劉 旭，潘寅川，楊亞軍，劉希望，馬 寧*，李劍勇*

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院(中獸醫(yī)學(xué)院) 河北省獸醫(yī)生物技術(shù)創(chuàng)新中心，保定 071000；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸用藥物創(chuàng)制重點實驗室 甘肅省新獸藥工程重點實驗室，蘭州 730050)

炎癥可引起寵物疼痛不安，造成生存質(zhì)量下降，嚴(yán)重影響寵物福利[1]。與炎癥相關(guān)的疾病主要有犬、貓的關(guān)節(jié)炎、皮炎、胃腸炎、胰腺炎以及術(shù)后炎癥等。此外，代謝性疾病如血脂異常、肥胖等在犬、貓中也具有很高的發(fā)病率，而炎癥是引起此類疾病的重要病因之一[2-3]。對炎癥的干預(yù)和治療，對于炎癥本身及預(yù)防相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展十分重要，有助于維持寵物的健康狀態(tài)和提高寵物的生活質(zhì)量，已日益受到重視。

阿司匹林(aspirin，Asp)是一種用于止痛、消炎、解熱的常用藥物[4]。前期相關(guān)研究證實，Asp可以預(yù)防犬貓等寵物的炎癥性疾病[5]。然而，由于Asp會引起胃腸道并發(fā)癥，限制了Asp的長期使用[6]。丁香酚(eugenol，Eug)是丁香花蕾揮發(fā)油中的活性成分，具備多種治療效果，包括抗菌、抗炎、抗血栓、解熱等[7]。由于Eug含有酚羥基，具有刺激性和易氧化的特點，其臨床應(yīng)用受到一定限制。為了減少Asp和Eug的副作用，提高治療效果，通過酯化反應(yīng)合成了阿司匹林丁香酚酯(aspirin eugenol ester，AEE)[8]。AEE通過酯化反應(yīng)對羧基和酚羥基進(jìn)行修飾，既解決了Asp進(jìn)入體內(nèi)時對腸胃的刺激，同時克服了Eug的不穩(wěn)定性和刺激性氣味[9-10]。其急性毒性、藥效學(xué)、穩(wěn)定性、致畸性和致突變性研究表明，AEE的LD50為10.39 g·kg-1，低于Asp和Eug[11]，大鼠連續(xù)灌胃15 d(50 mg·kg-1)，無顯著毒性作用[12]，鼠傷寒沙門菌試驗(Ames)和小鼠骨髓微核試驗證實其遺傳毒性不顯著[13]。藥理學(xué)表明，AEE通過調(diào)節(jié)一氧化氮合酶和Nrf2信號通路，保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞免受氧化損傷[14]，并對高血脂、血栓具有一定的治療作用[15-16]。然而，該藥物作為Asp衍生物，其抗炎作用和抗炎機制尚需進(jìn)一步研究。

花生四烯酸(Arachidonic acid，AA)是一種ω-6多不飽和脂肪酸，主要以細(xì)胞膜上的磷脂的形式存在。當(dāng)細(xì)胞處于應(yīng)激狀態(tài)時，AA被磷脂酶A2(phospholipase A2，PLA2)分解成游離形式并釋放到細(xì)胞液中，然后在代謝酶的作用下形成上百種生物活性代謝物。目前，參與AA代謝的酶主要有3種，分別是環(huán)氧化酶(cyclooxygenase，COX)、脂氧合酶(lipoxygenase，LOX)和細(xì)胞色素P450(cytochrome P450，CYP450)[17-18]。AA代謝網(wǎng)絡(luò)是產(chǎn)生炎癥介質(zhì)并誘導(dǎo)炎癥的主要網(wǎng)絡(luò)[19]，其在炎癥的形成和發(fā)展中發(fā)揮著極其重要的作用，且不是一個孤立的過程。本研究以脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞(RAW264.7細(xì)胞)體外炎癥模型，分析AEE對RAW264.7細(xì)胞存活率和炎癥因子含量的影響，明確AEE對炎癥反應(yīng)的抑制效應(yīng)；并進(jìn)一步結(jié)合RT-PCR和分子對接方法，研究AEE對AA代謝通路關(guān)鍵酶的作用，探討AEE潛在的抗炎機制，為將AEE開發(fā)為獸醫(yī)臨床抗炎藥物提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 藥品試劑

