左 揚(yáng)，李 田，胡秀花，宋志強(qiáng)，孫城濤，吳聰明，王少林*

(1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京 100193； 2.內(nèi)蒙古伊利實(shí)業(yè)集團(tuán)股份有限公司，呼和浩特 010080)

奶牛乳房炎是奶牛養(yǎng)殖中的常見疾病，不僅危害奶牛本身健康，增加病牛的淘汰率，還會(huì)在影響牛奶品質(zhì)及引發(fā)食品衛(wèi)生安全問題的基礎(chǔ)上造成生產(chǎn)經(jīng)濟(jì)的巨大損失。根據(jù)美國國家乳房炎委員會(huì)(National Mastitis Council, NMC)報(bào)告表明，由奶牛乳房炎造成的全球經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)390億美元[1]；而我國據(jù)統(tǒng)計(jì)約有1 400萬頭奶牛，僅臨床型奶牛乳房炎的每年發(fā)生率可高達(dá)60%，平均年發(fā)生率為33.4%，每年造成的經(jīng)濟(jì)損失超過6億元人民幣[2]。

病原微生物是引起奶牛乳房炎最重要的原因，包括細(xì)菌、真菌、支原體、病毒等，細(xì)菌占95%以上，其中，金黃色葡萄球菌是造成奶牛養(yǎng)殖行業(yè)經(jīng)濟(jì)損失的關(guān)鍵因素，肺炎克雷伯菌引起的奶牛乳房炎與其他細(xì)菌性乳房炎相比更難控制[3]。根據(jù)病原菌的感染方式與傳播途徑，可以將引起奶牛乳房炎的病原菌又分為傳染性病原菌和環(huán)境性病原菌，其中，以金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、乳房鏈球菌、無乳鏈球菌等分離率最高(表1)。

表1 中國各地區(qū)常見奶牛乳房炎病原種類

β-內(nèi)酰胺類抗生素是包括奶牛乳房炎在內(nèi)的各種抗感染治療的首選抗生素，隨著近幾十年的廣泛應(yīng)用，病原菌經(jīng)基因突變產(chǎn)生了超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(extended-spectrum beta-lactamases，ESBL)[17]，并且已有研究表明ESBL的出現(xiàn)是目前耐藥菌對(duì)廣譜β-內(nèi)酰胺類抗生素產(chǎn)生抗性的重要原因。編碼ESBL的基因具有多種類型，目前，全球大約發(fā)現(xiàn)300種，主要分為3種：blaCTX-M、blaSHV和blaTEM[18]，編碼ESBL的基因可以在不同菌種的細(xì)菌之間通過克隆或基因的水平轉(zhuǎn)移傳播[19]。迄今為止，有多種病原菌都被報(bào)道攜帶編碼該酶的基因。就乳房炎病原菌來說，國外包括日本、英國、法國、德國、印度以及突尼斯等國家報(bào)道的產(chǎn)ESBL乳房炎病原菌常見腸桿菌科細(xì)菌，基因類型以CTX-M型為主[20-25]。而國內(nèi)近幾年報(bào)道的產(chǎn)ESBL乳房炎病原菌以大腸桿菌、肺炎克雷伯菌最為常見[26-27]，此外還包括鮑曼不動(dòng)桿菌、陰溝腸桿菌、蠟樣芽胞桿菌、銅綠假單胞菌等，攜帶的ESBL耐藥基因以TEM、CTX-M、OXA型多見[28-29]。這些產(chǎn)ESBL病原菌導(dǎo)致了奶牛乳房炎的高發(fā)生率和低治愈率，極大地限制了奶牛乳房炎的臨床用藥，增加了奶牛養(yǎng)殖業(yè)的經(jīng)濟(jì)損失。

