崔明仙，王星博，黃彥銘，卞希一，馮夢珂,顏 焰,董偉仁，周繼勇

(浙江大學(xué)動物醫(yī)學(xué)中心，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動物病毒學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州 310058)

禽流感是由禽流感病毒(avian influenza virus, AIV)引起的一種從呼吸系統(tǒng)病變到嚴(yán)重全身敗血癥等多種癥狀的禽類傳染病[1]。AIV屬于正黏病毒科，流感病毒屬，根據(jù)其對雞的致病性，可分為低致病性AIV(low pathogenic avian influenza virus, LPAIV)和高致病性AIV(high pathogenic avian influenza virus, HPAIV)[2]。H3亞型AIV是LPAIV中分離率較高的一種亞型[3]。H3亞型流感病毒宿主范圍較廣，除感染禽類外，陸續(xù)發(fā)現(xiàn)該亞型流感病毒還能感染馬、犬、貓等哺乳動物[4]。H3亞型流感病毒易發(fā)生基因重組[5]，如豬H3N2病毒在豬這個“混合器”中通過與人流感病毒發(fā)生基因重排，可形成感染人的新型豬流感病毒[6]。近三年來，趙婉宸等[7]在中國華東地區(qū)(江蘇、山東和安徽)共分離到6株鴨或鵝源的H3N2亞型AIV，但未見浙江省H3N2亞型AIV的報(bào)道。因此，對浙江地區(qū)開展家禽H3N2亞型AIV 分子流行病學(xué)檢測，密切關(guān)注其傳播和進(jìn)化情況，不僅對畜牧業(yè)生產(chǎn)十分重要，還具有重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義。

本試驗(yàn)以2021年浙江地區(qū)分離到的3株H3N2亞型AIV為研究對象，對其開展分子特征及遺傳進(jìn)化分析，以期為浙江乃至華東地區(qū)H3N2亞型AIV的流行病學(xué)監(jiān)測提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料和試劑

反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自賽默飛世爾科技公司；Trizol試劑、Phanta Max Super-fidelity DNA Polymerase等購自南京諾唯贊生物科技有限公司；9～12日齡SPF雞胚購自寧波純派農(nóng)業(yè)科技有限公司；氯仿、異丙醇、乙醇購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；引物由浙江尚亞生物技術(shù)有限公司合成。

1.2 樣品檢測與分離

2021年，于浙江省四地(嘉興、湖州、舟山、臺州)采集禽類共923份咽肛拭子。采用RT-PCR技術(shù)對樣品進(jìn)行AIV的檢測和亞型的鑒定。采用雞胚分離法分離病毒[8]。采用雞胚終點(diǎn)稀釋法純化病毒[9]，采用血凝試驗(yàn)(HA)和PCR法對分離到的病毒進(jìn)行鑒定[10]。經(jīng)PCR流感病毒HA亞型檢測，只檢測到單一亞型的樣品用Trizol法抽提病毒RNA，并送晶能生物技術(shù)(上海)有限公司進(jìn)行二代測序(Illumina NovaSeq 6000 測序平臺)，對測序結(jié)果利用Burrows-Wheeler Aligner(版本 0.7.17)[11]和 SAMtools(版本 1.10)[12]進(jìn)行序列的比對。

1.3 病毒全基因組序列分析

將測序結(jié)果用BLAST工具進(jìn)行同源序列搜索，采用DNAStar軟件中MegAlign模塊進(jìn)行同源性分析；對NCBI和GISAID數(shù)據(jù)庫中的相關(guān)序列進(jìn)行篩選，篩選標(biāo)準(zhǔn)：1)刪除兩個數(shù)據(jù)庫中的重復(fù)序列；2)須具有完整開放閱讀框。從NCBI和GISAID數(shù)據(jù)庫中最終獲得H3N2HA基因(717條)、H3N6HA基因(21條)、H3N2NA基因(605條)和H6N2NA基因(331條)。利用軟件RAxML(版本8.2.4)[13]繪制HA和NA基因進(jìn)化樹，并用iTOL v4[14]進(jìn)行可視化分析。

