劉賀娟，史晨曦，王 靜，王美樂(lè)，王棟涵，魏戰(zhàn)勇，尹素改*

(1.河南中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)院,鄭州 450046； 2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，鄭州 450046)

冠狀病毒(Coronaviruses，CoVs)是廣泛存在于自然界的一大類人畜共患病毒，冠狀病毒感染可造成人和其他動(dòng)物呼吸道、消化道和神經(jīng)系統(tǒng)的功能發(fā)生障礙。CoVs屬于巢狀病毒目、冠狀病毒科、冠狀病毒亞科的單股正鏈RNA病毒，冠狀病毒亞科又被國(guó)際病毒學(xué)分類委員會(huì)分為α、β、γ和δ4個(gè)屬[1]。人類和其它脊椎動(dòng)物是冠狀病毒的主要宿主，如2003年爆發(fā)的嚴(yán)重急性呼吸綜合征病毒(SARS-CoV)，2012年爆發(fā)的中東呼吸綜合征病毒(MERS-CoV)，均導(dǎo)致嚴(yán)重的呼吸道疾病甚至死亡[2]。2019年在武漢爆發(fā)并隨之席卷全球的新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)，是目前已知的第7種可感染人類的冠狀病毒，截至2021年11月1日下午5：04，在全球范圍內(nèi)有246 594 191例COVID-19確診病例，已造成近500萬(wàn)人死亡，給全球人類健康帶來(lái)巨大威脅[3]。除了感染人以外，冠狀病毒還可以感染家畜、家禽、鼠以及鳥類和蝙蝠等多種動(dòng)物[4]。其中以豬的感染較為普遍，如豬呼吸道冠狀病毒(PRCV)、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)、豬腸道α 冠狀病毒(PEAV)、豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、豬丁型冠狀病毒(PDCoV)等[5]。其中PDCoV是2014年在豬群中新發(fā)現(xiàn)的一種冠狀病毒，主要引起7日齡以內(nèi)的仔豬發(fā)生嚴(yán)重腹瀉，仔豬感染PDCoV死亡率高達(dá)30%，給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[6]。據(jù)報(bào)道PDCoV還存在跨種傳播的特性，可人工感染雞、牛、鼠等，此外，從海地3名兒童血漿樣品中也檢測(cè)到突變后的PDCoV，表明PDCoV可能存在人畜共患的風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)人類健康構(gòu)成潛在威脅[7]。目前尚無(wú)PDCoV商品化疫苗或特異性藥物上市。