現(xiàn)今的奶牛養(yǎng)殖模式使大數(shù)量的奶牛暴露在一個(gè)共同的養(yǎng)殖環(huán)境下，若養(yǎng)殖環(huán)境中存在較多產(chǎn)ESBL耐藥菌，在奶牛躺臥、擠奶操作不當(dāng)?shù)惹闆r下使產(chǎn)ESBL耐藥菌進(jìn)入奶牛乳區(qū)成為引起奶牛乳房炎的病原菌，增加環(huán)境耐藥菌引起奶牛乳房炎的危險(xiǎn)性[30]。并且產(chǎn)ESBL耐藥菌在進(jìn)入牛奶后經(jīng)藥物作用會(huì)產(chǎn)生內(nèi)源性β-內(nèi)酰胺酶。自2009年起，衛(wèi)生部《全國打擊違法添加非食用物質(zhì)和濫用食品添加劑專項(xiàng)整治抽檢工作指導(dǎo)原則和方案》的通知(食品整治辦〔2009〕29號(hào))中明文規(guī)定：“添加β-內(nèi)酰胺酶(拮抗劑)等非食品用物質(zhì)屬違法行為”[31]。不同學(xué)者對(duì)北京[32]、江蘇淮安[33]、新疆巴州[34]等地區(qū)的市售牛乳或生鮮牛乳進(jìn)行了內(nèi)酰胺酶殘留檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)每個(gè)地區(qū)的檢測(cè)樣品均有陽性檢出，且樣品來源廣泛。但是常規(guī)檢測(cè)方法無法區(qū)分耐藥菌產(chǎn)生的內(nèi)酰胺酶與人工添加的內(nèi)酰胺酶，牧場(chǎng)只能對(duì)內(nèi)酰胺酶陽性的牛奶丟棄或者銷毀，對(duì)牧場(chǎng)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因此，對(duì)于奶樣呈現(xiàn)內(nèi)酰胺酶陽性的牧場(chǎng)應(yīng)盡快開展溯源工作，消除污染源。

綜上，本研究對(duì)5個(gè)牧場(chǎng)的產(chǎn)ESBL耐藥菌進(jìn)行了流行性研究，并對(duì)第6個(gè)牧場(chǎng)原奶內(nèi)酰胺酶的來源進(jìn)行追溯研究，為控制牧場(chǎng)中內(nèi)酰胺酶的流行提供了科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

大腸桿菌ATCC 25922購自美國典型微生物菌種保藏中心(American Type Culture Collection, ATCC)；科瑪嘉ESBL顯色鑒別培養(yǎng)基購自法國梅里埃公司；阿莫西林購自中國藥品生物制品鑒定所；頭孢他啶購自北京偶合科技公司；頭孢噻肟購自Sigma-Aldrich公司；β-內(nèi)酰胺酶快速檢測(cè)試紙條購自北京維德維康生物技術(shù)有限公司。

1.2 主要儀器

超凈工作臺(tái)購自蘇州凈化設(shè)備有限公司；基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀購自德國Bruker公司。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1)對(duì)內(nèi)蒙古和寧夏5個(gè)牧場(chǎng)養(yǎng)殖環(huán)境產(chǎn)ESBL耐藥菌流行特征研究，2)對(duì)第6個(gè)“內(nèi)酰胺酶檢測(cè)長(zhǎng)期陽性”特殊牧場(chǎng)的內(nèi)源性內(nèi)酰胺酶進(jìn)行溯源研究。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 樣本采集 樣本采集時(shí)間為2020—2021年，采集對(duì)象為內(nèi)蒙古和寧夏6個(gè)牧場(chǎng)養(yǎng)殖奶牛的牛奶以及與奶牛養(yǎng)殖相關(guān)的樣本，6個(gè)牧場(chǎng)分別以A、B、C、D、E和F命名，其中，F(xiàn)為“內(nèi)酰胺酶檢測(cè)長(zhǎng)期陽性”牧場(chǎng)。采樣過程隨機(jī)，力求覆蓋牧場(chǎng)。采集直接使用15 mL離心管采集目標(biāo)樣本，并且采樣過程中使用無菌技術(shù)，戴無菌乳膠手套。采集完成后，在簡(jiǎn)易冰盒中妥善保存，并加急送往實(shí)驗(yàn)室，收到立即進(jìn)行分菌工作，而后將其保存于-80 ℃冰柜中備用。

