令狐遠鳳，潘 永，楊 陽，段世宇，張家莉，張寶太，楊 琦*

(1.貴州大學動物科學學院， 貴陽 550025；2.貴州大學動物疫病研究所，貴陽 550025；3.貴州省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，貴陽550025)

STM sRNA GcvB是一類重要的RNA分子，其無法編碼相應(yīng)的蛋白質(zhì)，而是通過與Hfq協(xié)同作用，轉(zhuǎn)錄后調(diào)控STM有關(guān)靶mRNA[1]?，F(xiàn)已經(jīng)驗證確認受GcvB直接調(diào)控的靶mRNA在STM中近30個，其中，大部分靶mRNA與GcvB的結(jié)合位點也已闡明[2]。sRNA-Hfq -mRNA三聯(lián)體在細菌中普遍存在，Hfq不僅能夠維持sRNA在細菌中轉(zhuǎn)錄后的穩(wěn)定性，而且可重塑sRNA與其靶mRNA的二級結(jié)構(gòu)構(gòu)象，使sRNA易于與其靶mRNA結(jié)合[3]。Hfq六聚體通常利用其近端面與sRNA富含U的序列結(jié)合并作用[4]。

STM Hfq具有維持GcvB在體內(nèi)穩(wěn)定性的作用，但Hfq與GcvB具體的作用結(jié)合位點尚未探究透徹。鑒于此，本研究將利用RNA二級結(jié)構(gòu)預測軟件分析GcvB二級結(jié)構(gòu)并篩查Hfq結(jié)合偏好型的富U基序；利用λ-Red同源重組酶系統(tǒng)構(gòu)建相應(yīng)序列的突變或截短菌株；利用噬菌體轉(zhuǎn)導技術(shù)構(gòu)建相應(yīng)的hfq或gcvB基因缺失菌株以及l(fā)acZ基因融合菌株；通過qRT-PCR檢測不同重組菌株gcvB基因的轉(zhuǎn)錄水平；通過β-半乳糖苷酶試驗檢測不同重組菌株oppA基因的蛋白水平，最后分析Hfq與GcvB富U基序的作用關(guān)系，為闡明STM Hfq與GcvB的作用機理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料

MA7455菌株(STM LT2/pKD46)，MA10241菌株(STM LT2 ΔgcvB::cat)，MA10675菌株(STM LT2 Δhfq::tetRA)，P22噬菌體均由法國國家科學研究中心(CNRS)分子遺傳學Bossi實驗室惠贈。STM LT2oppA::lacZ菌株由本實驗室構(gòu)建。氯霉素、鹽酸四環(huán)素、卡那霉素、dNTPs Mix及ONPG均購自北京索萊寶科技有限公司。AceQ Universal SYBR qPCR Master Mix和膠回收試劑盒均購自南京諾唯贊生物科技有限公司。NovoScript?Plus All-in-one 1 st Strand cDNA Synthesis SuperMix (gDNA Purge)購自近岸蛋白生物科技有限公司。

1.2 引物設(shè)計與合成

登錄NCBI網(wǎng)站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，獲取STM LT2株的全基因序列(GeneID：AE006468.2), 根據(jù)基因序列設(shè)計引物(表1)，引物由Primer select軟件設(shè)計，并由上海生工生物工程有限公司合成。

表1 PCR引物序列

1.3 GcvB二級結(jié)構(gòu)預測和富U基序篩查

使用Mfold軟件預測GcvB二級結(jié)構(gòu)。登錄網(wǎng)站(http://unafold.rna.albany.edu/?q=mfold)，打開RNA Folding Form (Version 2.3 energies)選項，輸入gcvB基因完整序列，其余參數(shù)按默認方案設(shè)置，導出并分析結(jié)果。篩查GcvB中Hfq結(jié)合偏好型富U基序。

