黃家樂，莫惠鳳，羅沛豪，馬惠儀

香港特別行政區(qū)政府衛(wèi)生署 中醫(yī)藥規(guī)管辦公室 政府中藥檢測中心，香港特別行政區(qū)

根據(jù)《中華人民共和國藥典》2020 年版，鹿茸是鹿科梅花鹿和馬鹿雄鹿未骨化密生茸毛的幼角[1]，其混淆品部分來自馴鹿、水鹿、麋鹿等[2-3]。性狀鑒別和顯微鑒別可快速鑒別鹿茸原藥材[4-5]，但對部分缺失性狀特征的鹿茸制品存在局限性。DNA 鑒別技術(shù)分辨能力強，尤其適用于動物類藥材或近緣物種的鑒別。目前的DNA 技術(shù)中，特異性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）所涉及的分析儀器少，操作容易且有明確的判定準(zhǔn)則，利于檢測業(yè)界采用和中藥業(yè)界納入其質(zhì)量控制流程，以確保藥材貨源的正確性和生產(chǎn)中投料的規(guī)范性。本研究旨在開發(fā)及驗證一種基于特異性PCR 技術(shù)區(qū)分鹿茸正品梅花鹿和馬鹿的篩選方法，能有效補充現(xiàn)行鹿茸鑒別法，為相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)化檢測流程的建立及質(zhì)量控制系統(tǒng)的完善提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Heraeus Megafuge 8R 型離心儀、NanoDrop One型微量核酸濃度測定儀、ProFlex 型PCR 儀（美國Thermo Scientific 公司）；MM400 型球磨儀（德國Retsch 公司）；Thermomixer C 型恒溫混合器（德國Eppendorf 公司）；QIAsymphony SP 型全自動樣品純化儀、QIAxcel 型全自動核酸蛋白分析儀（德國Qiagen 公司）；Matrix A 型組織研磨管（美國MPBio公司）。

1.2 試藥

蛋白酶K、QIAsymphony DNA Investigator Kit、QIAxcel DNA High Resolution Kits、脫氧核糖核苷三磷酸（dNTP）、QX DNA Size Marker（德國Qiagen公司）；Platinum?TaqDNA 聚合酶（美國Thermo Sicentific 公司）；自定義引物（比利時Eurogentec 公司和美國Thermo Sicentific 公司）；二硫蘇糖醇（DTT，美國Sigma 公司）；GelRed 核酸染劑（美國Biotium公司）。

馬鹿茸、梅花鹿茸及鹿茸混淆品共43 份樣品，收集自北京、吉林、遼寧、新疆、江蘇、海南、山西和香港等地，樣品由首都醫(yī)科大學(xué)趙奎君研究員及香港科技大學(xué)畢丹和徐紅研究員鑒定。香港市面流通的鹿類幼角切片、鹿筋、鹿鞭、鹿肉及食用家畜樣品共25 份。其他動物、植物和真菌類樣品共5 份，購自中國食品藥品檢定研究院。4份魚肉樣品來自英國FAPAS?實驗室能力測試計劃。所有樣品都經(jīng)DNA 測序，利用BLAST 程序與美國國家生物技術(shù)信息中心（NCBI）所收載的cytochrome c oxidase subunit 1（CO Ⅰ）、cytochrome b 和16S ribosomal RNA 序列進行比對，確定其來源。樣品保存于香港特別行政區(qū)政府衛(wèi)生署政府中藥檢測中心，見表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 引物設(shè)計

從NCBI 的Nucleotide Database 下載梅花鹿Cervus nipponTemminck、馬鹿C.elaphusLinnaeus、水鹿Sambar unicolorKerr、麋鹿Elaphus davidianusMilne-Edwards 和馴鹿Rangifer tarandusLinnaeus 共87 份線粒體基因組DNA 序列（表2），使用MUSCLE[6]進行多重序列比對，分別以梅花鹿或馬鹿作為比較對象，在BioEdit[7]上尋找特異性單核苷酸多態(tài)性（SNP）位點，設(shè)計引物后導(dǎo)入Primer 3[8]分析其物理特性，修正二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)，最后合成引物。

