柴曉昕，甘奇超，趙瑞亭，史景彥，郭平牯，袁淵，馬莉*

1.首都醫(yī)科大學(xué) 中醫(yī)藥學(xué)院，北京 100069；2.重慶多普泰制藥股份有限公司，重慶 400800

水蛭作為一種傳統(tǒng)動(dòng)物類中藥，具有破血、逐瘀、通經(jīng)之效[1]，日本醫(yī)蛭Hirudo nipponicaWhitman為《中華人民共和國(guó)藥典》2020 年版收錄品種，具有極大的藥用價(jià)值。目前，由于人類過(guò)度捕捉及農(nóng)藥化肥的使用，日本醫(yī)蛭野生資源銳減。因此日本醫(yī)蛭養(yǎng)殖行業(yè)逐漸興起并不斷擴(kuò)大。

人工養(yǎng)殖水蛭過(guò)程的關(guān)鍵技術(shù)包括環(huán)境水質(zhì)[2-5]、養(yǎng)殖密度[5-7]、水體溫度[2，6-7]、飼喂血液類型[8-9]等。其中水源作為日本醫(yī)蛭生存生活的主要條件，將直接影響其生長(zhǎng)。地下水是現(xiàn)有內(nèi)陸水產(chǎn)養(yǎng)殖的重要水源之一[10]，但資源有限、開(kāi)采有難度，目前已有養(yǎng)殖戶采用符合養(yǎng)殖標(biāo)準(zhǔn)的自來(lái)水試養(yǎng)日本醫(yī)蛭，但水源改變是否會(huì)對(duì)水蛭養(yǎng)殖產(chǎn)生影響尚缺乏報(bào)道。

水蛭的生物學(xué)特性及其藥用價(jià)值使得其體內(nèi)的微生物廣受關(guān)注。水蛭體內(nèi)的微生物經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期共同進(jìn)化，最終形成復(fù)雜且呈動(dòng)態(tài)平衡的微生物群落，對(duì)水蛭的健康具有極其重要的意義[11]。水蛭的消化系統(tǒng)十分完善，但存在于消化道內(nèi)的消化酶是相當(dāng)稀少的[12]。有研究發(fā)現(xiàn)，日本醫(yī)蛭進(jìn)行消化作用是靠與其共生的蛭假單孢桿菌Pseudomonas hirudins，通過(guò)培養(yǎng)基接種實(shí)驗(yàn)證實(shí)，該共生菌不僅可分解蛋白質(zhì)和脂肪，還可抑制其他細(xì)菌，從而保持水蛭嗉囊中的血液不會(huì)腐敗[13-14]。一些有益微生物能夠在動(dòng)物體腸道內(nèi)定植并生長(zhǎng)繁殖，維持腸道菌群的高水平穩(wěn)定，預(yù)防腸道疾病。隨著微生物鑒定技術(shù)的不斷發(fā)展，因16S rDNA基因測(cè)序技術(shù)可以從遺傳物質(zhì)和分子水平上對(duì)微生物進(jìn)行鑒定，其穩(wěn)定性和特異性獲得普遍認(rèn)可，越來(lái)越多地應(yīng)用于微生物鑒定中[15]。基于此，本研究從日本醫(yī)蛭肌肉及腸道的細(xì)菌多樣性角度入手，采用PacBio 三代高通量測(cè)序技術(shù)，對(duì)自來(lái)水養(yǎng)殖與地下水養(yǎng)殖的日本醫(yī)蛭取樣，對(duì)比2 種水質(zhì)環(huán)境下水蛭的微生物多樣性，評(píng)估自來(lái)水養(yǎng)殖水蛭的可行性。

1 材料

1.1 樣品

新鮮日本醫(yī)蛭樣本采集于重慶市多普泰水蛭養(yǎng)殖基地（N28°56′52.29″，E106°55′53.31″），平均個(gè)體質(zhì)量1.36～1.50 g。由北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所石林春副研究員鑒定為日本醫(yī)蛭Hirudo nipponicaWhitman。