1.4.2 牛奶樣本β-內(nèi)酰胺酶檢測(cè) 采用β-內(nèi)酰胺酶快速檢測(cè)試紙條法對(duì)6個(gè)牧場(chǎng)的24份牛奶樣本進(jìn)行檢測(cè)(外加1份上市奶粉樣用作陰性對(duì)照)。

1.4.3 產(chǎn)ESBL耐藥菌的分離鑒定 所有樣本均采用“三區(qū)劃線法”劃線科瑪嘉ESBL顯色鑒別培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)18～24 h后，用一次性接種環(huán)挑取顏色不一的可疑菌落，再次劃線加有2 μg·mL-1頭孢噻肟的BHA瓊脂平板，37 ℃18～24 h后，挑單菌落采用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜法(matrix-assisted laser desorption/ioniation time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS)進(jìn)行細(xì)菌的種屬鑒定。

首先對(duì)任務(wù)之間的距離進(jìn)行計(jì)算，然后通過聚類將距離相近的任務(wù)分群。最后根據(jù)任務(wù)群周邊信息和打包策略確定最終的定價(jià)方案。對(duì)比分析任務(wù)標(biāo)價(jià)情況，發(fā)現(xiàn)打包后任務(wù)標(biāo)價(jià)分布更加密集，任務(wù)標(biāo)價(jià)相比打包前更加統(tǒng)一，更有利于提高任務(wù)成功率。

1.4.4 藥敏試驗(yàn) 采用瓊脂稀釋法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，以大腸桿菌ATCC 25922為質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)菌株，測(cè)定A～E 5個(gè)牧場(chǎng)牛奶樣本、乳區(qū)皮膚拭子以及環(huán)境樣本中分離到的產(chǎn)ESBL耐藥菌對(duì)阿莫西林、頭孢他啶、頭孢噻肟3種β-內(nèi)酰胺類抗生素的最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentration，MIC)，測(cè)定MIC后參照CLSI標(biāo)準(zhǔn)及EUCAST標(biāo)準(zhǔn)判斷菌株的耐藥表型。

1.4.5 菌株全基因組測(cè)序 A和D牧場(chǎng)選擇14株分別來源于牛奶、皮膚拭子以及環(huán)境中的產(chǎn)ESBL大腸桿菌，F(xiàn)場(chǎng)選擇兩株分別來源于健康奶牛和乳房炎奶牛的牛奶樣本的產(chǎn)ESBL鮑曼不動(dòng)桿菌，用細(xì)菌DNA提取試劑盒提取菌株基因組，而后送北京賽默百合公司進(jìn)行全基因組測(cè)序。

2 結(jié) 果

2.1 牧場(chǎng)中產(chǎn)ESBL耐藥菌流行情況

A～E 5個(gè)牧場(chǎng)采集了17份牛奶樣本、97份乳區(qū)皮膚拭子樣本以及39份養(yǎng)殖環(huán)境樣本(包括新鮮糞便、臥床墊料、運(yùn)動(dòng)場(chǎng)土壤和污糞、舍飼草料等)，F(xiàn)牧場(chǎng)采集了7份牛奶樣本(表2)。樣本來源涵蓋健康奶牛以及乳房炎奶牛。根據(jù)試紙條的檢測(cè)結(jié)果表明，上市奶粉樣確為陰性，24份牛奶樣本的檢測(cè)結(jié)果成立。據(jù)統(tǒng)計(jì)前5個(gè)牧場(chǎng)的17份樣本共檢測(cè)出16份陽性樣本，1份陰性樣本，0份無效樣本；F牧場(chǎng)7份樣本全為陽性。此外A～E 5個(gè)牧場(chǎng)17份牛奶樣本僅A和D場(chǎng)各分離出兩株產(chǎn)ESBL大腸桿菌(extended-spectrum beta-lactamases resistantEscherichiacoli, ESBL-Ec)，其余136份樣本中有65份樣本分離到產(chǎn)ESBL耐藥菌?？傊贏場(chǎng)(51.6%，16/31)、B場(chǎng)(33.3%，10/30)、C場(chǎng)(53.3%，16/30)、D場(chǎng)(35.5%，11/31)和E場(chǎng)(51.6%，16/31)中均有不同種類的產(chǎn)ESBL耐藥菌被分離出來，以產(chǎn)ESBL大腸桿菌占比最大(79.5%，62/78)，其余為產(chǎn)ESBL塞氏檸檬酸桿菌(9.0%，7/78)、產(chǎn)ESBL陰溝腸桿菌(5.1%，4/78)、產(chǎn)ESBL鮑曼不動(dòng)桿菌(2.6%，2/78)、產(chǎn)ESBL肺炎克雷伯菌(2.6%，2/78)以及產(chǎn)ESBL丙二酸鹽陰性枸櫞酸桿菌(1.3%，1/78)等；以上分離菌株對(duì)阿莫西林(100%)耐藥率最高，而后依次為頭孢噻肟(91.0%)、頭孢他啶(78.2%)。