表2 鹿類樣品線粒體基因組DNA序列

經(jīng)多重序列比對后，找出梅花鹿和馬鹿的特異性位點。梅花鹿線粒體基因組序列DQ985076.1 和馬鹿線粒體基因組序列KT290948.1分別定為梅花鹿和馬鹿特異性引物設(shè)計參照，共設(shè)計了8 個梅花鹿（S22、S23、S24、S25、S26、S27、S28、S29）和1個馬鹿（S33）的特異性引物組合，其序列和物理特性見表3。

2.2 樣品研磨

按樣品采取下述2 種方法研磨：1）稱取樣品約1 g，剪切成約3 mm×6 mm×6 mm方塊后置于不銹鋼球磨罐，加入直徑15 mm 不銹鋼研磨球，用球磨儀在28 Hz 頻率下研磨5 min，稱取約50 mg 粉磨樣品于2 mL 平底離心管。2）若樣品體積小，稱取樣品約50 mg，經(jīng)剪切后移入Matrix A研磨管中，放入球磨儀，在28 Hz頻率下研磨30 min。

2.3 DNA提取

利用QIAsymphony DNA Investigator Kit，在樣品、陽性對照和提取陰性對照的管中加入ATL緩沖液960 μL、20 mg·mL-1蛋白酶K 40 μL 和1 mol·L-1DTT 40 μL。漩渦混勻后，放入恒溫混合器，56 ℃、2000 r·min-1振蕩3 h 或過夜。16 000×g離心15 min，取上清液600 μL加入2 mL平底離心管中，上樣到全自動樣品純化儀，按照儀器說明書操作。利用NanoDrop One 型微量核酸濃度測定儀測定樣品總基因組DNA 質(zhì)量濃度，以水調(diào)整其終質(zhì)量濃度至約10 ng·μL-1。

2.4 引物篩選

按以下條件對表3 中的引物進行篩選。反應(yīng)在200 μL離心管中進行，反應(yīng)體系包括10×PlatinumTaqPCR緩沖液（不含Mg2+）2.5 μL、50.0 mmol·L-1Mg2+1.0μL、5.0 mmol·L-1dNTPs 1.0 μL、5.0 μmol·L-1正向引物2.0 μL、5.0 μmol·L-1反向引物2.0 μL、PlatinumTaqDNA聚合酶0.25 μL、DNA模板約20 ng，加無菌超純水至25 μL。PCR 反應(yīng)參數(shù)為95 ℃預(yù)變性5 min，循環(huán)反應(yīng)30次（94 ℃，30 s；55 ℃，30 s；72 ℃，1 min），72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。結(jié)果顯示，S22～S24和S29引物對梅花鹿和馬鹿樣品都產(chǎn)生強度相近的PCR 產(chǎn)物，表明這4 個引物組合不能分辨梅花鹿和馬鹿，因此被剔除。S25～S28、S33 的結(jié)果中，非目標(biāo)品種出現(xiàn)比目標(biāo)品種較弱的DNA條帶。

表3 梅花鹿和馬鹿PCR引物設(shè)計及其物理特性

考察不同的PCR條件對S25～S28、S33的擴增目標(biāo)條帶的改進，包括PCR 緩沖液（Platinum?TaqPCR 緩沖液、Platinum ?TaqDNA Polymerase High Fidelity緩沖液）、Mg2+濃度（1.0～2.0 mmol·L-1）、Taq酶（Platinum?TaqDNA 聚合酶、Platinum?TaqHigh Fidelity 酶）、退火溫度（55～68 ℃）和循環(huán)次數(shù)（25～30 個循環(huán)）對擴增目標(biāo)條帶的影響，選擇Platinum?TaqPCR 緩沖液、Platinum?TaqDNA 聚合酶、Mg2+最終濃度1.2 mmol·L-1、退火溫度63 ℃和循環(huán)次數(shù)30 為最適宜條件。S27 引物對梅花鹿樣品產(chǎn)生單一約223 bp 的條帶，而S33 對馬鹿樣品產(chǎn)生單一約248 bp 的條帶，而非目標(biāo)品種均不會產(chǎn)生任何目標(biāo)條帶，表明S27和S33能分別作為梅花鹿和馬鹿的特異性測試引物。因此，最終選擇S27和S33引物用于樣品DNA擴增。