近年來(lái)，中醫(yī)藥治療冠狀病毒取得了一定療效，研究發(fā)現(xiàn)，中藥小分子如黃酮類、生物堿類、多糖類、蒽醌類等是中藥的關(guān)鍵活性成分，均能夠促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、增強(qiáng)機(jī)體免疫、減輕病毒感染[8]。因此，應(yīng)用中獸醫(yī)理論可以加速抗PDCoV天然藥物的挖掘、研究和開發(fā)。黃芩為唇形科植物黃芩的干燥根，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，性味苦寒，有“清熱燥濕，瀉火解毒，止血，安胎”之功效，廣泛應(yīng)用于臨床，常與其他中藥配伍用于治療呼吸道感染、急性菌痢、病毒性肝炎、過(guò)敏性疾病和婦科疾病等。黃芩素是中藥黃芩的主要活性成分，也是含量最高的黃酮類化合物之一。黃芩素被國(guó)家藥典委員會(huì)正式命名為百可利(baicalein，BAI)，別名黃芩苷元、黃芩黃素[9]。近年來(lái)有研究表明，黃芩素在抗病毒方面作用突出，既可以抗RNA病毒也可以抗DNA病毒，其顯著的抗病毒作用近年來(lái)逐漸成為研究熱點(diǎn)。黃芩素可誘導(dǎo)艾滋病病毒整合酶的構(gòu)象變化，抑制逆轉(zhuǎn)錄酶活性從而影響病毒復(fù)制[10]；通過(guò)阻止病毒的吸附，直接殺傷病毒以及抑制病毒復(fù)制等途徑發(fā)揮抗登革熱病毒的作用[11-12]；能夠劑量依賴地抑制流感病毒活性并減輕流感病毒所致的炎癥反應(yīng)等[13]；還具有調(diào)節(jié)細(xì)胞因子，增強(qiáng)白細(xì)胞發(fā)揮先天抗病毒免疫的能力從而發(fā)揮抗水皰性口炎病毒的作用[14]。黃芩素可通過(guò)抑制病毒DNA合成，發(fā)揮抗人巨細(xì)胞病毒的作用；可以降低日本腦炎病毒的感染能力[15-16]。黃芩素對(duì)多種病毒都表現(xiàn)出良好的抗病毒活性，且安全性高，這種低毒高效的特性使其在抗病毒藥物開發(fā)領(lǐng)域有著巨大優(yōu)勢(shì)。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)在“疾病-靶點(diǎn)-藥物”多層次網(wǎng)絡(luò)基礎(chǔ)上，從整體上構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)靶標(biāo)，在藥物和疾病之間建立源于疾病特異性網(wǎng)絡(luò)的分子聯(lián)系，綜合分析中藥的組成成分，預(yù)測(cè)藥物治療疾病的靶點(diǎn)，破譯藥物或中藥配方的治療效果機(jī)制及其可能的毒性和未知藥理活性[17]，減少不必要的摸索性科研研究，為藥理作用及其機(jī)制研究開拓了新的思路，也為臨床科研試驗(yàn)提供了新的理論支撐[18]。本研究使用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，從分子水平探索黃芩素抗PDCoV感染的機(jī)制。通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)搜索收集黃芩素的靶標(biāo)，構(gòu)建“藥物-靶標(biāo)-疾病”網(wǎng)絡(luò)，確定網(wǎng)絡(luò)中的重要核心基因，并對(duì)核心基因進(jìn)行功能富集分析，找到黃芩素與PDCoV之間的關(guān)聯(lián)，為黃芩素作為潛在的抗PDCoV感染藥物的開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 黃芩素結(jié)構(gòu)檢索及靶點(diǎn)獲取

1.1.1 黃芩素結(jié)構(gòu)檢索 檢索Pubchem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)有機(jī)小分子生物活性數(shù)據(jù)庫(kù)獲得黃芩素(Baicalein，CAS：491-67-8)的3D結(jié)構(gòu)、PubChem-CID和SMILES文件。

1.1.2 黃芩素靶點(diǎn)獲取 利用Pharmmapper(http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/)、SEA Search Server(http://sea.bkslab.org/)、TCMSP(http://tcmspw.com/tcmsp.php)、Swiss Target Prediction(http://www.swisstarget-prediction.ch/)和STITCH在線數(shù)據(jù)庫(kù)(http://stitch.embl.de/)檢索黃芩素的作用靶點(diǎn)，將上述數(shù)據(jù)庫(kù)檢索得到的靶點(diǎn)進(jìn)行去重整理后，通過(guò)Uniprot(http://www.uniprot.org/)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)將上述靶點(diǎn)蛋白轉(zhuǎn)化為整理為Gene Symbol，構(gòu)建黃芩素靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)。

1.2 黃芩素-靶點(diǎn)作用圖的構(gòu)建

采用Cytoscape 3.8.0軟件構(gòu)建“黃芩素-黃芩素靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，并運(yùn)用Cytoscape的插件Network Analyze進(jìn)行分析。

1.3 PDCoV感染相關(guān)靶點(diǎn)分析

PDCoV HNZK-02(基因序列號(hào)MH708123)以MOI=0.001的接毒量感染LLC-PK細(xì)胞(豬腎上皮細(xì)胞)，分別于感染后1、6和18 h后收取蛋白樣品送至杭州景杰生物公司進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，篩選出有1.2倍差異表達(dá)的蛋白(P<0.05)，通過(guò)Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)將靶點(diǎn)蛋白轉(zhuǎn)化為整理為Gene Symbol，構(gòu)建PDCoV感染過(guò)程中的疾病靶點(diǎn)。

1.4 黃芩素抗PDCoV感染靶點(diǎn)篩選

采用Draw Venny Diagram(http:// bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)在線程序?qū)DCoV與黃芩素(BAI)靶基因取交集獲得黃芩素與疾病的共同靶點(diǎn)，此集合為黃芩素治療PDCoV感染的可能靶點(diǎn)。

