韓春艷 賈婷 王炎 王政昆 朱萬(wàn)龍* 張浩*

（1 云南省高校西南山地生態(tài)系統(tǒng)動(dòng)植物生態(tài)適應(yīng)進(jìn)化及保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，昆明 650500）（2 云南經(jīng)濟(jì)管理學(xué)院，昆明 650106）

小型哺乳動(dòng)物為適應(yīng)環(huán)境變化需要調(diào)節(jié)形態(tài)和生理特征(Veloso and Bozinovic, 1993)，以此應(yīng)對(duì)晝夜溫差及季節(jié)變化帶來(lái)的脅迫(Guanet al.,2018)。其中動(dòng)物的毛色具有隱藏、交流和調(diào)節(jié)生理過(guò)程等功能，使其在偽裝、繁殖、環(huán)境適應(yīng)和疾病耐受性等方面具有競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)(Klungland and Vage,2000)。哺乳動(dòng)物的毛色形成主要與體內(nèi)黑色素細(xì)胞所產(chǎn)生的真黑素和棕黑素之間的化學(xué)轉(zhuǎn)換有關(guān)(Coneet al., 1996)，前者又包括黑色和褐色兩種色素類(lèi)型(Fontanesiet al.,2011)。黑素皮質(zhì)素受體1 (melanocortin 1 receptor,MC1R) 基因是調(diào)控黑色素合成的重要基因之一，它編碼最小的G 蛋白耦合受體家族，影響黑色素形成的種類(lèi)，進(jìn)而影響動(dòng)物的毛色，MC1R基因表達(dá)量越高，其動(dòng)物毛色越黑(Jiaet al., 2021)。遺傳物質(zhì)和外界環(huán)境條件均影響動(dòng)物毛色的形成(Macet al.,1996)。而哺乳動(dòng)物毛色的深淺程度除了與色素顆粒的數(shù)量、大小、形狀及排列方式有關(guān)外，也隨海拔、溫度、性別和年齡等因子而變化(張俊珍等，2006)。

不同地區(qū)分布的動(dòng)物，除了毛色發(fā)生變化來(lái)適應(yīng)環(huán)境，其生理指標(biāo)的變化也是重要的適應(yīng)對(duì)策，如動(dòng)物的能量代謝受海拔的影響，在高海拔低溫低氧條件下，動(dòng)物體內(nèi)褐色脂肪組織(brown adipose tissue, BAT) 中的解偶聯(lián)蛋白1 (uncoupling protein 1,UCP1)含量上升，UCP1 是分布在線粒體內(nèi)膜上唯一能在褐色脂肪組織中表達(dá)的一類(lèi)產(chǎn)熱蛋白(Aquilaet al., 1985; Bouillaudet al., 1985)，使BAT 活化，脂質(zhì)氧化分解增強(qiáng)，產(chǎn)熱增加，維持體溫，從而適應(yīng)低溫環(huán)境(Cunninghamet al.,1985)。動(dòng)物在面對(duì)高海拔低溫環(huán)境時(shí)，會(huì)增加UCP1含量促進(jìn)產(chǎn)熱(葉芳艷等，2016)。此外，動(dòng)物的血紅蛋白(hemoglobin，Hb)和肌紅蛋白(myo‐globin，Mb)含量可以反映動(dòng)物在高海拔低溫低氧環(huán)境下血液指標(biāo)的變化情況，一般高海拔地區(qū)動(dòng)物的Hb 和Mb 含量高于低海拔地區(qū)(Vaibhavet al.,2021)。Hb 是紅細(xì)胞的運(yùn)輸?shù)鞍祝瑢?duì)氧的結(jié)合、貯存、運(yùn)輸、釋放具有重要的生理作用(Liet al.,2019; Nummelaet al., 2021)；Mb 是一種含血紅素的氧結(jié)合蛋白，存在于心肌和其他肌肉組織中，具有儲(chǔ)氧和輸氧功能(Astrandet al.,2010)。Mb 對(duì)氧的親和力是Hb 的6 倍(Ayeret al., 1971; Jay,2007)，是研究高原低氧適應(yīng)生理機(jī)制的重要內(nèi)容(Veloso and Bozinovic,1993)。在面臨高海拔低溫環(huán)境時(shí)，動(dòng)物的Hb 和Mb 含量、濃度、pH 會(huì)發(fā)生變化(Christoforides and Hedley-Whyte, 1969)；研究表明人類(lèi)和動(dòng)物在高海拔缺氧條件下，Hb 和Mb含量會(huì)升高，但高原世居動(dòng)物的Hb 和Mb 含量則不變，可能是由于長(zhǎng)期處于高海拔地區(qū)，已形成一定的適應(yīng)特性(李雪等，2019)。以上研究結(jié)果表明形態(tài)和生理指標(biāo)都會(huì)隨著海拔和溫度的變化而發(fā)生變化，因此這些指標(biāo)變化對(duì)于動(dòng)物適應(yīng)高海拔環(huán)境具有重要的意義。