2.5 PCR擴增

為更能反映引物組合所針對的目標(biāo)品種，將S27 定名為CNIP-f/CNIP-r，而S33 定名為CELA-f/CELA-r，首4 字母是科學(xué)名縮寫，f 和r 代表引物方向。CNIP-f/CNIP-r 的目標(biāo)區(qū)域位于DQ985076.1 的第110～332 位堿基，而CELA-f/CELA-r 位 于KT290948.1的第119～366位堿基，均屬于12S核糖體RNA。CNIP-f/CNIP-r 和CELA-f/CELA-r 的PCR擴增條件見表4。

表4 鹿茸樣品的PCR擴增條件

2.6 電泳分析

按需求選擇下述電泳方法觀察PCR 擴增情況：1）瓊脂糖凝膠電泳，體系為1.5%凝膠濃度、0.5%TBE 緩沖液、GelRed 核酸染色、紫外透射儀上觀察電泳結(jié)果。2）自動化電泳系統(tǒng)，利用QIAxcel DNA High Resolution Kit在QIAxcel Advanced System分析電泳結(jié)果。

2.7 方法學(xué)驗證

2.7.1考察樣品DNA 樣品DNA 模板需進行UnivP/UnivQ 的PCR 擴增和電泳分析，獲得1 條約104 bp的條帶才會被采用。

2.7.2重復(fù)性 以對應(yīng)品種的3 份樣品A、B 和C進行重復(fù)測試，其中A 抽取9份重復(fù)樣品，B和C各抽取3 份，即合共15 份，按2.5項下條件擴增分析，比較15份重復(fù)樣品的PCR 擴增情況。所有重復(fù)樣品都應(yīng)出現(xiàn)對應(yīng)品種的特異性條帶。結(jié)果表明，15 個梅花鹿茸重復(fù)樣品在CNIP-f/CNIP-r 的PCR 反應(yīng)中，均產(chǎn)出梅花鹿特異性條帶。15 個馬鹿茸重復(fù)樣品，在CELA-f/CELA-r 的PCR 反應(yīng)亦擴增了馬鹿特異性條帶，說明方法重復(fù)性良好。

2.7.3重現(xiàn)性 共進行3 次測試，每次測試的操作人員、儀器及測試日期的組合不相同。3 次測試都采用同一份的對應(yīng)品種的樣品，每次抽取3 份重復(fù)樣本，按2.5項下條件擴增分析，比較3次測試中共9 份重復(fù)樣品的PCR 擴增情況。所有重復(fù)樣品都應(yīng)出現(xiàn)特異性條帶。結(jié)果表明，在不同的操作人員、時間、儀器的組合下，對CNIP-f/CNIP-r 和CELA-f/CELA-r 各進行3 次測試，9 個梅花鹿茸重復(fù)樣品均得到梅花鹿特異性條帶，9 個馬鹿茸重復(fù)樣品獲得馬鹿特異性條帶。

2.7.4檢測限 以對應(yīng)品種的1 份樣品抽取8 份重復(fù)樣品，按2.3項下方法進行DNA 提取，用水將DNA 模板質(zhì)量濃度調(diào)至10 ng·μL-1。再以水進行10倍序列稀釋，得到10.0、1.0、0.1 ng·μL-1和10、1 pg·μL-1共5 個質(zhì)量濃度，按2.5項下條件擴增分析，找出最低可被擴增的DNA 模板質(zhì)量濃度。結(jié)果表明，CNIP-f/CNIP-r 和CELA-f/CELA-r 檢測限均為10 ng·μL-1，而其余質(zhì)量濃度均不能檢出。

2.7.5專屬性 利用鹿科動物樣品作測試，包括目標(biāo)品種和非目標(biāo)品種，所采用的鹿類樣品包括19 份梅花鹿茸、20份馬鹿茸、2份水鹿的幼角和2份麋鹿角，每份樣本抽取2份重復(fù)樣品進行測試，按2.5項下條件擴增分析，CNIP-f/CNIP-r 的測試結(jié)果表明，19 份梅花鹿茸樣品都檢出梅花鹿特異性條帶，而其他樣品沒有可觀察的DNA 條帶。CELA-f/CELA-r 測試中的20 份馬鹿茸樣品都獲得馬鹿特異性條帶，其余樣品皆為陰性。

