唐 正 魏金花 張 磊 翟 倩 袁建林 李 臻

1（中國人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué)人體解剖與組織胚胎學(xué)教研室 西安 710032）

2（中國人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院泌尿外科 西安 710032）

3（中國人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院空軍軍醫(yī)大學(xué)婦產(chǎn)科 西安 710032）

隨著科學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，現(xiàn)代社會信息化、電子化水平日益提高，各種電磁設(shè)備的使用密度和頻率日漸增加，其中毫米波（Millimeter wave，MMW）屬非電離輻射中的極高頻波，波長為1～10 mm，頻率在30～300 GHz［1］，其分辨率高，抗干擾性好，測速靈敏度高，在雷達(dá)、通訊、無線電測量等方面得到普遍應(yīng)用［2］。隨著毫米波的廣泛應(yīng)用，公眾在生活與工作環(huán)境中與毫米波的接觸逐漸增多，其安全性問題引起人們關(guān)注。在內(nèi)臟器官中，睪丸處于表淺部位，是電磁輻射較敏感的靶器官之一。已有研究表明低頻微波輻射可對雄性生殖系統(tǒng)造成損傷［3-5］，而毫米波輻射作用下的雄性生殖損傷效應(yīng)尚無報道。

本研究為掌握毫米波輻射對男性生殖健康的危害特點，明確其對男性生殖和生精潛能的影響，通過建立毫米波輻射小鼠模型，探究長期輻照下的累積損傷效應(yīng)，為早期診斷和防治毫米波所致男性不育提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

1.1.1試劑

蘇木精（睿思科生物技術(shù)有限公司）；伊紅（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；DAPI 細(xì)胞核染色液（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）；TUNEL凋亡檢測試劑盒（Roche，Swiss）；伊文思藍(lán)（Biofer，USA）；M 2培養(yǎng)基（Millipore，USA）。

1.1.2儀器

Kα 頻段微波輻射系統(tǒng)（西安電子工程研究所）；EMUC7 超薄切片機（Leica，Germany）；光學(xué)顯微鏡（Olympus，Japan）；熒光顯微鏡（Zeiss，Germany）；計算機輔助精子分析儀CASA（賽司醫(yī)療科技有限公司）。

1.2 動物分組與輻照條件

實驗動物選用8周齡雄性BALB/c小鼠120只，購自空軍軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心，實驗經(jīng)空軍軍醫(yī)大學(xué)動物倫理中心批準(zhǔn)進(jìn)行，按照輻照時間（1周、2 周、3 周、4 周、5 周、6 周、7 周、8 周、9周）分為9 組。其中1～3 周，每組8 只；4～9 周，每組16 只；各組小鼠再平均隨機分為輻照組（MMW）和假輻照組（Sham）。所有小鼠均誘導(dǎo)進(jìn)入樹脂材料（儀器測試無阻擋）小籠中，使其無法自由活動，籠身布滿小孔以保證透氣。輻照組放置于離輻照源10 cm 處（經(jīng)測功率密度為10 mW/cm2），輻照方向正對于小鼠尾部，輻照時間為2 h/d，持續(xù)9 周；Sham 組在裝籠后放置于相同位置，輻射儀器不開機。所有小鼠在輻照前會進(jìn)行2 周的裝籠習(xí)服，在對應(yīng)周數(shù)輻照完成4 h 內(nèi)處理并進(jìn)行檢測。輻照組與Sham組小鼠輻照前后經(jīng)紅外線測溫儀測量陰囊溫度無差異，波動于35.7～36.2 ℃。

Kα頻段微波輻射系統(tǒng)由信號源及射頻放大器、輻射天線、饋線系統(tǒng)組成（圖1）。波源參數(shù)：脈沖波，峰值功率是18.6 W，占空比10%，脈寬100 μs，重復(fù)頻率1 000 Hz，頻率為34.5 GHz，信號波長為8.69 mm；接收天線增益為25 dB。

圖1 Kα頻段微波輻射系統(tǒng)示意圖（a）和毫米波輻射現(xiàn)場照片（b）Fig.1 Schematic diagram of Kα frequency band microwave radiation system(a)and millimeter wave radiation field photo(b)

1.3 檢測方法

1.3.1蘇木精-伊紅染色(Hematoxylin-eosin staining，HE)

小鼠睪丸分離出后置于Bouin氏液中固定，常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋、切片，切片經(jīng)二甲苯脫蠟，酒精脫水后進(jìn)行HE染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察拍片。隨機選取每個樣本的12 個視野，測量并統(tǒng)計生精小管的的直徑，同時通過Johnsen 評分［6］統(tǒng)計損傷程度。