1.2 試劑與儀器

D3146 細(xì)菌DNA 提取試劑盒（廣州美基生物科技有限公司）；NanoDrop One 型超微量分光光度計(jì)（Thermo Fisher Scientific公司）。

2 方法

2.1 樣本采集及處理方法

水蛭養(yǎng)殖于聚乙烯塑料箱中，以新鮮豬血為餌料，養(yǎng)殖用水分別為自來(lái)水和地下水，水溫為（26±1）℃，pH 為7.0±0.3，保證養(yǎng)殖箱內(nèi)常流水，且每24 h 全部換水1 次。其中，自來(lái)水經(jīng)充分曝氣除氯后使用，地下水直接抽提使用。

經(jīng)過(guò)為期90 d 的試驗(yàn)養(yǎng)殖，以自來(lái)水養(yǎng)殖水蛭為實(shí)驗(yàn)組，地下水養(yǎng)殖水蛭為對(duì)照組，將日本醫(yī)蛭速凍處死后，還軟30 min。在無(wú)菌狀態(tài)下使用無(wú)菌解剖刀和鑷子進(jìn)行解剖。先分離腸道組織，并用濾紙將其中的血液吸盡后放入凍存管中，自來(lái)水組樣本編號(hào)為B1，地下水組樣本編號(hào)為B2。后分離肌肉組織，用滅菌剪刀、解剖刀切取約1 cm2的組織塊，將組織塊放入凍存管中，自來(lái)水組樣本編號(hào)為M1，地下水組樣本編號(hào)為M2。樣品液氮速凍，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。為保證樣本均一性，每只水蛭均在同一部位進(jìn)行取樣，且同一取樣點(diǎn)只取1 次，每組重復(fù)3次。

2.2 微生物總DNA 提取及聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增

各樣品經(jīng)液氮研磨后將粉末分別置于無(wú)菌離心管中，利用微生物DNA 提取試劑盒提取樣品基因組DNA。檢測(cè)DNA純度和質(zhì)量濃度。使用引物為27F：5′-AGRGTTYGATYMTGGCTCAG-3′和1492R：5′-RGYTACCTTGTTACGACTT-3′，擴(kuò)增16S rRNA 基因 V1～V9 高變區(qū)[16]，根據(jù) 16S Amplification SMRTbell?文庫(kù)制備流程獲得測(cè)序文庫(kù)，并在PacBio Sequel Ⅱ平臺(tái)上對(duì)該文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序[17]。建庫(kù)及高通量測(cè)序在廣東美格基因科技有限公司完成。

2.3 數(shù)據(jù)優(yōu)化及統(tǒng)計(jì)分析

根據(jù)各樣本的Barcode 序列，使用Limma 1.9.0軟件從下機(jī)數(shù)據(jù)中拆分出各樣品數(shù)據(jù)，經(jīng)過(guò)CCS 3.4.1 軟件校正過(guò)濾掉過(guò)長(zhǎng)或過(guò)短、subread 數(shù)過(guò)少的序列，得到Raw reads。最后進(jìn)行引物切除、簡(jiǎn)單重復(fù)序列（SSR）去除和嵌合體去除，得到Clean fastq。采用UPARSE usearch 10軟件對(duì)所有樣品過(guò)濾后的數(shù)據(jù)按照97%的相似性水平聚類成操作分類單元（OTU）[18]。然后進(jìn)行多樣性分析，采用QIIME 1.9.1軟件計(jì)算Chao1、Shannon和Simpson等α多樣性指數(shù)，評(píng)估單個(gè)樣品中的物種豐富度和多樣性；用QIIME 1.9.1 軟件計(jì) 算Bray-curtis、Weighted Unifrac 和Unweighted Unifrac 距離等β多樣性指數(shù)，通過(guò)非度量多維尺度法（NMDS）對(duì)比不同樣本組間群落多樣性差異；通過(guò)統(tǒng)計(jì)相對(duì)豐度超過(guò)1%的物種，分析樣本群落結(jié)構(gòu)及關(guān)注的物種；利用相似性分析（ANOSIM）檢驗(yàn)不同養(yǎng)殖組樣本間差異是否有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果與分析