2.7.6假陽性 利用非鹿科動物、食用家畜、植物和真菌樣品作測試，包括水牛、黃牛、綿羊、豬、雞、大頭鱈、無須鱈、綠青鱈、大西洋鱈、刺五加、馬鞭草、葛和靈芝。每份樣品抽取2 份重復(fù)樣品進行測試。CNIP-f/CNIP-r 的測試結(jié)果表明，梅花鹿茸樣品檢出梅花鹿特異性條帶，而其他樣品沒有可察的DNA 條帶。CELA-f/CELA-r 測試中的馬鹿茸樣品都獲得馬鹿特異性條帶，其余樣品皆為陰性。

2.7.7可行性 在香港市場收集鹿茸及其他鹿類產(chǎn)品21 份，包括9 份馬鹿茸切片、5 份馴鹿幼角切片、1份白唇鹿角切片、4份馬鹿筋、1份馬鹿鞭和1份梅花鹿肉干，每份樣本抽取2 份重復(fù)樣品進行測試，按照按2.5項下條件擴增分析，考察方法的適用性。結(jié)果表明，CNIP-f/CNIP-r 測試中梅花鹿肉干樣品出現(xiàn)梅花鹿特異性條帶，而CELA-f/CELA-r 能篩選出馬鹿茸切片、馬鹿筋和馬鹿鞭，與DNA 測序的結(jié)論一致。

2.7.8實驗室間比對 委托獨立實驗所進行實驗室間比對工作，共同驗證測試方法，確保實驗操作的規(guī)范性和結(jié)果的一致性。各實驗室對同一樣本的共同驗證特異性PCR 結(jié)果應(yīng)一致。實驗室間比對結(jié)果表明，參與比對的實驗室所得的結(jié)果相同，CNIP-f/CNIP-r 和CELA-f/CELA-r 能區(qū)分梅花鹿和馬鹿。CNIP-f/CNIP-r 和CELA-f/CELA-r 引物對梅花鹿、馬鹿和其他混淆品的電泳結(jié)果見圖1～6。

圖1 梅花鹿的CNIP-f/CNIP-r電泳圖

圖2 馬鹿的CNIP-f/CNIP-r電泳圖

圖3 其他鹿科動物的CNIP-f/CNIP-r電泳圖

圖4 梅花鹿的CELA-f/CELA-r電泳圖

圖5 馬鹿的CELA-f/CELA-r電泳圖

圖6 其他鹿科動物的CELA-f/CELA-r電泳圖

2.8 混合樣品研究

對混合來源的鹿樣品進行研究。配制3 組等質(zhì)量混合樣品，包括梅花鹿和馬鹿混合樣品、梅花鹿和馴鹿混合樣品、馬鹿和馴鹿混合樣品。提取模板DNA后，利用CNIP-f/CNIP-r和CELA-f/CELA-r進行測試。結(jié)果顯示，CNIP-f/CNIP-r和CELA-f/CELA-r均能檢出目標(biāo)品種，且不受其他鹿品種影響（圖7～8）。

圖7 混合樣品的CNIP-f/CNIP-r電泳圖

圖8 混合樣品的CELA-f/CELA-r電泳圖

3 討論

目前已發(fā)表的鹿茸DNA 鑒別方法有特異性PCR[9-12]、PCR 限制性內(nèi)切酶片段[13]、實時熒光定量PCR[14]、多重PCR[15]、熔解曲線分析[16]、隨機擴增DNA[17]、DNA 條形碼[18-20]等，都證明DNA 技術(shù)能有效鑒別鹿茸。相對上述研究，本實驗所建立的篩選方法有4 個特點：1）能篩選源自梅花鹿和馬鹿的鹿茸飲片和鹿制品?；诿坊购婉R鹿同為鹿茸的來源品種[1]，有2 種可行的設(shè)計方案。第一種方案是同時檢驗出梅花鹿和馬鹿，優(yōu)點是操作較簡單。第二種方案是分別針對梅花鹿和馬鹿進行檢測，優(yōu)點是可明確區(qū)分梅花鹿和馬鹿?？紤]到梅花鹿茸的市價明顯高于馬鹿茸，所以本篩選方法取第二種方案。2）已通過了一系列的方法學(xué)驗證測試，實驗室間比對結(jié)果亦表明方法可靠。3）設(shè)有動物類DNA 模板的質(zhì)量控制。UnivP/UnivQ 的目標(biāo)區(qū)域是線粒體16S rRNA 上的保守位置，對動物類基因組具有廣譜性，加上PCR 產(chǎn)物長度只有104 bp，符合作為質(zhì)量控制的先決條件，確定可從樣本中提取出的動物源DNA，其PCR 擴增情況能作為篩選結(jié)果的佐證。4）CNIP-f/CNIP-r和CELA-f/CELA-r采用相同的PCR 試劑配方和反應(yīng)條件，可減省工序。本篩選方法已上載到香港特別行政區(qū)政府衛(wèi)生署的網(wǎng)站供參考（https://www.cmro.gov.hk/html/gb/GCMTI/gcmti_dnamethod.html）。

