常見納米載藥系統(tǒng)包括固體脂質(zhì)納米粒、脂質(zhì)體、聚合物納米粒、金屬納米粒、膠束聚合物、樹狀大分子、囊泡和量子點(diǎn)等[5]。然而，隨著越來越多抗菌納米材料被發(fā)現(xiàn)，利用納米材料制備不含抗生素的抗菌劑成為熱點(diǎn)。

1980年，Boman等第一次發(fā)現(xiàn)抗菌肽(AMP)天蠶素。AMP既可與納米載體結(jié)合，也可通過自組裝形成有序納米結(jié)構(gòu)，其由于獨(dú)特抗菌機(jī)制、廣譜抗菌活性、低藥物殘留以及易于合成與修飾而有望作為抗生素替代品[6]。在1985—2004年，研究人員又陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了3種新型碳納米材料——碳納米管、石墨烯、富勒烯及其相關(guān)的納米復(fù)合材料亦展現(xiàn)出了強(qiáng)大的抗菌性能[7]。而作為納米材料的重要分支，金屬納米材料也可直接作為抗菌劑使用，其抗菌性能多取決于大小、形狀及組成[8]。迄今為止，已有金、銀、銅、硫化銅、氧化鐵(III)、氧化鋅、氧化鎂、氧化銅、氧化鈣、二氧化鈦和氧化鎘等金屬或含金屬的納米材料被證明具有高效抗菌活性[9]。

2 納米技術(shù)對(duì)抗細(xì)菌耐藥性的策略

2.1 負(fù)載抗菌藥物

以納米材料作為載體，可在保護(hù)藥物不被降解的同時(shí)促進(jìn)藥物進(jìn)入細(xì)菌。這增強(qiáng)了藥物與細(xì)菌間的相互作用，亦減少了藥物用量，規(guī)避耐藥細(xì)菌產(chǎn)生。例如，將替考拉寧裝載于接枝金黃色葡萄球菌特異性配體的聚乳酸-羥基乙酸共聚物納米粒內(nèi)，其對(duì)耐替考拉寧金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度(MIC)降低98%[10]。載有萬古霉素的納米囊泡因高比表面積而能更好分布和吸附至細(xì)菌表面，并可高效清除細(xì)菌生物被膜，其持續(xù)抗菌時(shí)間遠(yuǎn)超萬古霉素，對(duì)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)的MIC亦比萬古霉素低94%[11]。

2.2 自身直接抗菌

部分納米材料自身便具備較強(qiáng)的抗菌能力，可代替抗菌藥物用于治療耐藥細(xì)菌的感染。例如，4,6-二氨基-2-嘧啶硫醇修飾的金納米粒(AuNPs)可抑制大腸桿菌和銅綠假單胞菌中多重耐藥菌株的增殖，其既可以選擇性螯合細(xì)胞膜上Mg2+以破壞膜結(jié)構(gòu)并泄漏胞內(nèi)物質(zhì)，又可以同核糖體和染色體結(jié)合以干擾DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄以及蛋白質(zhì)合成[12]。Gurunathan等[13]制備的銀納米(AgNPs)通過增強(qiáng)氧化應(yīng)激反應(yīng)并抑制抗氧化水平來對(duì)抗多重耐藥細(xì)菌，其對(duì)產(chǎn)黑色素假單胞菌、化膿性假單胞菌的MIC僅為0.8和1.0 μg·mL-1，而對(duì)生物被膜的抑制活性高達(dá)90%以上。

2.3 光介導(dǎo)抗菌

2.3.1 光熱抗菌 具有光敏活性的納米材料能吸收近紅外光(NIR)并轉(zhuǎn)換為熱量，其可導(dǎo)致細(xì)胞膜破裂、蛋白質(zhì)變性以及細(xì)菌消融[14]。例如，表面修飾有苯硼酸糖聚合物的硫化銅納米粒在NIR照射下產(chǎn)生高熱，高溫抑制了細(xì)菌酶活性、細(xì)胞膜通透性以及蛋白質(zhì)和核酸的合成[15]。試驗(yàn)結(jié)果表明，其對(duì)耐藥銅綠假單胞菌的抗菌效率超過82%，同時(shí)可清除85%以上的生物被膜[15]。Yang等[16]將具有光熱特性的聚吡咯整合至陰離子囊泡上，該種納米材料在NIR照射10 min后可使小鼠組織溫度升高近20 ℃。體外試驗(yàn)證明，其在NIR照射下顯著提升對(duì)鼠傷寒沙門菌耐藥菌株的生長抑制效果并有效阻止生物被膜的形成[16]。