小鼠巨噬細(xì)胞(RAW264.7細(xì)胞)購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫；AEE(純度>99%)由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸用藥物創(chuàng)制重點實驗室合成制備；阿司匹林、丁香酚購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；脂多糖、胰蛋白酶、Cell Counting Kit-8購自北京索萊寶科技有限公司；Foundation FBS、DMEM高糖培養(yǎng)液購自MCE有限公司；ELISA試劑盒購自上海江萊生物科技有限公司；RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒購自北京聚合美生物工程有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將消化好的RAW264.7細(xì)胞懸液加入細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)，加入5 mL含10% FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基、100 U·mL-1青霉素和100 μg·mL-1鏈霉素，細(xì)胞在37 ℃加濕培養(yǎng)箱中生長，培養(yǎng)箱中含有5% CO2，操作過程保持無菌，觀察細(xì)胞的狀態(tài)和成長情況，待細(xì)胞生長至對數(shù)生長期時，取生長狀態(tài)良好的細(xì)胞用于試驗。

1.3 試驗分組及處理

取對數(shù)生長期細(xì)胞，用胰酶消化制成細(xì)胞懸液，密度為5×104個·mL-1接種于24孔板。并將細(xì)胞分為對照組(Control)：正常培養(yǎng)24 h；炎癥模型組(LPS)：1 μg·mL-1的LPS作用24 h；Asp組：LPS+Asp，向培養(yǎng)液中加入濃度為150 μmol·L-1的Asp預(yù)處理細(xì)胞4 h，1 μg·mL-1的LPS作用24 h，Eug處理組：LPS+Eug，向培養(yǎng)液中加入濃度為150 μmol·L-1的Eug預(yù)處理細(xì)胞4 h， 1 μg·mL-1的LPS作用24 h；AEE處理組：LPS+AEE(低、中、高濃度)：向培養(yǎng)液中分別加入濃度為75、150、300 μmol·L-1的AEE預(yù)處理細(xì)胞4 h，1 μg·mL-1的LPS作用24 h；每組設(shè)5個重復(fù)。

1.4 細(xì)胞毒性試驗

細(xì)胞毒性試驗采用CCK-8法，在96孔板中接種細(xì)胞懸液(100 μL·孔-1)，將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)24 h；加入濃度為(5、15、45、75、100、150、300、350 μmol·L-1)的AEE溶液；將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱孵育24 h；向每孔加入10 μL的CCK-8溶液；將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h；用酶標(biāo)儀測定在450 nm處的吸光度，并計算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率(%)=[(As-Ab)/(Ac-Ab)]×100。

1.5 ELISA檢測TNF-α、IL-6、IL-8、IL-1β含量

取對數(shù)生長期RAW264.7細(xì)胞接種于48孔板中，細(xì)胞分組及處理方法同“1.3”，培養(yǎng)結(jié)束后，收集各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液，ELISA法檢測各組TNF-α、IL-6、IL-8、IL-1β含量，操作步驟按照試劑盒說明書。

1.6 RT-PCR法檢測COX-1、COX-2、5-LOX、PLA2和CYP450基因轉(zhuǎn)錄水平

取對數(shù)生長期RAW264.7細(xì)胞接種于24孔板中，細(xì)胞分組及處理方法同“1.3”，培養(yǎng)完成后，提取各組細(xì)胞總RNA，依試劑盒說明書操作方法，把mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，獲得的cDNA用于RT-PCR，檢測COX-1、COX-2、5-LOX、PLA2和CYP450基因的相對轉(zhuǎn)錄水平。PCR引物見表1，并選用了β-actin為內(nèi)參基因。RT-PCR的反應(yīng)條件是95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，循環(huán)40次；mRNA的相對轉(zhuǎn)錄量采用2-△△Ct方法計算。

表1 RT-PCR相關(guān)引物序列表

1.7 分子對接

應(yīng)用RCSB PDB(http://www.rcsb.org/)數(shù)據(jù)庫下載相關(guān)蛋白晶體結(jié)構(gòu)，保存為pdb格式，利用AutoDock 4.2.6軟件進(jìn)行分子對接，利用Pymol軟件進(jìn)行可視化處理，研究Asp、Eug、AEE與COX-1、COX-2、5-LOX、PLA2和CYP450蛋白的結(jié)合模式，根據(jù)得到的結(jié)合能(binding energy)值評價不同藥物和關(guān)鍵靶點之間的對接結(jié)果。