3.1 微生物群落多樣性分析

通過(guò)對(duì)2 種環(huán)境中養(yǎng)殖的日本醫(yī)蛭肌肉及腸道組織樣本（M1、M2、B1 和B2）16S rDNA 基因V1～V9（全長(zhǎng)）區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增后測(cè)序，共得到69 368 條高質(zhì)量DNA 序列，長(zhǎng)度分布在1412～1443 bp，符合16S rDNA基因的V1～V9區(qū)序列長(zhǎng)度，共包含83 個(gè)OTU。所有日本醫(yī)蛭樣本的Shannon 指數(shù)稀釋曲線均趨于平緩，表明測(cè)序深度已覆蓋水蛭菌群的絕大部分物種（圖1）。

圖1 日本醫(yī)蛭樣本的Shannon指數(shù)稀釋曲線

對(duì)不同樣品在97%一致性閾值下進(jìn)行α多樣性分析，采用Chao1 指數(shù)、Shannon 指數(shù)、Simpson 指數(shù)綜合表征物種多樣性。其中Chao1 指數(shù)常用于反映樣品中群落的豐富度，Chao1 指數(shù)值越大，說(shuō)明物種數(shù)量越多；Shannon 指數(shù)及Simpson 指數(shù)綜合評(píng)估群落中物種的豐富度和均勻度，Shannon 指數(shù)越大，說(shuō)明群落具有越大的多樣性；Simpson 指數(shù)越大，說(shuō)明群落具有越大的多樣性（計(jì)算隨機(jī)取樣時(shí)取到不同物種的概率）。如表1 所示，與自來(lái)水養(yǎng)殖的水蛭樣品相比，地下水養(yǎng)殖水蛭的肌肉及腸道樣本均具有更多的物種數(shù)量且群落具有更大的多樣性。

表1 水蛭樣品的α多樣性指數(shù)分析（， n=3）

表1 水蛭樣品的α多樣性指數(shù)分析（， n=3）

注：不同養(yǎng)殖組同一類組織樣本比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

為克服主坐標(biāo)分析（PcoA）等基于線性模型的排序方法的缺點(diǎn)，選用NMDS 反映水蛭肌肉和腸道組織細(xì)菌群落的β多樣性。從NMDS 分布圖（圖2）可以看出，日本醫(yī)蛭肌肉組M1 內(nèi)的樣品間距離更近，微生物群落也更加相似；腸道組B1 和B2 有部分重疊，排列在左上側(cè)。NMDS分析的stress為0.1，可認(rèn)為排序結(jié)果相對(duì)可靠。

圖2 日本醫(yī)蛭樣品微生物群落N(xiāo)MDS排序

3.2 日本醫(yī)蛭肌肉及腸道樣本的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)

4組樣本中的細(xì)菌共鑒定出8個(gè)門(mén)、13個(gè)綱、25個(gè)目、46 個(gè)科、48 個(gè)屬。在此基礎(chǔ)上，在不同分類水平上分別提取序列信息，計(jì)算各物種的相對(duì)豐度。選取相對(duì)豐度在1%以上的物種繪制條形圖，反映不同樣本在不同分類水平上的細(xì)菌組成（圖3）。在門(mén)水平上，4 組日本醫(yī)蛭樣本中的優(yōu)勢(shì)門(mén)為變形菌門(mén)（Proteobacteria）、擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）、厚壁菌門(mén)（Firmicutes）及梭桿菌門(mén)（Fusobacteria）。在屬水平上，M1、M2、B1、B2中所占比例最高的分別為氨基桿菌屬（Aminobacter）、Elstera、Morganella及黏液菌屬（Mucinivorans）。

圖3 日本醫(yī)蛭樣本的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)