1.5 PPI網(wǎng)絡(luò)繪制及蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析

將上述交集得到的75個(gè)共同靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING(https://string-db.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)，構(gòu)建PPI核心靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，設(shè)置置信度>0.400，其他參數(shù)保持默認(rèn)值。將PPI網(wǎng)絡(luò)互作關(guān)系導(dǎo)入Cytoscape軟件中進(jìn)行可視化分析，再利用CytoHubba以及MOCED插件對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，按基因的核心程度進(jìn)行排序篩選出關(guān)鍵的子網(wǎng)絡(luò)和top10的核心靶點(diǎn)。

1.6 GO和KEGG分析

將黃芩素靶點(diǎn)與PDCoV相關(guān)靶點(diǎn)的交集靶點(diǎn)導(dǎo)入Metascape進(jìn)行GO功能富集和KEGG通路富集分析(https://metascape.org/gp/index.html#/main/step1)。選擇Custome Analysis，P-value<0.01,其他選擇系統(tǒng)默認(rèn)設(shè)置，按照排序在Gene List Summary下分別選擇GO功能分析(包括GO Biological Process(BP)：生物過(guò)程；GO Cellular Component(CC)：細(xì)胞組成；GO Molecular Function(MF)：分子功能)以及KEGG Pathway。下載富集分析文件，GO僅展示前10條具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異的結(jié)果；通過(guò)設(shè)置count值及In Term Inlist值，KEGG展示前20條具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異的結(jié)果。利用微生信(http://www.bioinformatics.com.cn/)在線做圖將Metascape分析出的結(jié)果制作成高級(jí)氣泡圖并導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0構(gòu)建“藥物-疾病-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖。

1.7 體外驗(yàn)證試驗(yàn)

1.7.1 藥物、細(xì)胞、毒株 黃芩素購(gòu)自成都曼思特生物科技有限公司(貨號(hào)：A0018，CAS:491-67-9，HPLC≥98%)，溶解于DMSO，母液濃度為20 mg·mL-1，分裝避光保存在-20 ℃冰箱。試驗(yàn)所用豬睪丸細(xì)胞(ST)購(gòu)自中國(guó)獸監(jiān)察所并由河南省動(dòng)物性食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室傳代保存。本試驗(yàn)所用毒株為本實(shí)驗(yàn)室分離保存的PDCoV毒株 HNZK-02(GenBank登錄號(hào)：MH708123)，P33代，病毒滴度為108.75TCID50·mL-1。ST細(xì)胞用含10%胎牛血清(批號(hào) 04-001-1A，BI)的DMEM高糖培養(yǎng)基(批號(hào)：PYG0003，博士德)培養(yǎng)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)試劑盒購(gòu)自南京諾唯贊公司(批號(hào)：Q341-02)。

1.7.2 試驗(yàn)過(guò)程 ST細(xì)胞復(fù)蘇后經(jīng)傳代3次用于本試驗(yàn)，細(xì)胞接種于12孔板約24 h后，將細(xì)胞分為正常細(xì)胞對(duì)照組(Con)、陽(yáng)性感染組(PDCoV)、黃芩素組(PDCoV+BAI)、以及黃芩素對(duì)照組(BAI)，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)。PDCoV組和PDCoV+BAI組用PDCoV(MOI=1)感染ST細(xì)胞，于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱吸附1 h后棄液，用D-Hanks洗2遍，Con組和PDCoV組加入無(wú)血清DMEM，PDCoV+BAI、BAI組加入黃芩素終濃度為50 μg·mL-1的無(wú)血清DMEM，培養(yǎng)18 h后收集細(xì)胞，提取樣品中的總RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用實(shí)時(shí)熒光定量(qRT-PCR)方法檢測(cè)細(xì)胞中PI3K、AKT和NF-κBmRNA的相對(duì)表達(dá)水平(以β-actin作為內(nèi)參基因)，根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室建立的PDCoV絕對(duì)熒光定量PCR方法計(jì)算PDCoV S基因組拷貝數(shù)。試驗(yàn)所用引物序列見(jiàn)表1。