1.3.2TUNEL染色

石蠟切片常規(guī)脫蠟、脫水后，按照TUNEL 凋亡檢測試劑盒說明書的操作步驟進(jìn)行染色，在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果，并隨機選擇每個樣本的12個視野，統(tǒng)計凋亡生精小管所占比例以及凋亡生精小管中凋亡細(xì)胞數(shù)量。

1.3.3伊文思藍(lán)（Evans blue，EB）注射觀察血睪屏障

將小鼠用戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉后，從尾靜脈注射0.2%EB 0.15 mL，30 min 后通過心臟注射磷酸鹽緩沖液（Phosphate buffered saline，PBS）至流出無色液體，取出睪丸進(jìn)行冰凍切片，切下的片子立刻在熒光顯微鏡下觀察。

1.3.4精子數(shù)量、畸形率及活力檢測

小鼠處死后取出附睪，剔除多余脂肪，截取附睪尾部，用小刀劃幾個小口，放于M 2胚胎培養(yǎng)基中，輕輕晃動2 min，在37 ℃下孵育20 min，用100 μm 孔徑的細(xì)胞篩將精子懸液過濾，在計算機輔助精子分析儀（CASA）下進(jìn)行分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

使用IBM SPSS statistics 20 軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，兩組數(shù)據(jù)之間采用完全隨機設(shè)計兩獨立樣本t檢驗，多組之間比較應(yīng)用方差分析，p＜0.05時認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 毫米波輻射對小鼠睪丸形態(tài)的影響

HE 染色結(jié)果如圖2 所示。由圖2 可知，輻照1～4 周，MMW 組與Sham 組相比睪丸形態(tài)無明顯差異，輻照第5 周，MMW 組出現(xiàn)生精上皮脫落，第6 周可見不同程度的管腔擴大，第7 周、8 周生精細(xì)胞排列紊亂，生精細(xì)胞數(shù)量減少，空泡形成，第9周管腔內(nèi)無精子，有大量空泡。生精小管直徑及Johnsen評分顯示，前4 周MMW組與Sham組相比Johnsen 評分無明顯差異，從第5 周開始MMW組較Sham組明顯下降，第9周下降最顯著，如圖2（b）、（c）所示。結(jié)果表明長期輻照下的睪丸損傷從第5周開始，隨著輻照時間的增加，損傷加重。

圖2（a）輻照1～9周后小鼠睪丸形態(tài)的變化；（b）輻照1～9周后生精小管直徑；（c）輻照1～9周后Johnsen評分（n=5，與Sham組相比，*p＜0.05，**p＜0.01）Fig.2 (a)The changes of testicular morphology after 1～9 weeks of irradiation;(b)the diameter of seminiferous tubules after 1～9 weeks of irradiation;(c)the Johnsen score after 1～9 weeks of irradiation(n=5,compared with the Sham group,*p＜0.05,**p＜0.01)

2.2 毫米波輻射對小鼠生精細(xì)胞凋亡的影響

TUNEL染色顯示前4周MMW組與Sham組凋亡細(xì)胞均無顯著增加，從第5周開始，MMW組睪丸生精細(xì)胞凋亡較Sham 組明顯增加，如圖3（a）所示；統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，與Sham 組相比，MMW 組凋亡陽性管腔數(shù)量從第5周開始增加，隨著輻照時間的延長，凋亡陽性管腔數(shù)量逐漸增加，第9周凋亡陽性管腔數(shù)量顯著增加，如圖3（b）所示；統(tǒng)計每個凋亡陽性管腔中的凋亡細(xì)胞數(shù)量，結(jié)果顯示，從第5周開始MMW組較Sham組增加，至第9周凋亡細(xì)胞明顯增加，如圖3（c）所示。通過TUNEL 染色結(jié)果可以看出，毫米波引起的睪丸生精細(xì)胞凋亡從第5 周開始，隨著輻照時間的延長，凋亡隨之加重，第9周時凋亡細(xì)胞明顯增多，其規(guī)律與形態(tài)變化基本一致。

圖3（a）MMW組與Sham組睪丸細(xì)胞TUNEL染色結(jié)果；（b）輻照4～9周后，兩組凋亡管腔占所有管腔的百分比；（c）輻照4～9周后，平均每個凋亡管腔中凋亡細(xì)胞數(shù)量（n=5，與Sham組相比，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001）Fig.3 (a)TUNEL staining of testis cells in MMW group and Sham group；(b)the percentage of apoptotic lumen in all lumen in two groups after 4～9 week exposure；(c)the average number of apoptotic cells per apoptotic lumen after 4～9 week exposure(n=5,compared with the Sham group,*p＜0.05,**p＜0.01,***p＜0.001)