屬水平的聚類熱圖（圖4）表明，地下水養(yǎng)殖組肌肉與腸道聚為一簇，自來(lái)水養(yǎng)殖組肌肉與腸道聚為一簇。結(jié)合圖3～4，與M1、B1 相比，M2、B2的細(xì)菌豐度和多樣性均發(fā)生變化，表現(xiàn)出更為豐富的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。其中，黏液菌屬（Mucinivorans）、梭桿菌屬（Fusobacterium）、擬桿菌屬（Bacteroides）等有潛在致病風(fēng)險(xiǎn)的菌屬相對(duì)豐度在自來(lái)水養(yǎng)殖組中明顯低于地下水養(yǎng)殖組。

圖4 日本醫(yī)蛭樣品屬水平的分層聚類熱圖

采用Anosim 對(duì)不同養(yǎng)殖組醫(yī)蛭同類組織樣本間的群落結(jié)構(gòu)的差異進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，肌肉樣本組間R=0.481，P=0.200，腸道樣本組間R=1.000，P=0.333，提示不同養(yǎng)殖組的同類組織樣本間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 討論

基于水蛭的生活習(xí)性及養(yǎng)殖成本，人工養(yǎng)殖過(guò)程中的水環(huán)境對(duì)提高日本醫(yī)蛭的產(chǎn)量尤為重要。本研究應(yīng)用地下水與除氯的自來(lái)水對(duì)水蛭開(kāi)展90 d 的養(yǎng)殖，水蛭生長(zhǎng)狀況均良好。與地下水養(yǎng)殖的水蛭相比，除氯自來(lái)水養(yǎng)殖的水蛭微生物群落表現(xiàn)出更小的多樣性，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因此認(rèn)為采用自來(lái)水開(kāi)展水蛭養(yǎng)殖工作是可行的。自來(lái)水是指通過(guò)汲取江河湖泊及地下水、地表水，由自來(lái)水廠經(jīng)過(guò)沉淀、消毒、濾過(guò)等工藝流程的處理，生產(chǎn)出來(lái)的符合相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)的供人們生活生產(chǎn)使用的水，水質(zhì)穩(wěn)定且資源相對(duì)易得，對(duì)養(yǎng)殖戶來(lái)說(shuō)成本也較低，可考慮將其充分曝氣除氯后，作為地下水替換資源進(jìn)行水蛭養(yǎng)殖。

