鄒立思，李會(huì)偉，嚴(yán)輝*，趙雪琴，郭盛，宿樹(shù)蘭，康宏杰，段金廒

1.南京中醫(yī)藥大學(xué) 江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過(guò)程協(xié)同創(chuàng)新中心/中藥資源產(chǎn)業(yè)化與方劑創(chuàng)新藥物國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心/國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥資源循環(huán)利用重點(diǎn)研究室/江蘇省方劑高技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210023；2.寧夏枸杞創(chuàng)新中心，寧夏 銀川 750002

枸杞葉為茄科植物寧夏枸杞Lycium barbarumL.、枸杞L.ChinenseMill.的干燥葉，始載于《名醫(yī)別錄》，具有補(bǔ)虛益精、清熱明目的功效，主治虛勞發(fā)熱、煩渴、目赤昏痛、障翳夜盲、崩漏帶下、熱毒瘡腫[1]227。有研究表明，枸杞葉中富含多糖類、多酚類、甜菜堿、維生素及多種微量元素等資源性化學(xué)成分[2-5]，具有抗氧化、抗疲勞、降血糖、調(diào)血脂、抗癌等多種生物活性[6-9]。寧夏枸杞葉的活性成分在種類上與寧夏枸杞果實(shí)基本一致，部分成分含量甚至高于寧夏枸杞果實(shí)，展現(xiàn)出較好的資源價(jià)值和應(yīng)用前景[2]。

枸杞葉作為寧夏地方特色藥材和飲片收載于《寧夏中藥材標(biāo)準(zhǔn)》[10]、《寧夏中藥飲片炮制規(guī)范》[11]，名為枸杞茶，在相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)中僅涉及部分性狀及顯微特征描述，尚缺乏系統(tǒng)的生藥學(xué)研究。因此，本研究以寧夏枸杞葉為研究對(duì)象，從原植物形態(tài)、藥材性狀和微性狀特征、顯微特征等方面入手，開(kāi)展其生藥學(xué)研究，并建立其薄層色譜鑒定及主要成分含量測(cè)定方法，為寧夏枸杞葉新資源藥材的開(kāi)發(fā)利用提供重要參考，同時(shí)也為寧夏枸杞葉藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

EOS 70D型、EF 100 mm f/2.8 USM型單鏡頭反光式數(shù)碼相機(jī)（佳能株式會(huì)社）；Eclipse E100 型生物顯微鏡（尼康株式會(huì)社）；0030 型高溫烘箱（蘇州巨興烘箱設(shè)備有限公司）；KD-3368AM 型切片機(jī)（金華市科迪儀器設(shè)備有限公司）；2695 Alliance 型高效液相色譜系統(tǒng)（含四元泵溶劑系統(tǒng)、在線脫氣機(jī)和自動(dòng)進(jìn)樣器）、2424 型蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（ELSD）、EmpowerTM色譜工作站軟件（美國(guó)Waters公司）；ATS4-192264型薄層掃描儀（全自動(dòng)點(diǎn)樣儀、ADS2-192020 型全自動(dòng)展開(kāi)儀、Visualizer-192142 型數(shù)碼成像系統(tǒng)，瑞士Camag 公司）；BT125D 型電子分析天平（塞多利斯公司）；Milli-Q 型超純水制備儀（Milli-Pore 公司）；KQ-250E 型超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）；Anke GL-16GⅡ型離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）。

1.2 試劑

對(duì)照品甜菜堿（批號(hào)：1125A022，純度＞98%，北京索萊寶科技有限公司）；對(duì)照品蘆?。ㄅ?hào)：Y24F11Y17051，純度＞98%，上海源葉生物科技有限公司）；對(duì)照品綠原酸（批號(hào)：110753-202018，純度≥96.1%，國(guó)家食品藥品檢定研究院）；分析純甲醇、乙酸丁酯（南京化學(xué)試劑有限公司）；分析純甲酸、色譜純乙腈、色譜純甲酸（德國(guó)Merck 公司）；硅膠G 薄層色譜板（批號(hào)：HX383895，德國(guó)Merck公司）；超純水為實(shí)驗(yàn)室自制。

1.3 樣品

20 批寧夏枸杞葉樣品于2017 年7 月分別采集于內(nèi)蒙古、寧夏、甘肅、青海等區(qū)域，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)段金廒教授鑒定均為寧夏枸杞Lycium barbarumL.的葉，樣品信息見(jiàn)表1。樣品收集后，晾干，粉碎，過(guò)40目篩，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 枸杞樣品信息