橫斷山位于中國(guó)西南部，干濕季分明，立體氣候顯著(龔正達(dá)等， 2001)。橫斷山脈由于走向、地理位置的特殊性，使生存在此區(qū)域的生物逐漸進(jìn)化出非常特殊的適應(yīng)性，成為生理生態(tài)學(xué)研究的熱點(diǎn)地區(qū)(王政昆等，2015)。大絨鼠(Eo‐thenomys miletus) 屬于嚙齒目(Rodentia) 倉(cāng)鼠科(Cricetidae) 田鼠亞科(Microtinae) 絨鼠屬(Eothe‐nomys)，是我國(guó)的特有種，廣泛分布于橫斷山區(qū)及其附近區(qū)域(鄭紹華，1993)，營(yíng)地表淺層洞道生活，多在夜間活動(dòng)，活動(dòng)能力較弱，主要以草和鮮嫩的植物根部和莖部為食物(羅澤珣等，2000)。韓春艷等(2021)的研究表明在冬季分布于橫斷山不同海拔的大絨鼠體重和血清瘦素含量均隨海拔升高而逐漸降低，但肝臟重量、下丘腦神經(jīng)肽NPY 和AgRP 含量有升高趨勢(shì)，說(shuō)明不同海拔分布的大絨鼠在生理適應(yīng)策略上已經(jīng)表現(xiàn)出地區(qū)差異。但是大絨鼠為了適應(yīng)橫斷山不同環(huán)境條件，其毛色變化和產(chǎn)熱相關(guān)的生化指標(biāo)變化還不清楚。因此為了研究不同海拔是否會(huì)引起大絨鼠毛色基因MC1R表達(dá)量及UCP1、Hb 和Mb 含量的變化，本研究在冬季于橫斷山區(qū)自北向南分別采集德欽、香格里拉、麗江、劍川和哀牢山5 個(gè)不同地區(qū)的大絨鼠，比較其毛色MC1R基因表達(dá)量及UCP1、Hb 和Mb 含量的地區(qū)差異，最終來(lái)闡明大絨鼠對(duì)橫斷山區(qū)不同海拔和溫度的適應(yīng)策略。

1 研究方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物于2019 年冬季捕獲，均為非繁殖期的健康成年個(gè)體。捕獲地自北向南依次為：德欽、香格里拉、麗江、劍川和哀牢山(表1)。

表1 橫斷山區(qū)大絨鼠采樣點(diǎn)Table 1 Features of the sampling site in E. miletus from Hengduan Mountain regions

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處理

野外樣本捕捉后，就地麻醉處死，對(duì)5個(gè)地區(qū)大絨鼠進(jìn)行毛色拍照，采集大絨鼠血清、1 cm2的皮膚、分離肩胛間及頸部?jī)蓚?cè)的BAT，去掉白色脂肪組織(white adipose tissue,WAT)保存于凍存管中，用干冰保存送至云南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院動(dòng)物生理生態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)室，置于-80℃超低溫冰箱內(nèi)保存，用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1MC1R基因部分序列的分析

總RNA 的提取和純化按照Lifetech 公司貨號(hào)為15596026 的Trizol Reagent 試劑盒提供的方法進(jìn)行。用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA 純度和完整性，RNA 于-80℃冰箱保存。cDNA 第一鏈的合成以總RNA 為模板，以天根生化有限公司貨號(hào)為KR116 FastKing RT Kit (With gDNase)FastKing cDNA 第一鏈合成試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增，按說(shuō)明書(shū)加樣后進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)完畢后，于-20℃冰箱保存。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction, PCR) 引物設(shè)計(jì)與擴(kuò)增，根據(jù)大鼠MC1R基因序列的保守區(qū)域利用primer5.0 設(shè)計(jì)引物，由昆明碩陽(yáng)科技有限公司合成。設(shè)計(jì)的引物長(zhǎng)度為200 bp，前引物序列為MC1R-F：CTCCA CGGACTGCTTCCTAC，后引物序列為MC1R-R：GAGTGCAGGTTGCGGTTTTT。根 據(jù)Lifetech 公司的貨號(hào)APPCR50PCR 清潔試劑盒，對(duì)先前反轉(zhuǎn)錄的RNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.3.2MC1R基因在不同地區(qū)大絨鼠中的表達(dá)