表1 qRT-PCR引物序列

2 結(jié) 果

2.1 黃芩素和疾病靶點(diǎn)基因的收集和整理

輸入關(guān)鍵詞：baicalein，通過(guò)Pharmmapper得到化合物預(yù)測(cè)靶點(diǎn)89個(gè)；通過(guò)SEA Search Server獲得化合物預(yù)測(cè)靶點(diǎn)13個(gè)；通過(guò)SwissTarget Prediction獲得化合物的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)104個(gè)；通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)獲得化合物靶點(diǎn)37個(gè)；通過(guò)Pubchem獲得化合物相關(guān)靶點(diǎn)88個(gè)；通過(guò)STITCH化學(xué)物質(zhì)相互作用數(shù)據(jù)庫(kù)獲取與黃芩素相關(guān)靶點(diǎn)12個(gè)；去重整理后得到黃芩素的有效作用靶點(diǎn)共計(jì)268個(gè)。疾病靶點(diǎn)的獲?。簩?duì)不同時(shí)間點(diǎn)樣品蛋白組學(xué)結(jié)果整理分析，共得到1 771個(gè)下調(diào)靶點(diǎn)，1 997個(gè)上調(diào)靶點(diǎn)。

2.2 黃芩素與黃芩素靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將得到的268個(gè)黃芩素靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape得到圖1。該網(wǎng)絡(luò)由269個(gè)節(jié)點(diǎn)(黃芩素和268個(gè)黃芩素靶點(diǎn))、268條邊組成。外環(huán)紫色凹四邊形代表黃芩素靶點(diǎn)，中間黃色菱形代表黃芩素。

圖1 黃芩素-黃芩素靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

2.3 黃芩素主要靶點(diǎn)-PDCoV共同靶點(diǎn)

運(yùn)用Draw Venny Diagram在線程序?qū)⑹占狞S芩素主要靶基因和PDCoV感染相關(guān)靶基因集取交集后共獲得75個(gè)黃芩素治療PDCoV感染的潛在靶點(diǎn)(圖2)，左側(cè)紫色圓圈為黃芩素有效成分靶點(diǎn)，右側(cè)為PDCoV感染相關(guān)靶點(diǎn)，中間交集為黃芩素抗PDCoV感染的潛在靶點(diǎn)。

圖2 黃芩素-抗PDCoV感染韋恩圖

2.4 黃芩素抗PDCoV感染PPI網(wǎng)絡(luò)繪制及蛋白網(wǎng)絡(luò)互作分析

將單體與疾病共同靶點(diǎn)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫(kù)，線條的粗細(xì)程度反映蛋白間互作關(guān)系的強(qiáng)弱，隱藏網(wǎng)絡(luò)中斷開連接的節(jié)點(diǎn)，得到黃芩素抗PDCoV感染PPI網(wǎng)絡(luò)圖(圖3)，該P(yáng)PI靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)由75個(gè)節(jié)點(diǎn)和480條邊組成，平均節(jié)點(diǎn)度為12.8，平均局部聚類系數(shù)為0.554，預(yù)期的邊數(shù)為分223，PPI富集P值<1.0×10-16。將PPI所得結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape并利用MCODE插件可視化分析并尋找關(guān)鍵蛋白和3個(gè)主要子網(wǎng)絡(luò)(圖4)。其中紅色代表上調(diào)基因，綠色代表下調(diào)基因，cluster 1得分15.444，cluster 2得分6.364，cluster 3得分5，越靠近圓環(huán)中心，節(jié)點(diǎn)越大，相關(guān)性越大，表示與其他靶點(diǎn)聯(lián)系越緊密。表2展示了3個(gè)主要子網(wǎng)絡(luò)的節(jié)點(diǎn)、邊數(shù)以及靶蛋白。利用Cytoscape的插件Cytohubba根據(jù)蛋白的degree對(duì)網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué)分析，選取節(jié)點(diǎn)top10的關(guān)鍵蛋白(表3)，黃芩素抗PDCOV的關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白為AKT1、HSP90AA1、SRC、EGFR、CASP3、MAPK1、STAT3、FN1、RHOA、MAPK3，圖5展示了關(guān)鍵靶蛋白的互作網(wǎng)絡(luò)圖，顏色越深代表在網(wǎng)絡(luò)中越重要。

圖5 關(guān)鍵靶蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖

表2 黃芩素-PDCoV共同靶點(diǎn)的Cluster數(shù)據(jù)