1.8 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS軟件進(jìn)行分析，統(tǒng)計分析采用組間單因素方差分析法(one-way AVOVA)，數(shù)據(jù)都以“Mean±SD”表示，P≤0.05時差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 AEE對RAW264.7細(xì)胞活力的影響

與空白對照組相比，CCK-8法檢測結(jié)果顯示，AEE處理對細(xì)胞生長沒有抑制作用，5、15、45、75、100、150、300、350 μmol·L-1處理細(xì)胞活力均在93%以上，且各組間沒有統(tǒng)計學(xué)差異(圖1)。在本試驗中，將150 μmol·L-1的AEE用于后續(xù)試驗，在此基礎(chǔ)之上，將低劑量確定為75 μmol·L-1，高劑量確定為300 μmol·L-1。為比較AEE、Asp、Eug之間區(qū)別，將與中劑量AEE等摩爾的Asp與Eug用于試驗。

圖1 AEE 對RAW264.7細(xì)胞活力的影響

2.2 AEE對LPS誘導(dǎo)的炎癥細(xì)胞因子的影響

ELISA結(jié)果表明，與空白對照組比較，LPS組中炎癥因子IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α表達(dá)極顯著升高(P<0.01)，表明炎癥模型造模成功。經(jīng)不同劑量AEE處理后能極顯著降低炎癥因子IL-1β、IL-8、TNF-α表達(dá)水平(P<0.01)；在炎癥因子IL-1β、IL-6、IL-8中，與Asp和Eug組比較，等摩爾的AEE與其無顯著差異(P>0.05)，表明其抗炎效果相似；不同劑量的AEE在炎癥因子IL-1β、IL-6、IL-8之間差異不顯著(P>0.05)，但中劑組AEE抗炎效果要優(yōu)于低劑量組和高劑量組(表2)。

表2 AEE對LPS誘導(dǎo)的TNF-α、IL-8、IL-6、IL-1β的影響

2.3 RT-PCR法檢測COX-1、COX-2、5-LOX、PLA2和CYP450基因轉(zhuǎn)錄水平

β-actin為內(nèi)參基因，RT-PCR檢測結(jié)果顯示(表3)，與空白對照組比較，LPS組中CYP450、PLA2、COX-2、COX-1和5-LOX表達(dá)極顯著升高(P<0.01)，表明炎癥模型造模成功。不同劑量的AEE處理能顯著降低AA代謝通路關(guān)鍵酶的mRNA表達(dá)量(P<0.05)；與ASP和Eug組比較，等摩爾量的AEE能夠顯著降低AA代謝通路關(guān)鍵酶PLA2的表達(dá)量(P<0.05)；不同劑量的AEE在COX-1、COX-2、5-LOX和CYP450關(guān)鍵酶表達(dá)量之間差異不顯著(P>0.05)。

表3 AEE對LPS誘導(dǎo)的COX-1、COX-2、5-LOX、PLA2和CYP450的影響

2.4 分子對接研究

利用AutoDock軟件進(jìn)行分子對接，AEE能與COX-1、COX-2、5-LOX、PLA2和CYP450形成結(jié)合位點，結(jié)合能分別為-39.25、-39.75、-38.87、-37.24、-32.90 kJ。所有的對接結(jié)果均小于-20.9 kJ(表4)。利用Pymol軟件對結(jié)果進(jìn)行可視化處理，AEE中的羥基與COX-1蛋白中的氨基酸530 SER形成常規(guī)氫鍵，鍵長為2.1 ?。AEE中的羥基與COX-2蛋白中的氨基酸530 SER、527 ALA形成常規(guī)氫鍵，鍵長范圍1.9～2.7 ?。AEE中的羥基與5-LOX蛋白中的氨基酸370 ARG、470 TYR、549 GLN形成常規(guī)氫鍵，鍵長范圍1.9～2.5 ?。AEE中的羥基與PLA2蛋白中的氨基酸62 LYS、47 HIS、29 GLY形成常規(guī)氫鍵，鍵長范圍2.0～2.3 ?。AEE中的羥基與CYP450蛋白中的氨基酸476 PHE、214 GLN、100 PHE形成常規(guī)氫鍵，鍵長范圍1.9～2.3 ?(圖2、3)。