2 結(jié) 果

2.1 樣品檢測與病毒分離鑒定

2021年，采自嘉興、湖州、舟山和臺州的小型養(yǎng)殖場的雞源咽肛拭子分別為386、294、100和30份，采自嘉興和臺州的鴨源咽肛拭子分別為3和110份，共計(jì)923份樣品。AIV總陽性率為7.69%(71/923)，其中，采自嘉興市、湖州市、舟山市和臺州市樣品的AIV陽性率分別為4.88%(19/389)、8.16%(24/294)、28%(28/100)和0(0/140)。雞源樣品AIV陽性率為8.40%(68/810)，鴨源樣品AIV陽性率為2.65%(3/113)。從嘉興市樣品中分離到1株鴨源H3N2亞型AIV(A/duck/Zhejiang/Y1/2021, ZJ/Y1)，從湖州市樣品中分離到2株雞源H3N2亞型AIV(A/chicken/Zhejiang/57/2021, ZJ57和A/chicken/Zhejiang/64/2021, ZJ64)。

2.2 病毒全基因組同源分析

BLAST比對結(jié)果顯示，2株雞源ZJ57和ZJ64的HA基因與A/duck/Hunan/161/2015(H3N6)相似性高達(dá)94.42%，鴨源ZJ/Y1的HA基因與A/duck/Hubei/ZYSYF18/2015(H3N6)相似性為97.25%，它們均與H3N6相似度較高；3株分離株的NA基因與H6N2相似性均在96.24%以上；PB2、M基因與H1Nx相似性為97.24%和97.66%以上；ZJ57和ZJ64的PB1基因、ZJ57的NS基因、ZJ/Y1的PA基因均與H10N7對應(yīng)基因具有較高相似性(表1)。3株H3N2亞型分離株之間的HA基因核苷酸相似性為93.4%～100.0%，NA基因之間的核苷酸相似性為94.0%～99.9%。

表1 3株H3N2亞型AIV分離株的BLAST分析

2.3 病毒HA和NA基因遺傳進(jìn)化分析

遺傳進(jìn)化分析表明：從宿主范圍來看，H3N2亞型流感病毒的宿主范圍可分為不同分支，禽源分支在遺傳進(jìn)化上與豬源、人源和犬/貓?jiān)淳辉谕环种?；H3N2亞型AIV的主要宿主為鴨(圖1)；從地區(qū)分布來看，H3N2亞型流感病毒在全國均有分布，其中，H3N2亞型AIV主要流行于華東地區(qū)；從時間分布來看，AIV主要流行于2010年以后。3株H3N2亞型分離株的HA和NA基因均屬于禽源分支，雞源ZJ57和ZJ64的HA基因與A/duck/Hunan/161/2015(H3N6)遺傳距離最近，而鴨源ZJ/Y1與A/duck/Hubei/ZYSYF9/2015(H3N6)遺傳距離最近，雞源ZJ57和ZJ64的HA基因與NA基因與A/duck/Guangxi/S31299/2015(H6N2)遺傳距離最近，而鴨源ZJ/Y1與A/duck/Guangdong/F1172/2018(H3N6)遺傳距離最近(圖1)。

圖1 3株H3N2亞型流感病毒HA和NA基因遺傳進(jìn)化樹

2.4 病毒分子特征分析

2.4.1HA和NA基因分子特征分析 3株H3N2亞型AIV的HA基因編碼區(qū)均由1 701個核苷酸組成，編碼566個氨基酸。HA1區(qū)編碼344個氨基酸，HA2區(qū)編碼221個氨基酸。分離株的HA蛋白裂解位點(diǎn)序列均為PEKQTR↓GLF，具有典型的低致病性禽流感病毒特征。3株分離株的HA中影響流感病毒與受體特異性結(jié)合的226Q、228G、190E和225G未發(fā)生突變，位于結(jié)合位點(diǎn)周圍的4個高度保守的殘基(Y98、W153、H183、Y195)也未發(fā)生突變，提示分離株跨物種傳播潛力較低。分離株HA蛋白的潛在N型糖基化位點(diǎn)均為6個，與浙江省禽源和人源分離株相比，存在糖基化位點(diǎn)增添和缺失的情況(表2)。3株H3N2亞型AIV的NA基因編碼區(qū)均由1 410個核苷酸組成，編碼469個氨基酸，頸部區(qū)無氨基酸缺失。NA蛋白共有5個預(yù)測的N型糖基化位點(diǎn)，分別為第61位(NITE)、69位(NNTI)、86位(NWSK)、146位(NGTI)和234位(NGTC)。