表3 黃芩素抗PDCoV感染的關(guān)鍵靶蛋白

圖3 靶蛋白互作PPI網(wǎng)絡(luò)圖

圖4 靶蛋白互作及主要子網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 GO富集分析結(jié)果

將黃芩素可能對(duì)PDCoV感染發(fā)揮作用的核心基因靶點(diǎn)導(dǎo)入Metascape進(jìn)行基因本體(GO)功能富集分析(圖6)以及KEGG通路富集分析(圖7)。GO富集分析發(fā)現(xiàn)，黃芩素抗PDCoV感染的靶點(diǎn)基因影響的生物過(guò)程有941個(gè)，生物組分有47個(gè)，分子功能有90個(gè)，按P值大小將排在前10的結(jié)果輸入到微生信平臺(tái)制作富集BP，CC，MF三合一柱狀圖(圖6)。橫軸為黃芩素抗PDCoV感染可能通過(guò)的生物過(guò)程、生物組分和分子功能的GO名稱，縱軸為富基基因的靶點(diǎn)數(shù)量。由圖可知，絲氨酸修飾、JNK信號(hào)級(jí)聯(lián)、糖代謝和單羧酸代謝過(guò)程是黃芩素參與抗PDCoV感染中的重要生物過(guò)程；細(xì)胞周期蛋白依賴型的蛋白激酶、細(xì)胞膜筏、線粒體膜和紡錘體等是黃芩素參與抗PDCoV感染中的重要的生物組分；磷酸轉(zhuǎn)移酶活性、蛋白激酶活性、蛋白結(jié)構(gòu)域結(jié)合活性、MAPK激酶活性等是黃芩素參與抗PDCoV感染中的重要分子功能。

圖6 黃芩素-抗PDCoV感染GO富集分析部分結(jié)果(前10)

KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，共篩選得到277條信號(hào)通路(P<0.01)，整理分析篩選得到的數(shù)據(jù)，通過(guò)設(shè)置Count值及In Term Inlist，選擇通路上蛋白富集多，排名靠前的信號(hào)通路，利用微生信平臺(tái)，展示前20條具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異的結(jié)果(圖7)。黃芩素-抗PDCoV感染的核心靶點(diǎn)基因主要參與癌癥、肝炎、PI3K-Akt通路、EB病毒感染、缺氧誘導(dǎo)因子1信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路等，提示黃芩素治療PDCoV感染可能是通過(guò)這些通路發(fā)揮作用的。

圖7 KEGG分析結(jié)果氣泡圖(前20)

2.6 黃芩素-PDCoV感染-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)分析

通過(guò)KEGG分析結(jié)果，將通路和靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape，獲得了“黃芩素-PDCoV感染-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖(圖8)，共有53個(gè)節(jié)點(diǎn)和735條邊，外環(huán)菱形代表KEGG富集得到的前20個(gè)參與黃芩素抗PDCoV感染的信號(hào)通路，中環(huán)圓形代表黃芩素抗PDCoV感染的關(guān)鍵靶蛋白，中心多邊形代表PDCoV感染，其上方的箭頭代表黃芩素。

圖8 “黃芩素-PDCoV感染-通路”網(wǎng)絡(luò)圖

2.7 體外驗(yàn)證黃芩素對(duì)PI3K-AKT及其下游基因表達(dá)的影響

首先在ST細(xì)胞上檢測(cè)黃芩素對(duì)PDCoV復(fù)制的影響，結(jié)果如圖9所示，與PDCoV組相比，黃芩素處理極顯著降低了PDCoV的基因組拷貝數(shù)(P<0.001)。隨后檢測(cè)了黃芩素在抑制PDCoV感染程中對(duì)PI3K-AKT信號(hào)通路及其下游基因表達(dá)的影響(圖9)。試驗(yàn)結(jié)果表明，與Con組相比，PDCoV組PI3K、AKT和NF-κB的表達(dá)量極顯著升高(P<0.001)；與PDCoV組相比，黃芩素處理顯著降低了PI3K(P<0.001)、AKT(P<0.05)和NF-κB(P<0.001)的mRNA表達(dá)量(P<0.001)。