2.3 毫米波輻射對小鼠血睪屏障的影響

鼠尾靜脈注射伊文思藍(lán)后觀察血睪屏障（BTB），結(jié)果如圖4 所示。由圖4 可知，從第5 周開始，可觀察到伊文思藍(lán)滲透到生精小管中，往后各周均可觀察到此現(xiàn)象，且輻照第9周較其他周更為明顯。

圖4 毫米波輻照4～9周后小鼠血睪屏障變化Fig.4 Changes of blood-testis barrier in mice after 4～9 week millimeter wave radiation

2.4 毫米波輻射對小鼠精子數(shù)量及活力的影響

提取附睪精子后通過CASA分析，結(jié)果如圖5所示。由圖5可知，與Sham組相比，MMW組第9周精子數(shù)量明顯下降，精子畸形率在5～9周明顯升高，且隨著照射時間的增長，畸形率升高程度顯著?？偦盍Γ▓D6（a））及前向運動率（圖6（b））從輻照第7 周開始較Sham 組明顯降低，往后各周均有統(tǒng)計學(xué)差異。

圖5（a）輻照4～9周后小鼠精子數(shù)量的變化；（b）精子畸形率的變化（n=5，與Sham組相比，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001）Fig.5 (a)Changes of sperm count of mice after 4～9 weeks of irradiation;(b)changes of sperm deformity rate(n=5,compared with the Sham group,*p＜0.05,**p＜0.01,***p＜0.001)

圖6（a）輻照4～9周后小鼠精子總活力的變化；（b）輻照4～9周后小鼠精子前向運動力的變化（n=5，與Sham組相比，*p＜0.05）Fig.6 (a)Changes of the total sperm motility of mice after 4～9 week exposure；(b)changes of forward motility of mice sperm after 4～9 week exposure(n=5,compared with the Sham group,*p＜0.05)

3 討論

近年來，毫米波器件性能的不斷提高促進(jìn)了毫米波在各個領(lǐng)域的應(yīng)用。目前，基于毫米波頻段的應(yīng)用主要體現(xiàn)在毫米波通信、毫米波成像及毫米波雷達(dá)等方面［2］，民眾及作業(yè)人員暴露于毫米波輻射的風(fēng)險也大大增加。由于毫米波的波長短、頻率高、穿透能力差［7］，當(dāng)前關(guān)于毫米波生物效應(yīng)的研究主要集中于生物體表淺部位［8］，如皮膚、角膜等體表較淺的器官［9-12］，但也有研究發(fā)現(xiàn)，毫米波可對內(nèi)臟器官產(chǎn)生影響［13］，且主要研究短期熱效應(yīng)對生物體的損傷。而在實際情況中，毫米波作業(yè)人員會在長時間內(nèi)受到多次低劑量輻照，其在作業(yè)人員體內(nèi)是否有累積效應(yīng)目前尚不清楚。長時程、低劑量毫米波的生物效應(yīng)、損傷機制及保護策略的研究是電磁生物學(xué)領(lǐng)域亟需解決的重要問題，而毫米波對雄性生殖系統(tǒng)是否有損害至今未知。本研究聚焦于持續(xù)毫米波輻射對小鼠雄性生殖系統(tǒng)的影響，并展開相關(guān)研究。目前認(rèn)為微波輻射功率密度大于10 mW/cm2主要產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)為熱效應(yīng)［14］。本研究采用10 mW/cm2的功率密度，同時排除熱效應(yīng)對小鼠的損傷，探究非熱效應(yīng)最大功率密度參數(shù)下對小鼠生殖系統(tǒng)的影響，根據(jù)目前已知文獻(xiàn)，探究長期微波輻射效應(yīng)的實驗多采用2 h/d，持續(xù)1～2月的時間［4-5,15］。本研究采用相對時間較長的方式對小鼠雄性生殖器官部位進(jìn)行局部照射。結(jié)果表明：在10 mW/cm2劑量下，長時間暴露于毫米波輻射將直接損害小鼠的睪丸及生殖潛能，且發(fā)現(xiàn)輻照時間對小鼠生殖系統(tǒng)損傷具有累積效應(yīng)。

本研究首先通過HE 染色觀察輻照1～9 周后每周小鼠睪丸形態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)在連續(xù)輻照第5周時開始出現(xiàn)睪丸形態(tài)的變化，通過生精小管直徑及Johnsen 評分評估形態(tài)的損害。結(jié)果顯示，5～9 周的睪丸形態(tài)的損傷程度MMW 組較Sham 組有明顯差異，且輻照第9周損傷最顯著，說明毫米波輻射只有累積到一定程度時才會產(chǎn)生損傷，且會隨著輻照時間的增加產(chǎn)生累積效應(yīng)。結(jié)果表明，持續(xù)5周毫米波輻照是雄性小鼠生殖系統(tǒng)損傷的閾值，因此著重對4～9周的損傷效應(yīng)進(jìn)行驗證。