2.3.2 光動(dòng)力抗菌 光動(dòng)力抗菌療法是通過納米材料實(shí)現(xiàn)無載藥抗菌的另一種策略。其機(jī)理多基于光敏劑的光化學(xué)反應(yīng)，即光照條件誘導(dǎo)納米制劑生成大量ROS，進(jìn)而損害細(xì)菌細(xì)胞膜、蛋白質(zhì)以及胞內(nèi)DNA[17]。例如，結(jié)合有二氫卟吩e6的納米粒在光照下產(chǎn)生大量ROS，可清除95%的耐藥銅綠假單胞菌及其70%的生物被膜[18]。有機(jī)磷光納米粒能與基態(tài)氧進(jìn)行有效能量轉(zhuǎn)移，因此具備快速生產(chǎn)單線態(tài)氧的能力，其在光照5 min后便可殺死100%的MRSA[19]。

2.4 納米酶輔助殺傷

納米酶具備氧化酶、過氧化物酶和脫氧核糖核酸酶等天然酶性質(zhì)，可促進(jìn)氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)菌損傷[17]。多孔AgPd雙金屬合金納米籠具有氧化酶活性，可通過催化生成ROS來殺傷細(xì)菌，其對(duì)細(xì)菌的MIC在誘導(dǎo)傳代12次以后并未增加，而將其用作表面涂層添加劑時(shí)亦可有效抑制生物被膜形成[20]。pH響應(yīng)性發(fā)光納米酶則是兼具氧化酶和過氧化物酶雙重活性，酸性條件下，其酶活性被激活以催化生成ROS，在pH=5.5的環(huán)境中可抑制99.2%的大腸桿菌、96.5%的金黃色葡萄球菌以及98.4%的MRSA生長[21]。

3 納米技術(shù)對(duì)抗耐藥細(xì)菌機(jī)制

3.1 損傷細(xì)胞壁及細(xì)胞膜

耐藥菌通過降低細(xì)胞膜通透性限制抗生素進(jìn)入。由于細(xì)菌表面攜帶的負(fù)電荷要多于機(jī)體細(xì)胞，因此帶正電荷的納米材料可優(yōu)先同細(xì)菌大量結(jié)合，進(jìn)而影響細(xì)胞壁和細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致胞內(nèi)容物流失[22]。例如，質(zhì)子化伯胺修飾的低分子量聚合物通過自組裝形成具有高正電荷密度的有機(jī)納米粒，其導(dǎo)致耐氨芐西林大腸桿菌表面呈現(xiàn)破碎、倒塌及殘缺狀態(tài)[23]。由兩種季銨鹽前體合成左氧氟沙星碳點(diǎn)可吸附于細(xì)菌表面并誘導(dǎo)細(xì)胞膜穿孔、破裂，其對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的MIC在耐藥誘導(dǎo)38代時(shí)仍未發(fā)生改變，而鹽酸左氧氟沙星對(duì)這兩種菌的MIC分別在耐藥誘導(dǎo)10代和16代后增加[24]。

3.2 抑制外排泵

耐藥細(xì)菌中外排泵表達(dá)通常會(huì)上調(diào)，以便主動(dòng)將抗菌藥物轉(zhuǎn)送至細(xì)菌外[22]。而納米材料可與細(xì)菌大量結(jié)合，其在目標(biāo)部位的高濃度能抑制外排泵的主動(dòng)清除作用。例如，將四環(huán)素和鹽酸林可霉素封裝于聚丙烯酸納米凝膠載體中，用陽離子聚電解質(zhì)進(jìn)行功能化修飾后可實(shí)現(xiàn)其在細(xì)胞壁上的累積并局部釋放藥物，其對(duì)四環(huán)素以及林可霉素高度耐藥菌的MIC比游離抗生素低87.5%[25]。多元醇包被的CuO、ZnO和CuZn納米粒可用作外排泵抑制劑，與抗生素聯(lián)用時(shí)表現(xiàn)出較好的協(xié)同抗菌作用。細(xì)菌外排試驗(yàn)表明，其抑制了76.7%的溴化乙錠流出多重耐藥銅綠假單胞菌[26]。