2 方法

2.1 性狀鑒別

結(jié)合文獻(xiàn)對(duì)寧夏枸杞原植物、藥材性狀特征進(jìn)行描述和圖片拍攝[10-11]。取寧夏枸杞葉藥材浸泡至葉片舒展，采用徒手切片法制片，在10 倍鏡下觀察，并旋轉(zhuǎn)粗、細(xì)準(zhǔn)焦螺旋調(diào)至拍攝部位清晰，拍攝藥材表面照片并記錄其微觀性狀特征。

2.2 顯微特征鑒別

選取寧夏枸杞新鮮葉片的中間葉脈外延部位并修整，于FAA 固定液（50%乙醇90 mL、甲醛5 mL、冰乙酸5 mL）中固定12 h，固定后的材料依次置于體積分?jǐn)?shù)分別為70%、80%、90%、95%和100%的乙醇中脫水1 h，脫水后的材料經(jīng)二甲苯溶液透明后浸蠟包埋，蠟塊用石蠟切片機(jī)切成厚度約為15 μm的蠟帶，選取較好的單個(gè)放于載玻片中間位置，放置溫箱中5 h 后，用二甲苯進(jìn)行脫蠟，而后采用番紅-固綠進(jìn)行二重染色，使用無(wú)水乙醇脫水。用中性樹(shù)膠封片。封好的切片放于烤箱干燥12 h 以上；取寧夏枸杞的新鮮葉片，用鑷子分別撕取上下表皮制作成水裝片；通過(guò)水合氯醛透化和稀甘油裝片法制作寧夏枸杞葉藥材粉末裝片。利用光學(xué)顯微鏡觀察制片各部位組織結(jié)構(gòu)及特征，拍攝組織顯微照片，記錄其顯微特征及數(shù)據(jù)。

2.3 薄層色譜鑒別

2.3.1對(duì)照品溶液的制備 分別取對(duì)照品蘆丁、綠原酸適量，精密稱定，分別加甲醇制成質(zhì)量濃度為1 mg·mL-1的對(duì)照品溶液。

2.3.2供試品溶液的制備 取枸杞葉樣品粉末（過(guò)四號(hào)篩）2.0 g，加入甲醇20 mL，靜置30 min，超聲30 min，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0 mL 使溶解，溶液用石油醚（60～90 ℃）振搖提取2 次，每次10 mL，棄去石油醚液，水液用正丁醇萃取2次，每次10 mL，合并正丁醇液，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL溶解，作為供試品溶液。

2.3.3薄層色譜鑒別 參照《中華人民共和國(guó)藥典》（以下簡(jiǎn)稱《中國(guó)藥典》）2020 年版（四部）通則0502 薄層色譜法[12]，吸取供試品溶液和蘆丁、綠原酸對(duì)照品溶液2～5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以乙酸丁酯-甲酸-水（7∶4∶2.5）的上層溶液為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以3%三氯化鋁乙醇試液，待乙醇揮干后，置紫外光燈（365 nm）下檢視，供試品色譜中，在與2 種對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。

2.4 含量測(cè)定

2.4.1色譜條件及系統(tǒng)適用性 色譜柱：GRACE Prevail Carbohydrate ES型色譜柱（250 mm×2.1 mm，5 μm）；流動(dòng)相：水（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～7 min，25%A；7～17 min，25%～45%A；17～18 min，45%～25%A；18～20 min，25%A）；流速：1 mL·min-1；柱溫25 ℃；進(jìn)樣體積：5 μL；ELSD 條件：漂移管溫度：80 ℃，載氣流量：2.5 L·min-1。色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 寧夏枸杞葉樣品及甜菜堿對(duì)照品HPLC-ELSD圖

2.4.2對(duì)照品溶液的制備 精密稱取干燥至恒重的甜菜堿對(duì)照品適量，加入超純水配制成質(zhì)量濃度為1.6 mg·mL-1的對(duì)照品儲(chǔ)備液，在4 ℃條件下貯藏。

2.4.3供試品溶液的制備 取各樣品粉末約0.5 g，精密稱定，置于50 mL具塞錐形瓶中，精密加入超純水20 mL，55 ℃超聲（250 W，40 kHz）提取60 min，加水補(bǔ)足減失質(zhì)量，搖勻，10 638×g離心10 min，取上清液，經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液即得供試品溶液。