表4 AEE化合物活性成分和靶蛋白對接結(jié)果

圖3 AEE與5-LOX(A)，COX-1(B)，COX-2(C)，PLA2(D)和CYP450(E)氫鍵示意圖

3 討 論

炎癥是對健康至關(guān)重要的防御機制，是免疫系統(tǒng)對有害刺激的反應(yīng)。通常，在炎癥反應(yīng)中，細(xì)胞和分子相互作用能有效地減少損傷感染。這一過程有助于組織穩(wěn)態(tài)的恢復(fù)和急性炎癥的解決。IL-1β是免疫病理中有效的促炎細(xì)胞因子，能誘導(dǎo)局部炎癥和中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的募集和激活[20-21]，TNF-α是在急性炎癥過程中產(chǎn)生的炎癥細(xì)胞因子，在細(xì)胞內(nèi)參與多種信號活動，導(dǎo)致細(xì)胞壞死或凋亡。近年來，研究發(fā)現(xiàn)TNF-α正在成為腫瘤治療的靶點[22-23]。IL-6能誘導(dǎo)B細(xì)胞分化和抗體產(chǎn)生，誘導(dǎo)T細(xì)胞增殖、活化，參與機體的免疫應(yīng)答，是炎性反應(yīng)的促進(jìn)劑。IL-8可以激活中性粒細(xì)胞并參與中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的組織損傷。炎癥因子是檢測各種疾病的重要標(biāo)志物，在許多炎癥疾病中，炎癥因子都會表現(xiàn)異常，因而降低炎癥因子的表達(dá)水平在炎癥疾病中發(fā)揮重要作用。

LPS刺激RAW264.7細(xì)胞是一種常見的細(xì)胞炎癥模型。RAW264.7細(xì)胞是一種巨噬細(xì)胞，是幾乎存在于所有組織中的重要免疫效應(yīng)細(xì)胞，不僅能清除細(xì)胞碎片，還釋放多種介質(zhì)，包括促炎酶、細(xì)胞因子等[24]。LPS可激活巨噬細(xì)胞并引發(fā)多種炎癥反應(yīng)，包括釋放促炎介質(zhì)和細(xì)胞因子，如TNF-α、IL-8和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)[25-26]。本研究發(fā)現(xiàn)，1 μg·mL-1的LPS處理細(xì)胞，誘導(dǎo)了細(xì)胞炎癥，證明了炎癥模型造模成功。前期，Xie等[25]采用1 μg·mL-1的LPS，誘導(dǎo)了RAW264.7細(xì)胞的炎癥和氧化應(yīng)激模型。Li等[27]采用同樣濃度的LPS誘導(dǎo)了RAW264.7細(xì)胞的炎癥模型。因此，本試驗炎癥模型建立成功，并且與前期研究結(jié)果相一致。

Liu等[28]研究發(fā)現(xiàn)，Asp治療可抑制炎癥早期LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞活化。Murakami等[29]報道，Eug相關(guān)化合物可能通過抑制核因子κB(NF-κB)的激活而發(fā)揮抗氧化和抗炎作用。在對AEE的前期研究中，通過小鼠耳腫脹模型、腹腔毛細(xì)血管通透性增高模型、小鼠足跖腫脹模型及肉芽腫模型評估了AEE的抗炎作用。相關(guān)結(jié)果表明，0.18 g·kg-1的AEE具有明顯的抗炎作用，其能顯著抑制耳腫脹度，降低毛細(xì)血管通透性，抑制足跖腫脹和肉芽腫增生[30]。本研究發(fā)現(xiàn)，Asp、Eug、AEE也有同樣的抗炎效果。ELISA檢測AEE對LPS誘導(dǎo)的炎癥細(xì)胞因子水平試驗中，不同劑量的AEE處理能極顯著降低炎癥因子IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α表達(dá)水平；與Asp和Eug組比較，等摩爾的AEE與其無顯著差異，表明其抗炎效果相當(dāng)。然而，比較平均值發(fā)現(xiàn)，AEE抗炎作用更強；不同劑量的AEE之間差異不顯著，但中劑量的AEE效果優(yōu)于低劑量組和高劑量組。