3.3 抑制滅活酶

通過產(chǎn)生滅活酶來水解或修飾抗菌藥物是另一種細(xì)菌耐藥機(jī)制，常見滅活酶包括β-內(nèi)酰胺酶、酯酶、氨基糖苷鈍化酶、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶、核苷轉(zhuǎn)移酶等[27]。如今，酶促失活已成為新一代抗生素類藥物實(shí)際應(yīng)用主要難題。某些納米材料恰好可抑制滅活酶活性，從而保護(hù)抗菌藥物。例如，多功能金屬螯合膦酸鹽/FeO磁性納米粒能抑制66%的β-內(nèi)酰胺酶活性，用其負(fù)載頭孢氨芐后可將頭孢氨芐的MIC降低75%[28]。一種由苯并惡唑和葡聚糖構(gòu)成的納米制劑對(duì)β-內(nèi)酰胺酶的抑制率可達(dá)77.5%，當(dāng)其負(fù)載頭孢西丁鈉(CFS)時(shí)對(duì)耐CFS大腸桿菌的MIC僅為游離CFS的6.2%，可更快治愈耐藥細(xì)菌感染傷口[29]。

3.4 多重靶標(biāo)

細(xì)菌上通常存在可被抗菌藥物識(shí)別的特定靶標(biāo)，耐藥基因的表達(dá)可導(dǎo)致靶標(biāo)數(shù)量減少或被化學(xué)修飾，從而干擾細(xì)菌與藥物結(jié)合，賦予細(xì)菌耐藥性。納米材料可識(shí)別并結(jié)合多個(gè)靶標(biāo)，因此其誘導(dǎo)耐藥菌出現(xiàn)的可能性小，并且面對(duì)部分靶標(biāo)突變時(shí)亦能發(fā)揮較強(qiáng)抗菌作用。例如，氫氧化鑭與氧化石墨烯構(gòu)成的納米復(fù)合材料(La@GO)具有磷脂去磷酸化、脂質(zhì)過氧化和肽聚糖破壞等胞外多重靶標(biāo)殺傷機(jī)制。當(dāng)大腸桿菌連續(xù)30 d暴露于亞MIC濃度的La@GO中時(shí)并不會(huì)出現(xiàn)繼發(fā)性耐藥，而諾氟沙星則導(dǎo)致細(xì)菌的耐藥性增加了64倍[30]。銀可通過靶向糖酵解、氧化磷酸戊糖途徑、氧化應(yīng)激等多個(gè)基本通路殺死金黃色葡萄球菌。Wang等[31]將金黃色葡萄球菌連續(xù)暴露于AgNPs 16次未能誘導(dǎo)MIC增加，并且AgNPs可與多種抗生素產(chǎn)生協(xié)同抗菌作用，這意味著其能使耐藥細(xì)菌對(duì)抗生素重新敏感。

3.5 產(chǎn)生活性氧(ROS)

ROS是細(xì)胞氧化代謝副產(chǎn)物，包括超氧陰離子(O2-)、單態(tài)氧(1O2)、過氧化物(O22-)等，它們影響著細(xì)胞的分化、信號(hào)傳導(dǎo)、存活以及死亡。納米材料可自身產(chǎn)生ROS、誘導(dǎo)細(xì)胞器產(chǎn)生ROS以及同具有氧化還原活性的生物分子(如NADPH氧化酶)作用以氧化生成ROS[22]。由于細(xì)菌耐藥機(jī)制并未針對(duì)ROS，因此過量ROS對(duì)耐藥細(xì)菌仍能產(chǎn)生較好的抗菌作用。ROS一方面與蛋白質(zhì)硫醇反應(yīng)，使游離蛋白質(zhì)及細(xì)胞壁受體失活；另一方面可氧化dCTP和dGTP池導(dǎo)致DNA雙鏈斷裂，使堿基誤入DNA，造成DNA損傷[22,32]。此外，ROS還可預(yù)防生物被膜形成并破壞已建立的生物被膜[33]。二硫化鉬納米片是一種光催化劑，其在太陽光照射下可產(chǎn)生大量ROS以殺死99.9%的耐藥細(xì)菌[34]。CuInS/ZnS量子點(diǎn)通過吸收NIR以產(chǎn)生ROS，其在光照10 min后可殺死82%的耐藥銅綠假單胞菌，并有效抑制生物被膜形成[35]。

3.6 損傷細(xì)胞成分

除生成ROS以外，納米材料還可直接損傷蛋白質(zhì)、DNA等胞內(nèi)成分，進(jìn)而干擾耐藥細(xì)菌同質(zhì)狀態(tài)、胞內(nèi)信號(hào)通路以及細(xì)胞代謝。其常見損傷機(jī)制包括改變細(xì)菌基因表達(dá)、造成DNA損傷以及干擾蛋白質(zhì)合成[22]。血小板膜偽裝納米?？蓽p弱MRSA內(nèi)部F型ATP合酶活性，ATP水平的降低使得細(xì)菌因代謝能量不足而死亡，其負(fù)載萬古霉素后對(duì)MRSA的MIC是萬古霉素的1/4[36]?；預(yù)gNPs可中斷細(xì)菌ATP合成并誘導(dǎo)三羧酸循環(huán)等代謝途徑失調(diào)，研究表明，其增強(qiáng)了耐藥大腸桿菌對(duì)諾氟沙星的敏感性，使諾氟沙星治療劑量降低90%[37]。