2.4.4方法學(xué)考察

2.4.4.1線性關(guān)系考察與檢出限 取適量體積的甜菜堿儲(chǔ)備液稀釋后，加純水溶解制成質(zhì)量濃度為1.603 mg·mL-1的對(duì)照品儲(chǔ)備液，加水依次稀釋成1.603 0、1.282 0、0.961 8、0.641 2、0.320 6、0.160 3 mg·mL-1系列質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液，分別按2.4.1項(xiàng)下條件進(jìn)樣分析，以對(duì)照品質(zhì)量為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y=3×106X-3×106（r=0.997 2），線性范圍為1.6～16.0 μg。并分別在信噪比（S/N）為3 和10時(shí)測(cè)定相應(yīng)的檢測(cè)限（LOD）和定量限（LOQ），分別為0.17、0.33 ng·mL-1。

2.4.4.2精密度試驗(yàn) 取對(duì)照品溶液，按照2.4.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，峰面積的RSD 為1.12%，表明精密度良好。

2.4.4.3重復(fù)性試驗(yàn) 取枸杞葉樣本（S20）6 份，每份0.5 g，平行制備供試品溶液，分別按2.4.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，分析6 份樣品含量的RSD 為2.09%，表明重復(fù)性良好。

2.4.4.4穩(wěn)定性試驗(yàn) 取枸杞葉樣本（S20），分別于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果表明，峰面積的RSD為1.27%，表明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.4.5加樣回收率試驗(yàn) 取枸杞葉樣本（S20）6份，精密稱定，加入與樣品中含量等量的對(duì)照品，按2.4.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，計(jì)算回收率和RSD。結(jié)果表明，回收率為95.23%～105.83%，RSD 為5.26%，表明回收率良好。

2.4.5含量測(cè)定 取供試品溶液，按2.4.1項(xiàng)下色譜條件依次進(jìn)樣分析，測(cè)定峰面積，計(jì)算甜菜堿的含量。

3 結(jié)果

3.1 植物形態(tài)

野生寧夏枸杞為落葉灌木，人工栽培者呈樹(shù)狀大灌木。栽培者高0.8～2 m，莖粗者直徑達(dá)10～20 cm；小枝弓曲而樹(shù)冠多呈圓形，有縱棱紋，灰白色或灰黃色，無(wú)毛而微有光澤，有不生葉的短棘刺和生葉、花的長(zhǎng)棘刺。葉互生或簇生，披針形或長(zhǎng)橢圓狀披針形，頂端短漸尖或急尖，基部楔形，略帶肉質(zhì)，葉脈不明顯?；ㄔ陂L(zhǎng)枝上1～2 朵生于葉腋，在短枝上2～6 朵同葉簇生；花梗長(zhǎng)1～2 cm，向頂端漸增粗?；ü诼┒窢睿陷郎?。漿果紅色或橙色，果皮肉質(zhì)，多汁液，廣橢圓狀、矩圓狀、卵狀或近球狀。種子略呈腎臟形，扁壓，棕黃色?；ü谳^長(zhǎng)。寧夏枸杞原植物、長(zhǎng)枝及花、新鮮葉分別見(jiàn)圖2～4。

圖2 寧夏枸杞原植物

圖3 寧夏枸杞長(zhǎng)枝及花

圖4 寧夏枸杞新鮮葉

3.2 性狀

3.2.1性狀鑒別 寧夏枸杞葉呈狹披針形或披針形，偶有倒卵形，略皺縮，長(zhǎng)1.8～6.0 cm，寬0.5～1.0 cm，上表面黃綠色，下表面淺綠色，均不見(jiàn)毛。頂端短漸尖、急尖或圓鈍，基部楔形，葉肉稍下延，全緣，主脈向下稍隆起，側(cè)脈不明顯，質(zhì)脆，葉柄長(zhǎng)0.3～0.5 cm，略呈綠褐色（圖5）。氣微，味淡。

圖5 寧夏枸杞葉藥材形態(tài)