建立方法時，引物設(shè)計應(yīng)遵循3 條準(zhǔn)則：1）限制PCR 擴增物于200～350 bp，有助于提升PCR 成功率。因中藥材的基因組DNA 大多已被降解，理論上越短的PCR產(chǎn)物越容易被擴增。2）將特異性SNP位點置于引物3′的最末端。在PCR 的延伸過程中，未能互補的3′端會影響5′至3′聚合酶活性，令引物具有區(qū)分目標(biāo)物種和非目標(biāo)物種的能力。3）若目標(biāo)品種在引物3′端的第三和第四個堿基位置出現(xiàn)種內(nèi)變異，將該位置轉(zhuǎn)為簡并堿基，避免因堿基不互補而降低PCR 產(chǎn)物，減損檢測靈敏度。根據(jù)下載的梅花鹿和馬鹿的線粒體基因組序列排序結(jié)果，發(fā)現(xiàn)兩者的種內(nèi)的變異大，穩(wěn)定的特異性SNP 位點不多，局限了引物設(shè)計，按上述3 條準(zhǔn)則，最終只能設(shè)計出1 個馬鹿引物組合，并需為3′末端的第三和第四個堿基轉(zhuǎn)為簡并堿基。檢測限測試中，DNA 質(zhì)量濃度梯度設(shè)定為0.001～10 ng·μL-1，測試結(jié)果顯示最低質(zhì)量濃度為10 ng·μL-1，即檢測上限，較合適的設(shè)定應(yīng)為50.0、20.0、10.0、1.0、0.1 ng·μL-1。

為獲得可靠的結(jié)果，使用本篩選方法時應(yīng)注意：1）加入陽性對照和提取陰性對照；2）在PCR 反應(yīng)中加入PCR陰性對照；3）以UnivP/UnivQ的PCR擴增作為質(zhì)量控制；4）確保DNA 模板量達到方法要求。關(guān)于第四點，在方法學(xué)驗證的可行性測試中，已表明本方法不僅能篩選鹿茸，亦適用于鹿筋、鹿肉干和鹿鞭，本方法的檢測限為10 ng·μL-1，操作人員應(yīng)評估某些部位，如毛發(fā)的DNA 模板量能否滿足相關(guān)要求。若樣品不符合最低要求，或需要進一步確定本方法的篩選結(jié)果，可按檢測目的采用其他鑒別方法作為互補，如鑒別動物類藥材的DNA 條形碼檢測法。

已有文獻證實，DNA 技術(shù)能應(yīng)用于混合來源藥材。賈靜等[21]對市售鹿茸粉進行DNA 條形碼檢測，發(fā)現(xiàn)當(dāng)中3 份樣本的COⅠ測序峰圖雜合度較高，重新測序前利用分子克隆方法得到單一來源序列，以解決因存在多于1 種COⅠ序列而令測序峰圖雜亂，導(dǎo)致無法作出判斷的問題，結(jié)果表明，該3 份樣本均含多于1 種的鹿品種或類群。本課題組嘗試?yán)帽痉椒▽旌蟻碓吹穆箻悠愤M行篩選，初步發(fā)現(xiàn)CNIP-f/CNIP-r 和CELA-f/CELA-r 均能檢出目標(biāo)品種，且不受其他鹿品種影響。但本方法的適用范圍是篩選單一來源的鹿類樣品，是否同樣適用于混合來源樣品需進行方法學(xué)驗證測試。