花生四烯酸是炎癥反應(yīng)的有效媒介，參與了多種疾病的發(fā)病過程，是COX、LOX和CYP450途徑產(chǎn)生前列腺素、白三烯和環(huán)氧二十碳三烯酸(EETs)的首選底物。這些途徑是治療炎癥、疼痛、過敏、哮喘、心血管疾病的藥物的靶點，最近還被用于抑制腫瘤相關(guān)炎癥。COX是前列腺素合成中的限速酶，其有兩種同工酶，即COX-1和COX-2。LOX酶在多種細(xì)胞中表達(dá)，它們具有多種生理功能，包括誘導(dǎo)炎癥、皮膚紊亂和腫瘤發(fā)生[31]。AA也是LOX產(chǎn)生白三烯和脂素的底物。CYP450產(chǎn)生兩種主要的二十碳烯類產(chǎn)物：由CYP環(huán)氧合酶形成的EETs和由CYP羥化酶形成的羥基二十碳四烯酸(HETE)[32]。相關(guān)研究表明，Asp是COX酶的非選擇性抑制劑，體內(nèi)外對COX-1和COX-2均有很好的抑制活性。Asp通過乙?；疌OX-2，將AA代謝成15(R)-羥基二十碳三烯酸，從而觸發(fā)脂氧素A4(LXA4)的產(chǎn)生[33]。在動脈中，LOX-5生物合成LXA4，在血小板中，LOX-12生物合成白三烯B4。炎癥期間，LXA4在血管腔和管壁內(nèi)形成，使這種脂質(zhì)處于調(diào)節(jié)血管功能的有利位置[34]。研究發(fā)現(xiàn)，酚類化合物對PLA2的表達(dá)有很好的抑制作用。Singh等[35]證實，Asp能和PLA2發(fā)生特異性的結(jié)合，對其具有一定的抑制作用。此外，Wen等[36]證實，給大鼠長期飼喂Asp，能夠增加大鼠肝線粒體的數(shù)量以及ALT和AST水平，引起CYP450的代謝活性改變；Asp具有抑制COX和LOX的作用，并能促進(jìn)抗炎脂氧蛋白A4的產(chǎn)生[37]。近來研究顯示，20-HETE下游信號通路激活的異常AA代謝與癌癥的發(fā)生存在一定聯(lián)系，為癌癥的化學(xué)預(yù)防和治療提供了新的分子靶點[38]。本試驗RT-PCR結(jié)果表明，不同劑量的AEE處理能顯著降低花生四烯酸代謝通路關(guān)鍵酶的mRNA表達(dá)量；與Asp和Eug組比較，等摩爾量的AEE能夠顯著降低花生四烯酸代謝通路關(guān)鍵酶PLA2的表達(dá)量，AEE的抗炎作用強于Asp；不同劑量的AEE之間差異不顯著；試驗結(jié)果表明，不同劑量的AEE處理對炎癥因子和花生四烯酸代謝通路關(guān)鍵酶值都有降低作用，AEE與Asp、Eug的作用相當(dāng)，同時不同劑量的AEE之間無統(tǒng)計學(xué)差異，但中劑量的AEE抗炎效果較好。

Balasundaram和David等[39]通過分子對接手段，研究Asp與PDE7B在神經(jīng)炎癥中的分子建模及對接分析。分子對接手段是一種基于受體特性以及受體與藥物分子相互作用的設(shè)計方法，廣泛應(yīng)用于藥物發(fā)現(xiàn)。最初，分子對接是為了幫助理解小分子和大分子之間的分子識別機制而開發(fā)的，可在分子水平上預(yù)測配體與受體的相互作用。經(jīng)過不斷的發(fā)展和完善，分子對接已廣泛應(yīng)用于藥物和靶蛋白相互作用的研究中，并在新藥研發(fā)領(lǐng)域有著重要作用。前期研究證實，分子與靶蛋白結(jié)合能越小，其結(jié)合能力越高[40]。在本研究中，通過分子對接探討Asp、Eug、AEE與AA代謝通路關(guān)鍵酶的相互作用，結(jié)果顯示，AEE與靶蛋白的結(jié)合能均低于-20.9 kJ，表明AEE與靶蛋白結(jié)合穩(wěn)定且質(zhì)量高。

4 結(jié) 論

本研究表明，AEE處理能夠抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞中炎癥因子IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α的表達(dá)水平，降低AA代謝通路關(guān)鍵酶COX-2、COX-1、PLA2、CYP450和5-LOX的mRNA表達(dá)量，且和靶蛋白結(jié)合能較低，具有良好的結(jié)合活性，推測AA代謝可能是其發(fā)揮抗炎作用的途徑。