3.2.2微性狀鑒別 寧夏枸杞葉上表面有深縱溝，中脈下陷，葉脈上偶見(jiàn)短小腺毛分布，葉柄及葉肉下延部分的邊緣呈半透明狀，骨白色；葉下表面有淺縱溝，突起的中脈表面有多數(shù)斷續(xù)的細(xì)縱棱，其橫切面的下表面呈圓鋸齒狀。短小腺毛在葉柄上表面較密，下表面偶見(jiàn)，呈小棒槌狀，黃棕色（圖6）。

圖6 寧夏枸杞葉藥材微性狀特征

3.3 顯微特征

3.3.1葉橫切面特征 上表皮和下表皮細(xì)胞各1列，類方形；表皮細(xì)胞外側(cè)平周壁呈角質(zhì)化，中脈及葉邊緣處的表皮細(xì)胞角質(zhì)層呈細(xì)齒狀。上、下表皮偶見(jiàn)短小腺毛。葉肉組織不分化，均為柵欄組織，不通過(guò)中脈；上表皮下方1 列柵欄組織較為明顯，排列較密，其余柵欄組織不明顯，細(xì)胞間隙大且多。葉肉組織中可見(jiàn)草酸鈣砂晶囊及砂晶，偶見(jiàn)簇晶和方晶。中脈下方突出，維管束雙韌型，近上表皮處具厚角組織（圖7～8）。

圖7 寧夏枸杞葉橫切面顯微組織

圖8 寧夏枸杞葉橫切面顯微特征

3.3.2葉表面特征 表皮細(xì)胞較大，排列緊密。上表皮細(xì)胞多角形，垂周壁平直或略彎曲；下表皮細(xì)胞不規(guī)則形，垂周壁彎曲。下表皮氣孔分布較上表皮密集，以不定式氣孔為主，偶見(jiàn)不等式。上表皮氣孔保衛(wèi)細(xì)胞長(zhǎng)40～50 μm，寬11～15 μm；下表皮氣孔保衛(wèi)細(xì)胞長(zhǎng)36～51 μm，寬12～15 μm，均為腎形，含有大量葉綠體，副衛(wèi)細(xì)胞3～5個(gè)（圖9）。

圖9 寧夏枸杞葉表面顯微特征

3.3.3粉末特征鑒別 淡綠色。草酸鈣砂晶散在，或存在于葉肉組織中，形成草酸鈣砂晶囊。上表皮細(xì)胞表面觀呈多角形，垂周壁平直或彎曲；下表皮細(xì)胞不規(guī)則形，垂周壁彎曲；上下表皮均有氣孔，以不定式為主，偶不等式，副衛(wèi)細(xì)胞常3～5 個(gè)。有環(huán)紋導(dǎo)管，直徑8～12 μm。纖維（葉柄）多成束存在（圖10）。

圖10 寧夏枸杞葉藥材粉末顯微特征

3.4 薄層色譜鑒別

采用《中國(guó)藥典》2020 年版（四部）薄層色譜法對(duì)藥材進(jìn)行薄層色譜鑒別試驗(yàn)，通過(guò)CAMAG 攝影系統(tǒng)拍攝照片。

以蘆丁和綠原酸為對(duì)照品，置紫外燈（365 nm）下觀察；樣品色譜中在與蘆丁對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，均顯黃色熒光斑點(diǎn)，在與綠原酸對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，均顯藍(lán)色熒光斑點(diǎn)，比移值（Rf）為0.4～0.6，見(jiàn)圖11。

圖11 寧夏枸杞葉藥材的薄層色譜圖

3.5 甜菜堿含量測(cè)定

枸杞葉各樣品測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果表明，20批寧夏枸杞葉中甜菜堿平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4.856%。按照藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制訂通用要求，參照本研究20 批不同產(chǎn)地樣品檢測(cè)結(jié)果，將寧夏枸杞葉藥材中甜菜堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)擬定為不低于3.90%，20 批寧夏枸杞葉藥材全部符合此標(biāo)準(zhǔn)。

表2 不同產(chǎn)地寧夏枸杞葉中甜菜堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)（， n=3）mg·g-1

表2 不同產(chǎn)地寧夏枸杞葉中甜菜堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)（， n=3）mg·g-1