1.3.2.1 熒光定量引物的設(shè)計(jì)

根據(jù)大鼠MC1R基因氨基酸序列的保守區(qū)域利用primer5.0 設(shè)計(jì)引物軟件設(shè)計(jì)目的基因和內(nèi)參基因引物序列，由昆明碩陽(yáng)科技有限公司合成。設(shè)計(jì)的內(nèi)參引物長(zhǎng)度為250 bp，前引物序列為MC1R-F：GAAGGTCGGTGTGAACGGAT，后引物序列為MC1R-R：CCCATTTGATGTTAGCGGGAT。擴(kuò)增后MC1R基因片段為約200 bp。

1.3.2.2 熒光定量檢測(cè)基因的表達(dá)量

采用ABI-7000TM 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)儀(fluorescence quantitative polymerase chain re‐action，F(xiàn)Q-PCR) 擴(kuò)增模板cDNA，并檢測(cè)熒光信號(hào)。按SYBR Green realmastermix Mix 試劑盒說(shuō)明配置FQ-PCR 反應(yīng)體系，并進(jìn)行測(cè)定，詳見(jiàn)文獻(xiàn)(Zhuet al.,2017)。

1.3.3 酶聯(lián)免疫分析法(ELISA) 測(cè)定UCP1、Hb和Mb含量

采用和大絨鼠親緣關(guān)系較近的小鼠ELISA試劑盒(上海滬宇公司) 測(cè)定相關(guān)指標(biāo)。小鼠解偶聯(lián)蛋白1 (UCP1) ELISA 試劑盒測(cè)定大絨鼠肩胛間BAT 中的UCP1 含量，其批內(nèi)變異系數(shù)與批間變異系數(shù)應(yīng)分別小于10%和15%，檢測(cè)范圍：62.5~2 000 pg/mL，靈敏度：最低檢測(cè)濃度小于10 pg/mL。用小鼠血紅蛋白(Hb)ELISA試劑盒測(cè)定大絨鼠血清中血紅蛋白含量，其批內(nèi)變異系數(shù)與批間變異系數(shù)應(yīng)分別小于10%和15%，檢測(cè)范圍：10~320 g/L，靈敏度：最低檢測(cè)濃度小于1.0 g/L。用小鼠肌紅蛋白(Mb) ELISA 試劑盒測(cè)定大絨鼠血液中肌紅蛋白含量，其批內(nèi)變異系數(shù)與批間變異系數(shù)應(yīng)分別小于10%和15%，檢測(cè)范圍：1.5~48 ng/mL，靈敏度：最低檢測(cè)濃度小于0.1 ng/mL。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行分析，所有數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布。不同性別大絨鼠的測(cè)定指標(biāo)差異不顯著，故統(tǒng)計(jì)分析時(shí)合并使用。5 個(gè)地區(qū)大絨鼠的毛色基因MC1R的表達(dá)量及UCP1、Hb 和Mb 含量差異均采用單因素方差分析(One-way ANOVA)進(jìn)行分析，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SE)表示，其中P<0.05 為差異顯著，P<0.01 為差異極顯著。FQ-PCR 的實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用CT 值法(2-△△Ct法)進(jìn)行分析，計(jì)算公式見(jiàn)(Zhu and Yang,2016)。

2 結(jié)果

2.1 MC1R基因的表達(dá)量和毛色變化

毛色基因MC1R擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，成功擴(kuò)增出MC1R基因約200 bp。結(jié)果顯示，MC1R基因表達(dá)量在不同地區(qū)的大絨鼠皮膚中具有顯著差異(F4,24=5.158,P=0.049,圖1)，其中哀牢山和劍川地區(qū)的大絨鼠MC1R基因表達(dá)量顯著高于麗江、香格里拉和德欽地區(qū)，哀牢山和劍川MC1R基因表達(dá)量較其他3 個(gè)地區(qū)高262.71%。哀牢山和劍川地區(qū)的大絨鼠毛色相對(duì)于其他3 個(gè)地區(qū)較深，與MC1R基因表達(dá)量變化趨勢(shì)一致(圖2)。