1.4 GcvB富U基序突變或截短菌株的構(gòu)建

利用λ-Red同源重組酶系統(tǒng)，以P1/P2為引物，MA10241菌株總DNA為模板，PCR擴增后產(chǎn)物回收作為模板，P3/P10為引物，產(chǎn)物經(jīng)純化后與pKD46感受態(tài)細胞進行電轉(zhuǎn)，在平板上培養(yǎng)后以P8/P9為引物鑒定其菌落，篩選出STM LT2gcvB::cat；以P4/P10為引物，PCR擴增用于替換gcvB基因內(nèi)部為T的目的片段，分別以P5/P10、P6/P10、P7/P10和P8/P10為引物，PCR擴增用于截短gcvB基因T8的目的片段，用上述相同方法將鑒定正確的菌株分別命名為STM LT2gcvB(130—134TTTTT>GGGGG)::cat、STM LT2gcvBΔ(206)::cat、STM LT2gcvBΔ(205—206)::cat、STM LT2gcvBΔ(204—206)::cat和STM LT2gcvBΔ(203—206)::cat；以STM LT2gcvBΔ(204—206)::cat菌株總DNA為模板，P1/P2為引物，其產(chǎn)物為模板，P9/ P10為引物，以相同方法鑒定正確的菌株命名為STM LT2gcvB[Δ(203—206),(184—185)::CCCC, (192—193)::GGGG]::cat。

1.5 P22噬菌體的轉(zhuǎn)導

將鼠傷寒沙門菌MA10675和STM LT2oppA::lacZ缺失菌株作為供體菌株，GcvB 富U基序突變或截短菌株為受體菌，分別取受體菌100、50 μL稀釋后供體菌borth至2.0 mL EP 管中混勻置于37 ℃搖床孵育1 h后涂布篩選，以引物P10/P11、P6/P7分別對hfq基因的缺失、oppA-lacZ融合基因進行鑒定。

1.6 qRT-PCR反應(yīng)

根據(jù)R6950 Bacterial RNA Kit，提取鼠傷寒沙門菌LT2的RNA，以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA作為模板，P11/P12(gcvB基因)和 P13/P14(16S rDNA基因)為引物，按照SYBR?Premix Ex TaqTMII(Tli RNaseH Plus)試劑盒說明書進行qPCR，以16S rDNA基因為內(nèi)參基因，以STM LT2gcvB::cat菌株為對照。最終采用相對比較法即Ct法(Qr=2-ΔΔCt)計算分析數(shù)據(jù)[5]。

1.7 β-半乳糖苷酶活性的檢測

取50 μL待測菌株置于5 mL LB中，培養(yǎng)至 OD600 nm=0.4后，取0.1 mL至新試管中，以Z buffer定容到1 mL。滴加3滴甲苯后在42 ℃水浴搖床中振蕩2 h，將試管轉(zhuǎn)于28 ℃ 水浴鍋加入0.2 mL ONPG，記錄加入時間(t0)。當試管中呈現(xiàn)出黃色時，加入0.5 mL Na2CO3終止反應(yīng)，記錄終止時間(tf)。將試管中終止所得液體離心后測其OD420nm，記錄數(shù)值。通過公式計算β-半乳糖苷酶活性。

β-半乳糖苷酶活性=(1 000×OD420 nm)/[(tf-t0)×OD600 nm]

2 結(jié) 果

2.1 GcvB二級結(jié)構(gòu)預測及富U基序篩查結(jié)果

使用Mfold軟件預測STM LT2 GcvB的二級結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示，GcvB堿基可退火形成6個莖環(huán)結(jié)構(gòu)，查找到的兩個Hfq結(jié)合偏好型基序，U5位于第4個與第5個莖環(huán)之間，U8位于GcvB 3′末端，且均處于單鏈狀態(tài)。

2.2 GcvB U5基序突變菌株/U8基序截短菌株及其hfq基因缺失菌株的構(gòu)建結(jié)果

利用λ-Red同源重組酶系統(tǒng)和噬菌體轉(zhuǎn)導技術(shù)構(gòu)建相應(yīng)的hfq基因缺失菌株。以STM LT2gcvB::cat菌株DNA為模板，利用λ-Red同源重組酶系統(tǒng)將gcvB基因T5(130—134 nt)突變?yōu)镚5,將gcvB基因T8(199—207 nt)截短。PCR鑒定結(jié)果顯示，所有重組菌株均出現(xiàn)與預期相符的918、1 964 bp目的條帶，將PCR測序后進行峰圖比對，STM LT2gcvB基因T5(130—134 nt)已突變?yōu)镚5，STM LT2gcvB基因T8(199—207 nt)已分別被截短突變?yōu)門7、T6、T5和T4。

2.3 gcvB T5基序突變對gcvB轉(zhuǎn)錄水平的影響

經(jīng)過qRT-PCR試驗結(jié)果顯示，與野生型菌株(WT)相比，T5基序突變后gcvB基因轉(zhuǎn)錄水平未產(chǎn)生明顯變化，敲除hfq基因后gcvB基因轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)52%，敲除hfq基因的基礎(chǔ)上T5基序的突變使gcvB基因轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)51%。以上結(jié)果表明，hfq與gcvB基因轉(zhuǎn)錄水平呈正相關(guān)，但gcvBT5基序與gcvB基因的轉(zhuǎn)錄水平無明顯關(guān)聯(lián)。