4 小結(jié)與討論

枸杞產(chǎn)業(yè)是寧夏回族自治區(qū)黨委和政府確定的九大重點(diǎn)發(fā)展產(chǎn)業(yè)之一，也是我國(guó)西北地區(qū)重點(diǎn)發(fā)展的富民產(chǎn)業(yè)。隨著對(duì)枸杞資源研究的深入和枸杞市場(chǎng)需求的增長(zhǎng)，枸杞葉資源的研究與開(kāi)發(fā)越來(lái)越受到關(guān)注和重視。枸杞葉富含黃酮類、酚酸類、多糖類及甜菜堿等資源性化學(xué)成分，且含量較枸杞子高，是一種資源利用價(jià)值高和資源化前景廣闊的藥食兩用資源品種，值得深入研究與開(kāi)發(fā)[13]。而目前對(duì)于寧夏枸杞葉的生藥學(xué)研究及質(zhì)量控制尚顯欠缺。本研究通過(guò)對(duì)寧夏枸杞葉的性狀和微性狀、顯微特征、薄層鑒別特征及主要活性成分定量分析等進(jìn)行較為系統(tǒng)的研究，制定了客觀的、可操作的性狀鑒別方法、顯微鑒定方法及理化鑒定方法，為寧夏枸杞葉藥材質(zhì)量控制及開(kāi)發(fā)利用提供了依據(jù)。

本實(shí)驗(yàn)在《寧夏中藥材標(biāo)準(zhǔn)》[10]、《寧夏中藥飲片炮制規(guī)范》[11]基礎(chǔ)上對(duì)寧夏枸杞葉作了更完整和詳盡的性狀和顯微特征描述，補(bǔ)充了寧夏枸杞干燥葉顏色、倒卵形、葉端急尖和圓鈍、葉柄綠褐色等性狀特征；首次描述枸杞葉的微性狀特征，提出葉柄上表面密布的小棒槌狀腺毛和葉中脈下表面圓齒狀的典型鑒別特征；補(bǔ)充了葉表面觀和粉末鑒別中不等式氣孔類型、氣孔保衛(wèi)細(xì)胞大小、上下表皮細(xì)胞平周壁、導(dǎo)管、纖維等的特征；詳述了葉橫切面中柵欄組織的特征，并以橫切面圖完整呈現(xiàn)了所有關(guān)鍵特征，從生藥學(xué)研究角度為枸杞葉質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的完善與提高提供了支撐。

寧夏枸杞、枸杞的嫩莖葉均可作為枸杞葉的基原[1]227，如《上海市中藥材標(biāo)準(zhǔn)》[14]里僅將枸杞的嫩莖及葉作為枸杞葉基原，并規(guī)定春、夏采收，但由于其主要為野生資源，分布區(qū)域、生長(zhǎng)年限、采收時(shí)間都很難明確，品質(zhì)差異大且資源量不穩(wěn)定，考慮其質(zhì)量控制的穩(wěn)定性及后續(xù)產(chǎn)業(yè)化前景，故本研究?jī)H針對(duì)廣泛栽培、生產(chǎn)過(guò)程更為規(guī)范、資源量更為充裕的寧夏枸杞進(jìn)行研究。

研究表明，寧夏枸杞葉中甜菜堿含量均遠(yuǎn)高于枸杞子中報(bào)道的甜菜堿最高含量（1.02%）[15]，寧夏枸杞葉中甜菜堿含量也高于花中甜菜堿含量（1.88%）[16]，并且不同產(chǎn)地寧夏枸杞葉中甜菜堿含量并無(wú)明顯差異。甜菜堿具有轉(zhuǎn)甲基、調(diào)節(jié)滲透壓、抗應(yīng)激、調(diào)節(jié)脂肪、蛋白質(zhì)、氨基酸代謝等功能，在工業(yè)生產(chǎn)中常作為新型飼料添加劑廣泛應(yīng)用[17-18]，可為寧夏枸杞葉開(kāi)發(fā)為甜菜堿提取原料藥提供思路。同時(shí)，本課題組將進(jìn)一步采用中藥資源化學(xué)研究思路和方法，全面評(píng)價(jià)其各類型資源性化學(xué)成分，并采用整體動(dòng)物模型和體外細(xì)胞模型開(kāi)展寧夏枸杞葉的活性評(píng)價(jià)及作用機(jī)制研究，為全面制訂寧夏枸杞葉藥材標(biāo)準(zhǔn)，發(fā)掘?qū)幭蔫坭饺~的資源價(jià)值與產(chǎn)業(yè)化開(kāi)發(fā)提供支撐，服務(wù)于西部地區(qū)中藥資源產(chǎn)業(yè)的高質(zhì)量發(fā)展。