表2 樣本采集明細(xì)

F牧場(chǎng)的7份牛奶樣本共分離出2株產(chǎn)ESBL鮑曼不動(dòng)桿菌，一株來源于健康奶牛，另一株來源于乳房炎奶牛。

2.2 產(chǎn)ESBL耐藥菌的基因組特征

根據(jù)細(xì)菌全基因組測(cè)序結(jié)果顯示，測(cè)序的產(chǎn)ESBL大腸桿菌檢測(cè)到多種類型的耐藥基因，包括氨基糖苷類耐藥基因、β-內(nèi)酰胺類耐藥基因、磺胺及增效劑耐藥基因、林可胺類耐藥基因、大環(huán)內(nèi)酯類耐藥基因以及四環(huán)素類耐藥基因等，其中，以β-內(nèi)酰胺類耐藥基因的攜帶率最高，尤其是blaCTX-M的攜帶率高達(dá)100%；氨基糖苷類耐藥基因、磺胺類耐藥基因、大環(huán)內(nèi)酯類耐藥基因以及四環(huán)素類耐藥基因的攜帶率均為33.3%；林可胺類耐藥基因僅1株分離菌株攜帶，攜帶率為6.7%。并且A場(chǎng)有3株(37.5%，3/8)、D場(chǎng)有4株(57.1%，4/7)分離菌株攜帶有兩種或兩種以上耐藥基因。

另外，F(xiàn)場(chǎng)的兩株產(chǎn)ESBL鮑曼不動(dòng)桿菌經(jīng)全基因組測(cè)序發(fā)現(xiàn)它們的MLST分型相同，并攜帶相同的毒力基因和β-內(nèi)酰胺類耐藥基因(表3)。

表3 兩株產(chǎn)ESBL鮑曼不動(dòng)桿菌的全基因組測(cè)序結(jié)果

3 討 論

經(jīng)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，這些牧場(chǎng)在奶牛乳房炎的治療或其他感染性疾病的治療中多使用β-內(nèi)酰胺類抗生素，但不同牧場(chǎng)在抗生素的使用方面有一定的習(xí)慣與偏好，導(dǎo)致來自不同牧場(chǎng)的樣本分離出的產(chǎn)ESBL耐藥菌的菌株以及分離菌株的耐藥情況都有不同程度的差異。從分離結(jié)果來看牧場(chǎng)的產(chǎn)ESBL耐藥菌主要是腸桿菌科細(xì)菌，以環(huán)境分離率高，但也有部分來自牛奶，與國內(nèi)外報(bào)道情況類似[35-37]。奶牛牧場(chǎng)養(yǎng)殖環(huán)境中廣泛存在產(chǎn)ESBL耐藥菌，這些細(xì)菌在增加奶牛乳房炎感染概率的同時(shí)，還會(huì)降低抗生素的治療效果，而且該類型細(xì)菌產(chǎn)生的β-內(nèi)酰胺酶還會(huì)極大程度地降低牧場(chǎng)牛奶質(zhì)量，并使其檢測(cè)不合格。以上均嚴(yán)重影響牧場(chǎng)的經(jīng)濟(jì)效益。隨著耐藥菌的迅速傳播與發(fā)展，抗生素聯(lián)合用藥顯得更為重要。