表2 3株H3N2亞型禽流感病毒HA蛋白N型糖基化位點(diǎn)預(yù)測

2.4.2 內(nèi)部片段基因分子特征分析 3株H3N2亞型禽流感分離株P(guān)B2蛋白中與哺乳動物適應(yīng)性相關(guān)的第627位關(guān)鍵位點(diǎn)均為Glu，符合禽流感特征，而人源A/Homosapien/China/LS340/2019(H3N2)株為Lys。PB1蛋白中與哺乳動物致病性相關(guān)的第66位氨基酸位為Ser(人源H3N2為Leu)，而PB2中在跨物種傳播起關(guān)鍵作用的701位氨基酸位點(diǎn)、PB1蛋白中與小鼠致病性相關(guān)的第198和317位氨基酸位點(diǎn)、PA蛋白中能使毒力增強(qiáng)的第97位氨基酸位點(diǎn)、M1蛋白中能增強(qiáng)病毒對小鼠致病性的第30和215位氨基酸位點(diǎn)均未發(fā)生突變。

3 討 論

AIV為單股負(fù)鏈RNA病毒[15]，由于其在RNA復(fù)制過程中缺乏校對機(jī)制，導(dǎo)致點(diǎn)突變頻率很高。除通過快速突變產(chǎn)生遺傳多樣性外，同源重組是另外一種重要的進(jìn)化機(jī)制，它驅(qū)動病毒基因變異的形成，使AIV能夠克服選擇壓力而適應(yīng)新的環(huán)境和宿主[16]。本研究結(jié)果顯示，已報(bào)道的H3N2亞型AIV主要流行于2010年后，集中分布在華東地區(qū)，鴨是其主要宿主。分離株各基因片段來源復(fù)雜，說明它們可能是經(jīng)過長時間進(jìn)化而發(fā)生自然重排后形成的重組病毒：分離株的HA基因與湖南和湖北兩地H3N6亞型毒株距離較近，ZJ57和ZJ64的NA基因與廣西的H6N2毒株遺傳關(guān)系較近，ZJ/Y1與廣東的H3N6毒株遺傳距離最近，進(jìn)一步說明3株H3N2亞型AIVs片段來源較復(fù)雜，可能發(fā)生了基因重組。

流感病毒受體結(jié)合特異性會影響其跨物種傳播。人H3流感病毒HA蛋白226L和228S特征使其優(yōu)先與人細(xì)胞表面的α2-6半乳糖苷唾液酸(SAα2-6Gal)受體結(jié)合，而禽源優(yōu)先與α2-3半乳糖苷唾液酸(SAα2-3Gal)受體結(jié)合[17]，PB2中的627E和701K氨基酸位點(diǎn)也在流感病毒跨種間傳播中起關(guān)鍵性作用[18]。本研究中3株H3N2亞型禽流感病毒分離株HA蛋白的226Q和228G特征表明其更傾向于結(jié)合禽源的SAα2-3Gal受體，提示分離株的跨物種傳播潛力較低。PB2蛋白序列中與哺乳動物適應(yīng)性相關(guān)的第627位關(guān)鍵位點(diǎn)均為Glu，符合禽流感病毒特征。PB1中的66S、198K和701M氨基酸位點(diǎn)，M1中的30D和215A能增強(qiáng)流感病毒致病性[19-22]。但PB1蛋白中第66位氨基酸位點(diǎn)均由Leu突變?yōu)镾er，但是否會增強(qiáng)對哺乳動物的致病性還需進(jìn)一步驗(yàn)證。

禽流感病毒HA和NA蛋白都修飾有N-連接寡糖(N型糖基化位點(diǎn))[23]，流感病毒HA蛋白頭部的糖基化位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)和數(shù)量不相同，是導(dǎo)致病毒抗原多樣性的一個重要原因，它能夠掩蓋或者修飾抗原位點(diǎn)，減少先天免疫系統(tǒng)給病毒的生存壓力[24]。本研究發(fā)現(xiàn)浙江人源A/Homosapien/China/LS340/2019(H3N2)株HA蛋白和NA蛋白的糖基化位點(diǎn)較豐富，而禽源A/duck/Zhejiang/D13/2013(H3N2)[25]糖基化位點(diǎn)相對較少，3株分離株的糖基化位點(diǎn)均存在不同情況的缺失和增加，其是否會對病毒抗原多樣性造成影響還需進(jìn)一步探究。

4 結(jié) 論

2021年，浙江地區(qū)禽流感陽性率為7.70%，分離到3株H3N2亞型AIVs，其基因片段來源復(fù)雜，推測可能由不同亞型毒株經(jīng)過長時間進(jìn)化而發(fā)生自然重排后形成。因未發(fā)生與哺乳動物適應(yīng)性位點(diǎn)相關(guān)的突變，表明其跨種傳播潛力較低，但PB1中66位氨基酸突變?yōu)镾，其是否會增加哺乳動物的致病性仍需進(jìn)一步探究。