*P<0.05表示差異顯著，**P<0.01、***P<0.001表示差異極顯著。

3 討 論

近年來(lái)，冠狀病毒對(duì)人和動(dòng)物的威脅日益加劇，給全球公共衛(wèi)生安全帶來(lái)巨大威脅。冠狀病毒存在跨種傳播，能夠感染鳥類、老鼠、蝙蝠等其他野生動(dòng)物，并通過(guò)在中間宿主家畜和家禽中的傳播感染人類[19]。冠狀病毒感染仔豬會(huì)導(dǎo)致病毒性腹瀉，哺乳仔豬死亡率可高達(dá)90%，并可感染不同年齡段的豬，具有高致病性、高陽(yáng)性率、高死亡率的特點(diǎn)，危害大，更應(yīng)引起重視[20-21]。目前，尚未研制出抗PDCoV的疫苗和特異性藥物，天然產(chǎn)物是開發(fā)抗病毒藥物的一個(gè)方向，應(yīng)用好中華傳統(tǒng)醫(yī)藥對(duì)開發(fā)抗病毒新藥研究十分重要。黃芩是中藥組方中最常用藥物之一，通過(guò)分子對(duì)接發(fā)現(xiàn)黃芩中的重要活性物質(zhì)黃芩素與SARS-CoV-2 3CL水解酶結(jié)合性強(qiáng)，體外試驗(yàn)表明黃芩素可有效抑制SARS-CoV-2 3CL水解酶的活性，其顯著的抗病毒作用近年來(lái)逐漸成為研究熱點(diǎn)，有望開發(fā)成廣譜抗冠狀病毒藥物[22-24]。黃芩素是從中藥黃芩中提取的黃酮類化合物，含量較高，具有抗病毒、抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗菌、抗腫瘤等多種功效[25]。黃芩素可能通過(guò)抑制ATP合成酶活性抑制大腸桿菌感染，且可以通過(guò)阻止病毒黏附，抑制細(xì)胞因子的產(chǎn)生等多種方式抑制病毒感染[26-27]。但這都不足以揭示其復(fù)雜的抗病毒機(jī)制，因而可以借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)針對(duì)性地深入探索其抗病毒感染機(jī)制。

本研究采用了TCMSP、Pharmmapper、Pubchem、STITCH和Swiss Targer Prediction數(shù)據(jù)庫(kù)等數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行分析，這些數(shù)據(jù)庫(kù)相對(duì)權(quán)威也更全面。以PharmMapper為例，該數(shù)據(jù)庫(kù)整合了TargetBank、DrugBank、BindingDB和PDTD中的所有目標(biāo)中提取的大型內(nèi)部藥效團(tuán)數(shù)據(jù)庫(kù)支持，尋找所有靶標(biāo)的最佳映射姿勢(shì)，是一個(gè)相對(duì)權(quán)威的藥物靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)。TCMSP以系統(tǒng)藥理學(xué)為基礎(chǔ)，囊括《中國(guó)藥典》，提供了豐富的活性成分、作用靶點(diǎn)以及相關(guān)疾病資料且被廣泛認(rèn)可引用。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)為研究藥物作用機(jī)制和新藥開發(fā)提供了新思路，但同時(shí)也面臨挑戰(zhàn)，比如中醫(yī)藥數(shù)據(jù)積累不足，數(shù)據(jù)的質(zhì)量受限于生物技術(shù)的發(fā)展等[17,43]。為了使藥物靶點(diǎn)更全面準(zhǔn)確，本研究分別在各個(gè)具有權(quán)威性的數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行了查詢，隨后對(duì)查詢結(jié)果進(jìn)行去重處理，因此，藥物靶點(diǎn)是較為全面準(zhǔn)確的。通過(guò)挖掘多個(gè)化合物靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)和本實(shí)驗(yàn)室前期蛋白質(zhì)組學(xué)的數(shù)據(jù)(數(shù)據(jù)尚未發(fā)表)，發(fā)現(xiàn)了75個(gè)黃芩素抗PDCoV感染的潛在靶點(diǎn)。通過(guò)PPI網(wǎng)絡(luò)尋找這其中的關(guān)鍵子網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)了包含36個(gè)關(guān)鍵蛋白的3個(gè)子網(wǎng)絡(luò)，其中包括調(diào)控炎癥反應(yīng)的STAT3、NFB1、MAPK1等，與細(xì)胞凋亡相關(guān)的CASP3、MAPK8、MAPK14、SRC、AKT1等，與細(xì)胞自噬有關(guān)的AKT1、MAPK3、MAPK8、IGF1R等，與細(xì)胞周期有關(guān)的CDK1、CDK2、CDK4、CDK6、SRC、AKT1等，以及參與蛋白質(zhì)正確折疊的HSPA8、HSP90AA1等，說(shuō)明黃芩素抗PDCoV感染的作用機(jī)制除了調(diào)控炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡與細(xì)胞自噬，還參與調(diào)控了細(xì)胞周期和蛋白質(zhì)折疊等其它機(jī)制。