2.4 gcvB T8基序截短對GcvB轉(zhuǎn)錄水平的影響

對gcvBT8基序截短菌株(T7、T6、T5和T4)及相應(yīng)的hfq基因缺失菌株的gcvB轉(zhuǎn)錄水平進行檢測。qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，與WT相比，T7和T6菌株gcvB基因轉(zhuǎn)錄水平未產(chǎn)生明顯變化，而T5和T4菌株分別下調(diào)40.5%和37.5%。敲除hfq基因的基礎(chǔ)上截短T8基序，與WT相比，T7、T6、T5和T4菌株分別下調(diào)58.5%、57.8%、75.2%和77.8%(圖1)。以上結(jié)果表明，gcvB基因T8基序的截短對其轉(zhuǎn)錄水平產(chǎn)生了抑制作用，截短為T5和T4時作用最為明顯。

WT. STM LT2 gcvB::cat; gcvB-7T. STM LT2 gcvB Δ(206)::cat; gcvB-6T. STM LT2 gcvB Δ(205—206)::cat; gcvB-5T. STM LT2 gcvB Δ(204—206)::cat; gcvB-4T. STM LT2 gcvB Δ(203—206)::cat; Δhfq. STM LT2 gcvB::cat Δhfq::tetRA; gcvB-7TΔhfq. STM LT2 gcvB Δ(206)::cat Δhfq::tetRA; gcvB-6TΔhfq. STM LT2 gcvB Δ(205—206)::cat Δhfq::tetRA; gcvB-5TΔhfq. STM LT2 gcvB Δ(204—206)::cat Δhfq::tetRA; gcvB-4TΔhfq. STM LT2 gcvB Δ(203—206)::cat Δhfq::tetRA

2.5 GcvB終止子莖延伸菌株及其hfq基因缺失菌株的構(gòu)建結(jié)果

利用λ-Red同源重組酶系統(tǒng)在gcvB基因185—186位堿基之間插入C4序列,191—192位堿基之間插入G4序列，構(gòu)建GcvB終止子莖延伸菌株，在此基礎(chǔ)上，利用噬菌體轉(zhuǎn)導技術(shù)構(gòu)建hfq基因缺失菌株。PCR產(chǎn)物測序峰圖比對表明目的片段已正確構(gòu)建。

2.6 終止子莖延伸對GcvB轉(zhuǎn)錄水平的影響

對STM LT2gcvBΔ(203—206)::cat菌株GcvB終止子莖延伸菌株及其hfq基因缺失菌株的gcvB轉(zhuǎn)錄水平進行檢測。qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，與WT相比，gcvB-LS4T終止子莖延伸菌株gcvB基因轉(zhuǎn)錄水平略微下調(diào)19.6%，而在此基礎(chǔ)上敲除hfq基因后，gcvB基因轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)29%。與僅敲除hfq基因時相比，gcvB-LS4TgcvBΔhfq基因轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)為原來的1.6倍(圖2)。以上結(jié)果表明，終止子莖的延伸與gcvB基因的轉(zhuǎn)錄水平呈正相關(guān)。

WT. STM LT2 gcvB::cat; gcvB-LS4T. STM LT2 gcvB[Δ(203—206),(184—185)::CCCC, (192—193)::GGGG]::cat; Δhfq. STM LT2 gcvB::cat Δhfq::tetRA; gcvB-LS4TΔhfq. STM LT2 gcvB[ Δ(203—206),(184—185)::CCCC, (192—193)::GGGG]::cat Δhfq::tetRA

2.7 oppA::lacZ基因融合菌株的構(gòu)建結(jié)果

以STM LT2oppA::lacZ菌株作為供體菌，STM LT2gcvB::cat、STM LT2gcvBΔ(203—206)::cat和STM LT2gcvB[Δ(203—206),(184—185)::CCCC, (192—193)::GGGG]::cat分別為受體菌，運用噬菌體轉(zhuǎn)導技術(shù)構(gòu)建相應(yīng)的oppA::lacZ基因融合菌株。PCR鑒定結(jié)果顯示，所有重組菌株均出現(xiàn)與預期相符的918、914、922、250 bp目的條帶(圖3)。