圖1 MC1R的相對(duì)表達(dá)量. 柱上不同字母表示組間差異顯著(P<0.05)Fig. 1 Relative expression of MC1R. Different letters on the column indicate significant differences among different groups(P<0.05).ALS:AilaoMountain;JC:Jianchuan;LJ:Lijiang;XGLL:Shangri-la;DQ:Deqin

圖2 五個(gè)地區(qū)大絨鼠的毛色對(duì)照?qǐng)DFig.2 Comparison of coat color in E.miletus of five regions. ALS:Ailao Mountain;JC:Jianchuan;LJ:Lijiang;XGLL:Shangri-la;DQ:Deqin

2.2 UCP1、Hb和Mb含量

冬季5 個(gè)地區(qū)大絨鼠肩胛間BAT 中的UCP1含量差異極顯著(F4,25= 4.785,P =0.005, 圖3A)，德欽和香格里拉地區(qū)的UCP1 含量較哀牢山、劍川和麗江3 個(gè)地區(qū)高14.45%。冬季5 個(gè)地區(qū)大絨鼠Hb 含量差異不顯著(F4,24= 1.123,P= 0.369, 圖3B)，其中德欽地區(qū)的Hb 含量較哀牢山地區(qū)高40.53%。但是冬季5 個(gè)地區(qū)大絨鼠Mb 含量差異極顯著(F4,24= 2.717,P= 0.042,圖3C)，德欽和香格里拉地區(qū)的肌紅蛋白含量顯著高于哀牢山、劍川和麗江3個(gè)地區(qū)達(dá)17.65%。

圖3 五個(gè)地區(qū)大絨鼠肩胛間BAT中的UCP1含量、血紅蛋白含量、肌紅蛋白含量變化. 柱上不同字母表示組間差異顯著(P<0.05)Fig. 3 Variations of UCP1 of interscapular BAT,Hb and Mb contents in E.miletus from five regions. Different letters on the column indicate significant differences among different groups (P< 0.05). ALS:Ailao Mountain;JC:Jianchuan;LJ:Lijiang;XGLL:Shangri-la;DQ:Deqin

3 討論

小型哺乳動(dòng)物為適應(yīng)不同環(huán)境條件，形態(tài)和生理特征會(huì)隨著海拔、溫度以及食物發(fā)生變化(Voltura and Wunder,1998)。如美洲兔(Lepusameri‐canus) 和北極狐(Vulpes lagopus) 等在嚴(yán)酷的、季節(jié)性很強(qiáng)的環(huán)境中進(jìn)行換毛，由冬季的白色被毛變?yōu)橄募镜淖厣幻?，以此?lái)更好地適應(yīng)環(huán)境(Marketaet al., 2018)。韓春艷等(2021) 的研究表明冬季橫斷山不同地區(qū)的大絨鼠通過(guò)改變體重、器官重量、血清瘦素含量和下丘腦神經(jīng)肽相對(duì)表達(dá)量，適應(yīng)該地區(qū)不同的環(huán)境變化。MC1R基因不僅能改變毛色表型，還與動(dòng)物行為等有關(guān)(封竣淇等，2017)。本研究結(jié)果表明MC1R基因在不同地區(qū)大絨鼠皮膚中的表達(dá)具有顯著差異，其中哀牢山和劍川地區(qū)的大絨鼠MC1R基因表達(dá)量顯著高于麗江、香格里拉和德欽地區(qū)。大絨鼠為適應(yīng)哀牢山和劍川地區(qū)相對(duì)海拔較低、溫度較高、植被豐富、土壤呈灰褐色的環(huán)境(劉醒華等，1981) 和躲避天敵，而加深毛色進(jìn)行更好地隱藏；相對(duì)海拔較高的麗江、香格里拉和德欽地區(qū)植被稀疏，土壤呈紅棕色(劉醒華等，1981)，因此這3 個(gè)地區(qū)大絨鼠MC1R基因的相對(duì)表達(dá)量較低。有研究表明動(dòng)物在溫度和濕度較高的環(huán)境條件下毛色較深(Jinet al., 2020)，且MC1R基因的差異表達(dá)會(huì)引起動(dòng)物毛色的變化，如雞、狗、狐貍、鼠等(Nowacka-Woszuket al., 2014)。黑色綿羊(Ovis aries)MC1R基因的表達(dá)量顯著高于白色綿羊，原因可能是MC1R基因會(huì)激活色素合成過(guò)程中相關(guān)的限速酶酪氨酸酶相關(guān)蛋白(Tyrosinase-related Protein, TYR)基因，當(dāng)TYR被激活時(shí)能夠合成更多黑色素，從而使黑色綿羊產(chǎn)生深色的被毛(薛麗娜等，2021)。本研究2 個(gè)低海拔地區(qū)大絨鼠的毛色較深(圖2)，MC1R基因表達(dá)量增加顯著，與其他動(dòng)物MC1R基因表達(dá)量的結(jié)果相符，說(shuō)明大絨鼠的毛色和橫斷山不同地區(qū)的環(huán)境變化有關(guān)。