GO富集分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在分子功能方面，磷酸轉(zhuǎn)移酶的活性、蛋白激酶的結(jié)合能力和特定蛋白結(jié)構(gòu)域的結(jié)合能力富集因子最多，結(jié)合生物過(guò)程中富集因子最高的絲氨酸修飾分析，提示一些受磷酸化影響的信號(hào)通路可能在黃芩素抗PDCoV感染中發(fā)揮重要的功能。在細(xì)胞組成中，富集分析表明，細(xì)胞周期蛋白依賴型的蛋白激酶可能在黃芩素抗PDCoV感染的過(guò)程中起著重要作用。研究顯示，在多種豬冠狀病毒感染中，病毒感染可以調(diào)控細(xì)胞周期。如豬傳染性胃腸炎病毒可誘導(dǎo)細(xì)胞阻滯在S期和G2/M期，且經(jīng)UV滅活的病毒不能阻滯細(xì)胞周期，表明細(xì)胞周期阻滯依賴于病毒感染[28]；另有研究顯示，豬流行性腹瀉病毒感染細(xì)胞后，細(xì)胞周期阻滯在G2/M期[29]，表明細(xì)胞周期在病毒感染過(guò)程中起著重要的作用。黃芩素通過(guò)下調(diào)細(xì)胞周期蛋白依賴性的蛋白激酶，將HeLa細(xì)胞周期阻斷在G0/G1期，從而抑制細(xì)胞遷移和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來(lái)治療宮頸癌[30]。本研究顯示，黃芩素可能是通過(guò)調(diào)控細(xì)胞周期蛋白依賴型的蛋白激酶的表達(dá)，調(diào)節(jié)PDCoV感染引起的細(xì)胞周期阻滯，從而發(fā)揮抗病毒感染的作用。