3.7 對(duì)抗細(xì)菌生物被膜

基于適應(yīng)性和自然耐受性，細(xì)菌從自由生活的生命形式(即浮游生物)轉(zhuǎn)變?yōu)楣讨亩鄬哟稳郝?即生物被膜)[38]。多糖、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)以及胞外DNA等胞外聚合物構(gòu)成生物被膜基質(zhì)，可隔離或延緩吸收抗菌藥物[39]。同時(shí)，生物被膜中的“休眠細(xì)胞”代謝活性低、生長速度慢，因此對(duì)抗菌藥物存在一定抗性[38]。此外，生物被膜由于內(nèi)部結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和細(xì)菌緊密鄰近性而成為水平基因轉(zhuǎn)移的理想生態(tài)位，膜內(nèi)各細(xì)菌之間相交換耐藥基因，促進(jìn)耐藥細(xì)菌產(chǎn)生[40]。多物種生物被膜的形成將導(dǎo)致抗菌藥物最低生物被膜殺菌濃度(MBBC)增加。納米材料可增加抗菌藥物在生物被膜上的滲透性，也可借助光熱轉(zhuǎn)換等物理或生化作用破壞生物被膜完整性[41]。例如，Makabenta等[42]制備的聚合物納米粒可有效穿越生物被膜，其對(duì)雙物種生物被膜的MBBC無顯著增加，同時(shí)以劑量依賴性方式根除細(xì)菌并減少生物被膜生物量。He等[43]制備的高效光熱納米粒具有較強(qiáng)光熱轉(zhuǎn)化能力，在光照條件下可使生物被膜基質(zhì)中的蛋白質(zhì)、多糖等黏性成分失活，體外試驗(yàn)表明其可根除75%的金黃色葡萄球菌生物被膜。

4 小 結(jié)

通過改變細(xì)胞膜通透性、表達(dá)滅活酶以及形成生物被膜等方式，細(xì)菌對(duì)抗菌藥物的抵抗力不斷增強(qiáng)。耐藥細(xì)菌的出現(xiàn)降低了傳統(tǒng)藥物小分子的臨床治療效果，而加大治療劑量又可能導(dǎo)致機(jī)體損傷與藥物殘留。因此，尋找新方法以對(duì)抗細(xì)菌耐藥性顯得尤為迫切。納米材料通過破壞細(xì)胞壁及細(xì)胞膜、抑制外排泵、抑制滅活酶等多種方式來對(duì)抗耐藥細(xì)菌。其具備廣闊設(shè)計(jì)空間，不僅粒徑、電位、形態(tài)可調(diào)，還能進(jìn)行多種表面修飾。目前，利用納米材料制備抗菌劑已成為熱門。隨著納米技術(shù)的發(fā)展，具有多重抗菌機(jī)制的多功能復(fù)合納米不斷開發(fā)，將在抵抗細(xì)菌耐藥性領(lǐng)域具有更廣闊的發(fā)展前景。不過，盡管抗菌性能優(yōu)異，納米材料在臨床應(yīng)用方面仍存在諸多挑戰(zhàn)。首先，多數(shù)抗菌納米材料通過靜電相互作用與表面帶負(fù)電荷的細(xì)胞結(jié)合，難以特異性區(qū)分細(xì)菌與機(jī)體細(xì)胞。人們需尋找能與細(xì)菌結(jié)合的特異性配體，以增強(qiáng)納米材料對(duì)細(xì)菌的靶向識(shí)別與結(jié)合能力。其次，對(duì)機(jī)體的潛在毒性是納米材料臨床應(yīng)用的主要難題之一。一些納米材料可刺激樹突狀細(xì)胞以及其他免疫細(xì)胞釋放活性氧等介質(zhì)，從而誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生超敏反應(yīng)、自身免疫性疾病和炎癥反應(yīng)[44]。因此，在確保納米制劑具有良好殺菌作用的同時(shí)也必須對(duì)其進(jìn)行細(xì)胞毒性評(píng)估，并通過改變大小、形狀、表面電荷、制備方法以及表面修飾等方式來降低毒性作用。相信隨著納米技術(shù)的不斷拓寬與深入研究，其在對(duì)抗耐藥細(xì)菌方面的應(yīng)用必將得到進(jìn)一步發(fā)展。