M. DL2000 marker; 1. STM LT2 gcvB::cat oppA::lacZ; 2. STM LT2 gcvB Δ(203—206)::cat oppA::lacZ; 3. STM LT2 gcvB[Δ(203—206),(184—185)::CCCC, (192—193)::GGGG]::cat oppA::lacZ

2.8 GcvB終止子莖延伸對oppA蛋白水平的影響

通過檢測oppA::lacZ基因融合菌株β-半乳糖苷酶活性，探究gcvBT8截短為T4以及延伸終止子莖對OppA蛋白表達的影響。結(jié)果顯示，與WT相比，gcvB基因 T8截短為T4后，oppA基因蛋白水平上調(diào)為原來的1.7倍。延伸該菌株的GcvB終止子莖后oppA基因蛋白水平上調(diào)為原來的1.7倍。以上結(jié)果表明，GcvB終止子莖的延伸雖恢復了因gcvB基因T8基序截短為T4時gcvB基因轉(zhuǎn)錄水平的下調(diào)，卻未恢復下調(diào)OppA蛋白表達的能力。

3 討 論

Sauer和Weichenrieder[6]通過分析尺寸排阻色譜法證實了大腸桿菌Hfq與sRNA RybB的3′末端U6具有很高的親和力，由于大多數(shù)Hfq依賴型sRNA 3′末端都具有4～8個尿嘧啶，該研究揭示了一種重要的Hfq與sRNA作用模式。Otaka等[4]發(fā)現(xiàn)截短大腸桿菌sRNA SgrS 3′末端U8時，SgrS喪失了與Hfq結(jié)合并使ptsG mRNA沉默的能力，再次證實了sRNA 3′末端polyU對Hfq結(jié)合的重要性。本研究中，對沙門菌sRNA GcvB二級結(jié)構(gòu)預測，考慮到U5處于GcvB內(nèi)部且在莖環(huán)結(jié)構(gòu)附近，缺失將嚴重引起二級結(jié)構(gòu)的改變從而增加了變量，不利于試驗分析GcvB與Hfq之間的作用關(guān)系，因此對U5進行了突變處理，對U8進行截短處理。先前的研究已表明，Hfq主要與SgrS 3′末端U8結(jié)合，從而增強了SgrS的穩(wěn)定性。試驗檢測了突變的U5及截短的U8菌株gcvB基因的轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果顯示，U5的突變并未引起gcvB基因轉(zhuǎn)錄水平的顯著變化，而U8的截短導致gcvB基因轉(zhuǎn)錄水平的明顯變化，當GcvB 3′末端尿嘧啶數(shù)量縮減為5個時，GcvB轉(zhuǎn)錄水平開始表現(xiàn)出明顯的下調(diào)。經(jīng)初步驗證，U8基序?qū)τ贖fq維持GcvB的穩(wěn)定性以及協(xié)助GcvB負調(diào)控OppA的表達是必要的。

由于懷疑GcvB U8基序的縮短破壞了gcvB的轉(zhuǎn)錄終止進程，本研究在GcvB U8基序截短為U4的基礎(chǔ)上延伸了U8基序前的終止子莖，與未延伸終止子莖相比，GcvB轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)，幾乎恢復至野生型菌株的水平，在此基礎(chǔ)上敲除hfq基因也并未使GcvB轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生明顯變化，僅略微下調(diào)。但結(jié)果仍不能充分說明GcvB U8基序截短為U4GcvB轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)的原因是破壞了gcvB的轉(zhuǎn)錄終止進程或是破壞了GcvB與Hfq結(jié)合的關(guān)鍵基序，研究推測兩種方式均存在。而通過對oppA基因蛋白水平的檢測，發(fā)現(xiàn)GcvB U4菌株和其終止子莖延伸菌株oppA基因蛋白水平均較野生型菌株上調(diào)，該結(jié)果提示盡管終止子莖的延伸恢復了GcvB轉(zhuǎn)錄水平，但其抑制oppAmRNA的翻譯的能力已然喪失，而Hfq是GcvB發(fā)揮調(diào)控作用依賴的伴侶蛋白。結(jié)果進一步說明GcvB U8基序?qū)τ贖fq維持GcvB的穩(wěn)定性是重要的。

4 結(jié) 論

U5基序與Hfq維持GcvB穩(wěn)定性無明顯關(guān)聯(lián)。U8基序?qū)fq協(xié)助GcvB轉(zhuǎn)錄后負調(diào)控oppAmRNA以及維持GcvB穩(wěn)定性來說是重要的，推測其為Hfq與GcvB的作用結(jié)合位點。