水蛭體內(nèi)的微生物在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中和水蛭形成共生關(guān)系。共生是物種進(jìn)化的重要驅(qū)動(dòng)力。因此研究藥用水蛭的共生體具有重要意義[19]。本研究中，除氯自來(lái)水養(yǎng)殖組日本醫(yī)蛭的肌肉及腸道樣本的優(yōu)勢(shì)菌屬分別為氨基桿菌屬（Aminobacter）和Morganella。其中，Aminobacter來(lái)源主要為土壤環(huán)境，在受污染的土壤或水環(huán)境中有很強(qiáng)的應(yīng)用潛力。該菌屬中目前已知有3 種微生物，即ASI1、ASI2 和MSH1。這3 種微生物能夠?qū)⑥r(nóng)藥代謝物2，6-二氯苯甲酰胺（BAM）礦化成CO2、NH4+和Cl-，將BAM 作為唯一的碳源、氮源和能源[20]。Morganella屬于腸桿菌科的Proteeae屬，積累的數(shù)據(jù)表明，其可引起多種感染，如敗血癥、膿腫、尿袋綜合癥、絨毛膜羊膜炎和蜂窩織炎。這種細(xì)菌通常會(huì)導(dǎo)致某些感染患者的高病死率。但也有研究認(rèn)為其是不尋常的機(jī)會(huì)病原體，主要引起術(shù)后傷口和尿路感染[21-22]。另一方面，在對(duì)相對(duì)豐度排名前30 的物種進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析時(shí)，發(fā)現(xiàn)其中存在的Aeromonas和Rikenella為目前已知的2 種水蛭共生菌[23]。Aeromonas是革蘭陰性兼性厭氧菌[24]，可產(chǎn)生大量的出口水解酶，幫助水蛭消化道內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)分解，并且對(duì)攝入的動(dòng)物血液具有殺菌作用。Tasiemski等[25]研究發(fā)現(xiàn)，水蛭與Aeromonas均可產(chǎn)生抗生素類物質(zhì)，這些物質(zhì)為其提供了針對(duì)侵入性細(xì)菌的相互保護(hù)，并且有助于水蛭腸道菌群的穩(wěn)態(tài)，這種免疫優(yōu)勢(shì)是水蛭與Aeromonas間有穩(wěn)定的進(jìn)化關(guān)聯(lián)的強(qiáng)有力證據(jù)。Whitaker 等[26]研究發(fā)現(xiàn)，如果從水蛭消化系統(tǒng)的共生天然菌群中去除了Aeromonas，則可能會(huì)產(chǎn)生更具毒性的細(xì)菌，影響水蛭的健康。Rikenella是專性厭氧菌，是擬桿菌屬的成員，該物種傾向于在食血生物的胃腸道中定殖。有研究認(rèn)為其對(duì)物種的進(jìn)化適應(yīng)和消化道生態(tài)系統(tǒng)具有一定的生理貢獻(xiàn)[27]。但其在胃腸道內(nèi)發(fā)揮的作用還未明確[28]。有研究指出Rikenella是腸道內(nèi)具有保護(hù)性功能的菌群，小鼠灌胃嘔吐毒素（DON）可使腸道Parabacterodies和Mucispirilla炎癥敏感菌群及有益菌Rikenella的豐度降低，進(jìn)而引起腸道炎癥發(fā)生，導(dǎo)致腸道損傷同時(shí)危害機(jī)體健康[29]。Ott 等[30]認(rèn)為Rikenella在宿主的腸胃中與Aeromonas具有協(xié)同作用，對(duì)Aeromonas的維持和增殖起到保護(hù)作用，而同時(shí)Aeromonas可減少氧氣供應(yīng)，從而使厭氧的Rikenella得以棲息。

隨著日本醫(yī)蛭養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，人工養(yǎng)殖過(guò)程中日本醫(yī)蛭的疾病爆發(fā)也越來(lái)越頻繁。雖然傳統(tǒng)化學(xué)藥物和抗生素療效顯著，但大多都會(huì)在動(dòng)物體內(nèi)有殘留，尤其長(zhǎng)期使用還將導(dǎo)致耐藥菌滋生，給后期食品、藥品的使用帶來(lái)安全隱患。從共生菌、有益微生物等角度出發(fā)研制的微生態(tài)制劑不僅能夠抑制有害細(xì)菌、調(diào)節(jié)動(dòng)物腸道微生態(tài)環(huán)境，還能提高水產(chǎn)動(dòng)物的品質(zhì)和產(chǎn)量，已有部分養(yǎng)殖戶開(kāi)始投入使用。張彬等[31]研究比較了硝化細(xì)菌T1、光合細(xì)菌T2和EM 復(fù)合菌T3 對(duì)菲牛蛭養(yǎng)殖水體的凈化效果，結(jié)果表明這3 種有益微生物制劑均有顯著增加水體溶氧量及降低氨氮、亞硝態(tài)氮、化學(xué)耗氧量的效應(yīng)，達(dá)到水體凈化作用，其中以EM 復(fù)合菌的凈化效果最佳。張濤等[32]研究發(fā)現(xiàn)，新鮮豬血飼料輔以一定量的嗜水氣單胞菌可以在一定密度下降低日本醫(yī)蛭的病死率。劉飛等[33]研究發(fā)現(xiàn)，在餌料中適當(dāng)加入糞腸球菌和丁酸梭菌也可以降低日本醫(yī)蛭的病死率。因此，在日本醫(yī)蛭的人工養(yǎng)殖過(guò)程中，建議擴(kuò)大對(duì)日本醫(yī)蛭的有益微生物的研究，研制微生態(tài)制劑，提高日本醫(yī)蛭的產(chǎn)量。