KEGG富集分析結(jié)果篩選得到277條信號(hào)通路(P<0.01)，鑒于富集通路較多，在數(shù)據(jù)分析中通過(guò)設(shè)置Count值，以及InTerm Inlist值，選擇通路上富集蛋白多且排名靠前的前20條信號(hào)通路。黃芩素抗PDCoV感染的關(guān)鍵靶點(diǎn)主要富集在癌癥通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、Ras信號(hào)通路和MAPK信號(hào)通路。其中富集因子最大的是癌癥通路，主要受上述討論的細(xì)胞周期影響及上調(diào)的差異蛋白AKT1、EGFR等表達(dá)量的影響。目前對(duì)PDCoV致病機(jī)制研究較少，天然免疫應(yīng)答可能起重要作用[31]，研究證實(shí)PDCoV感染會(huì)引起炎癥、自噬、凋亡等[32-33]。PI3K/AKT信號(hào)通路、Ras信號(hào)通路和MAPK信號(hào)通路均是由磷酸化修飾級(jí)聯(lián)介導(dǎo)的信號(hào)通路，這一現(xiàn)象與GO分析得到的結(jié)果相一致。PI3K-Akt信號(hào)通路作用很廣，參與調(diào)控多種細(xì)胞進(jìn)程，如細(xì)胞凋亡、細(xì)胞自噬、蛋白合成、細(xì)胞分化、DNA修復(fù)等。PI3K-Akt信號(hào)通路被激活后，會(huì)磷酸化凋亡調(diào)控蛋白caspase9來(lái)使其失活，從而產(chǎn)生抗凋亡作用[34]；除此以外，PI3K-Akt信號(hào)通路還能通過(guò)抑制線粒體凋亡蛋白的釋放發(fā)揮抗凋亡功能[35]。凌云等[36]的研究證明，黃芩素可以通過(guò)抑制Akt/mTOR信號(hào)通路增加乳腺癌細(xì)胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比例，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞自噬。在胃癌細(xì)胞系上的研究表明，黃芩素也可以通過(guò)PI3K-Akt信號(hào)通路來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞自噬，從而發(fā)揮抗癌作用[37]。本研究的研究結(jié)果提示，黃芩素抗PDCoV感染的機(jī)制可能與PI3K/AKT信號(hào)通路調(diào)控的細(xì)胞自噬和炎癥有關(guān)。與PI3K-Akt信號(hào)通路一樣，Ras信號(hào)通路和MAPK信號(hào)通路的作用也十分廣泛，參與調(diào)控細(xì)胞分化、自噬、凋亡、增殖和炎癥反應(yīng)，且這三個(gè)通路之間可以形成網(wǎng)絡(luò)相互影響。孫曉林[38]研究證明，綿羊肺腺瘤病毒的囊膜蛋白可以激活A(yù)kt和MAPK信號(hào)通路，調(diào)控Beclin1的表達(dá)從而抑制細(xì)胞自噬。在流感病毒H1N1感染過(guò)程中，研究發(fā)現(xiàn)有MAPK信號(hào)通路的參與，且應(yīng)用疏清顆?？梢酝ㄟ^(guò)調(diào)控MAPK信號(hào)通路來(lái)干預(yù)病毒感染[39]。王慧蓮等[40]的研究表明，在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞中，漢黃芩素可以激活MAPK信號(hào)通路來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。通過(guò)抑制Ras信號(hào)通路，黃芩素能夠?qū)⒓?xì)胞周期阻滯在G1期，從而誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞凋亡，該研究提示，在宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中，Ras信號(hào)通路參與調(diào)控細(xì)胞周期，而應(yīng)用黃芩素可以抑制癌癥的發(fā)生和發(fā)展[41]。隨著數(shù)據(jù)庫(kù)不斷的更新、計(jì)算機(jī)算法的精進(jìn)以及生物技術(shù)的發(fā)展，多學(xué)科交叉協(xié)作將為研究人員提供更可靠的信息。鑒于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)揭示藥物對(duì)疾病的作用機(jī)制仍存在局限性，比如忽略了部分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)的更新、算法的精進(jìn)、各數(shù)據(jù)庫(kù)間的對(duì)比等，研究還需要結(jié)合臨床和科學(xué)驗(yàn)證[42-43]。結(jié)合PDCoV的可能致病機(jī)制和病理生理過(guò)程，因此，本研究選擇了PI3K-AKT通過(guò)體外細(xì)胞試驗(yàn)初步驗(yàn)證了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的預(yù)測(cè)結(jié)果，為進(jìn)一步的深入研究奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

綜上所述，本研究表明黃芩素主要作用于AKT1、HSP90AA1、SRC、EGFR、CASP3、MAPK1等關(guān)鍵靶蛋白，并通過(guò)調(diào)節(jié)PI3K-Akt、Ras和MAPK等多個(gè)信號(hào)通路，從而發(fā)揮抗PDCoV感染的作用。本文借助生物信息學(xué)相關(guān)技術(shù)和方法，通過(guò)對(duì)關(guān)鍵靶點(diǎn)、生物過(guò)程和信號(hào)通路的分析，全面系統(tǒng)地研究了黃芩素抗PDCoV感染的潛在作用機(jī)制，揭示了黃芩素是通過(guò)多靶點(diǎn)、多通路、多機(jī)制來(lái)抑制PDCoV的感染。雖然本研究只是針對(duì)黃芩素抑制PDCoV感染作用機(jī)制進(jìn)行了預(yù)測(cè)，還存在局限性。但是，本研究將中醫(yī)藥理論與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)聯(lián)合應(yīng)用，進(jìn)行科學(xué)的預(yù)測(cè)，減少了不必要的摸索性試驗(yàn)研究，大大節(jié)省了時(shí)間、科研經(jīng)費(fèi)，為抗豬丁型冠狀病毒天然藥物的挖掘、研究和開發(fā)，提供了新的理論支撐，同時(shí)也為其他動(dòng)物類疾病的研究提供思路與方向。