自20世紀(jì)80年代以來，β-內(nèi)酰胺類抗生素與β-內(nèi)酰胺酶抑制劑的組合制劑隨勢(shì)而生且不斷發(fā)展，至今上市的β-內(nèi)酰胺酶抑制劑有克拉維酸、舒巴坦、他唑巴坦、阿維巴坦和法硼巴坦5種，組合制劑有頭孢他啶-阿維巴坦、亞胺培南-西司他丁-雷利巴坦以及美羅培南-法硼巴坦等[38]。而獸用的組合制劑主要是阿莫西林-克拉維酸鉀片、阿莫西林鈉克拉維酸鉀注射液、氨芐西林-舒巴坦甲苯磺酸鹽以及注射用氨芐西林鈉-舒巴坦鈉[39]。牧場(chǎng)在單獨(dú)使用β-內(nèi)酰胺類抗生素?zé)o效情況下可以嘗試使用這些組合制劑，以提高抗菌藥物對(duì)產(chǎn)ESBL耐藥菌的抑制和/或殺滅作用。

自采集于A和D場(chǎng)的產(chǎn)自乳房炎奶牛的牛奶樣本、乳區(qū)皮膚拭子樣本以及環(huán)境樣本中分離純化獲得的ESBL-Ec經(jīng)過細(xì)菌全基因組測(cè)序可發(fā)現(xiàn)，它們均攜帶有β-內(nèi)酰胺類耐藥基因blaCTX-M，推測(cè)這些基因很可能來源于環(huán)境。奶樣中β-內(nèi)酰胺酶檢出率很高，在排除外源人為非法添加β-內(nèi)酰胺酶后，內(nèi)源性β-內(nèi)酰胺酶需要引起高度重視。推測(cè)其來源有3種可能性：1)奶牛體內(nèi)其他來源的產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶耐藥菌進(jìn)入奶牛乳腺產(chǎn)生的，但未引起奶牛乳房炎或/和未引起奶牛明顯全身癥狀，這些產(chǎn)酶菌很可能來源于牧場(chǎng)養(yǎng)殖環(huán)境；2)引起奶牛乳房炎的產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶耐藥菌產(chǎn)生的，很可能也來源于牧場(chǎng)養(yǎng)殖環(huán)境；3)大罐奶存放時(shí)被環(huán)境中的產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶耐藥菌污染，且奶中可能有抗生素殘留，耐藥菌與抗生素相互作用后產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶。

F牧場(chǎng)采集的7份牛奶樣本中，分離出產(chǎn)ESBL鮑曼不動(dòng)桿菌的樣本β-內(nèi)酰胺酶檢測(cè)呈陽性，通過細(xì)菌全基因組測(cè)序發(fā)現(xiàn)兩株不同來源的產(chǎn)ESBL鮑曼不動(dòng)桿菌具有高度相似性。產(chǎn)ESBL鮑曼不動(dòng)桿菌一般主要存在于奶牛養(yǎng)殖環(huán)境中，可以從堆肥、墊料、運(yùn)動(dòng)場(chǎng)等環(huán)境中分離到，所以推測(cè)產(chǎn)ESBL鮑曼不動(dòng)桿菌是造成該場(chǎng)β-內(nèi)酰胺酶檢測(cè)長(zhǎng)期陽性的主要菌株，很可能來源于環(huán)境。

4 結(jié) 論

本研究揭示了A、B、C、D和E這5個(gè)牧場(chǎng)養(yǎng)殖環(huán)境中產(chǎn)ESBL耐藥菌廣泛存在，并探明耐藥菌攜帶的耐藥基因類型；明確β-內(nèi)酰胺酶在原奶中廣泛分布，評(píng)估牧場(chǎng)產(chǎn)ESBL耐藥菌存在的風(fēng)險(xiǎn)；探明造成F牧場(chǎng)原奶中內(nèi)酰胺酶檢測(cè)長(zhǎng)期陽性的原因，為指導(dǎo)牧場(chǎng)乳房炎的防控與治療提供科學(xué)依據(jù)。