UCP1 是小型哺乳動(dòng)物適應(yīng)低溫的重要生理特征(Golozoubovaet al., 2001)。研究表明冷馴化誘導(dǎo)BAT組織增生和UCP1表達(dá)上調(diào)，從而增強(qiáng)BAT產(chǎn)熱活力以增加能量支出(Houet al.,2021)。本研究中冬季5 個(gè)地區(qū)大絨鼠的UCP1 含量差異極顯著，德欽和香格里拉地區(qū)的UCP1 含量顯著高于哀牢山、劍川和麗江，和冷馴化條件下大絨鼠UCP1含量上升結(jié)果一致(葉芳艷等，2016)，說(shuō)明大絨鼠在低溫條件下可通過(guò)增加UCP1 的含量來(lái)抵抗高海拔低溫帶來(lái)的脅迫，從而更好地適應(yīng)不同海拔和溫度的環(huán)境。Hb 是紅細(xì)胞的組成部分，主要功能是在肺內(nèi)進(jìn)行氧氣和二氧化碳的交換，將氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)運(yùn)送到全身各個(gè)組織(Storz and Jay,2007)。溫度作為血紅蛋白的一個(gè)重要變構(gòu)因子，其微小變化即可引起血紅蛋白分子結(jié)構(gòu)、濃度、功能的顯著改變(雷健明等，2012)。本文中，雖然不同海拔5 個(gè)地區(qū)大絨鼠Hb 含量差異不顯著，但是高海拔低溫地區(qū)的大絨鼠血紅蛋白含量還是比低海拔地區(qū)的高，說(shuō)明高海拔低溫地區(qū)的大絨鼠為了適應(yīng)低溫，需要增加氧氣的運(yùn)輸儲(chǔ)存，從而增加代謝能力維持體溫。Mb 是哺乳動(dòng)物細(xì)胞儲(chǔ)存和分配氧的蛋白質(zhì)，是動(dòng)物適應(yīng)高海拔環(huán)境的重要生理指標(biāo)(Maet al., 2014)。在本文中橫斷山不同海拔地區(qū)大絨鼠的Mb 差異顯著，高海拔德欽和香格里拉地區(qū)的Mb 含量顯著高于哀牢山、劍川和麗江地區(qū)，說(shuō)明高海拔低氧地區(qū)大絨鼠為適應(yīng)環(huán)境，而增加Mb 含量，有利于儲(chǔ)存運(yùn)輸大量氧氣，為其維持較高代謝率提供保證。此外，Mb 對(duì)氧的親和力是Hb 的6 倍(Ayeret al., 1971)，所以相比Hb 含量，Mb 含量在不同海拔地區(qū)間反應(yīng)更為明顯。小型哺乳動(dòng)物在面對(duì)高海拔低氧環(huán)境時(shí)表現(xiàn)出不同血液指標(biāo)的適應(yīng)策略，如高原鼢鼠(Eospa‐lax baileyi) 和甘肅鼢鼠(Eospalax cansus) 均表現(xiàn)Mb 和Hb 含量升高(魏登邦和魏蓮，2001；潘巧琳等，2015)，和大絨鼠適應(yīng)高海拔低氧環(huán)境的結(jié)果相符；但高原鼠兔(Ochotona curzniae)的Mb和Hb含量降低(王福寧等，2015)，通過(guò)比較這幾種小型哺乳動(dòng)物，發(fā)現(xiàn)不同地區(qū)的不同小型哺乳動(dòng)物適應(yīng)環(huán)境存在種屬特異性。

綜上所述，冬季5 個(gè)地區(qū)的大絨鼠通過(guò)改變MC1R的表達(dá)量來(lái)改變毛色以適應(yīng)橫斷山不同的植被和土壤環(huán)境，通過(guò)改變UCP1、Mb 含量來(lái)增加產(chǎn)熱能力以適應(yīng)高海拔低溫環(huán)境，最終通過(guò)整合形態(tài)和重要的生理指標(biāo)來(lái)適應(yīng)橫斷山冬季不同海拔的多樣化環(huán)境。