基于HE 結(jié)果，我們進(jìn)一步通過TUNEL 染色方法對MMW 組及Sham 組小鼠睪丸生精細(xì)胞凋亡水平進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)從輻照第5周開始，生精細(xì)胞凋亡率MMW 組較Sham 組升高，統(tǒng)計4～9 周凋亡數(shù)量的變化，發(fā)現(xiàn)凋亡管腔占所有管腔的百分比和平均每個凋亡管腔中凋亡細(xì)胞的數(shù)量均隨著照射時間的延長而增加。細(xì)胞凋亡是由于外界刺激觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)程序性死亡而引發(fā)細(xì)胞自殺的過程，睪丸中生精細(xì)胞自發(fā)性退化通過細(xì)胞凋亡發(fā)生［16］，國內(nèi)外研究表明，微波輻照可引起睪丸細(xì)胞的凋亡［15,17-19］，也有研究證明，微波輻照可以持續(xù)時間依賴性的方式增加凋亡嚴(yán)重程度［5］。本研究證明高頻率的毫米波輻照可引起睪丸生精細(xì)胞凋亡，且具有累積效應(yīng)，其具體機制需要進(jìn)一步探究。

為進(jìn)一步明確生殖損傷的原因，我們通過EB尾靜脈注射方法觀察毫米波輻照后BTB 的變化。在輻照第5 周時，輻照組可觀察到EB 在管腔內(nèi)沉積，至第9 周時可觀察大量EB 在管腔內(nèi)沉積。BTB 是睪丸中血管和曲細(xì)精管之間的物理屏障，由曲細(xì)精管支持細(xì)胞之間的緊密連接形成，本研究發(fā)現(xiàn)毫米波輻照會破壞血睪屏障，影響生精細(xì)胞發(fā)育。但本實驗中發(fā)現(xiàn)輻照后5～8周血睪屏障損傷無明顯加重現(xiàn)象，損傷累積效應(yīng)不明顯，這可能與支持細(xì)胞有關(guān)。支持細(xì)胞間所形成的緊密連接，是構(gòu)成BTB 的形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)，支持細(xì)胞對各種刺激有較大的耐受性，一般不易遭到破壞，說明實驗中所用的毫米波參數(shù)尚不能引起血睪屏障的嚴(yán)重?fù)p害。

CASA分析顯示，精子數(shù)量在輻照前8周均無明顯差異性，輻照第9周可觀察到輻照組精子數(shù)量較Sham組明顯下降；精子活力檢測結(jié)果表明，在輻照7～9 周時精子活力較Sham 組明顯下降?？紤]這種結(jié)果也可能與毫米波輻照的累積效應(yīng)有關(guān)，只有當(dāng)輻照累計到一定程度時，才會引起精子數(shù)量及活力的變化。目前研究表明微波輻射具有累積效應(yīng)［4-5，20-21］，但關(guān)于毫米波的累積效應(yīng)尚不清楚，長時間的毫米波暴露產(chǎn)生的生物效應(yīng)是值得關(guān)注的問題。本研究雖證明毫米波輻射可引起睪丸形態(tài)和功能學(xué)的改變，且具有累積效應(yīng)，但由于吸收劑量和頻率單一，沒有探討不同頻率、不同功能密度下的變化，還需要進(jìn)一步探究在不同參數(shù)下的損傷效應(yīng)。同時毫米波損傷的具體機制仍不清楚，未來應(yīng)將轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)應(yīng)用于研究中，發(fā)現(xiàn)新的損傷機制及對損傷機制的信號通路進(jìn)行深入研究。

本研究發(fā)現(xiàn)，在每天輻照2 h，持續(xù)5 周的情況下，毫米波輻射可引起雄性小鼠生殖損傷，并且損傷效應(yīng)與輻照時間存在量效關(guān)系。根據(jù)此結(jié)果推測，短期低劑量的毫米波輻射相對安全，但對于長時間作業(yè)人員，毫米波可能對男性生殖造成危害，且有累積效應(yīng)，應(yīng)加強作業(yè)人員的防護。本研究評估了34.5 GHz 毫米波輻射導(dǎo)致生殖損傷情況，對了解毫米波損傷的生物效應(yīng)和機理有一定的參考價值。

作者貢獻(xiàn)說明唐正實施研究過程、采集整理數(shù)據(jù)、統(tǒng)計分析、文章撰寫；魏金花指導(dǎo)實驗過程、修改文章；張磊和翟倩技術(shù)和材料支持；袁建林獲取研究經(jīng)費、指導(dǎo)性支持；李臻獲取研究經(jīng)費、提出研究思路、設(shè)計研究方案及修改文章。