曾軍 孟千琳 李奇 馬春蘭 鄭鵬城 李萬(wàn)成

金黃色葡萄球菌是一種最常見(jiàn)臨床致病菌，常引起社區(qū)獲得性或醫(yī)院獲得性感染，自耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)發(fā)現(xiàn)以來(lái)，由其引起的感染迅速在全球流行[1]。近年來(lái)，雖然MRSA檢出率表現(xiàn)出逐漸下降趨勢(shì)，但仍然是最主要的一類耐藥致病菌。

感染是ICU患者最常見(jiàn)并發(fā)癥，也是發(fā)展為膿毒癥的必需因素；據(jù)EPIC III報(bào)道，約57%的ICU患者合并有可疑或確診感染，感染后病死率達(dá)到30%，其中MRSA是最常見(jiàn)的耐藥致病菌之一[2]。

因此，對(duì)醫(yī)院RICU病房MRSA感染的耐藥特征、分子分型調(diào)查和分析，有助于提供針對(duì)性的治療策略，提高RICU病房病人的臨床預(yù)后，現(xiàn)將本文研究結(jié)果報(bào)告如下。

資料與方法

一、材料

取成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院RICU病房2017年1月至2020年12月自病人的痰標(biāo)本、肺泡灌洗液、血液、尿液等標(biāo)本中分離出的52株MRSA作為受試對(duì)象，均符合MRSA感染診斷標(biāo)準(zhǔn)《醫(yī)院感染診斷標(biāo)準(zhǔn)(試行)》[3]。本研究經(jīng)成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)。

二、細(xì)菌分離及鑒定

先通過(guò)VITEK-2 Compact全自動(dòng)微生物鑒定藥敏分析儀鑒定為金黃色葡萄球菌，質(zhì)控菌株為金黃色葡萄球菌ATCC25923。MRSA的鑒定采用頭孢西丁紙片擴(kuò)散法，參照美國(guó)臨床與實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(CLSI)M100-S30 文件執(zhí)行。

三、藥敏實(shí)驗(yàn)

采用瓊脂稀釋法：將0.5麥?zhǔn)蠞岫葐挝坏木鷳乙?，用CAMHB肉湯將初始接種物1 ∶100倍稀，菌液濃度約為1×106 CFU/mL，用多點(diǎn)接種儀吸取0.05 mL接種于含系列稀釋抗菌藥物CAMHB肉湯，35℃孵育16～20h后觀察結(jié)果，計(jì)算抗菌藥物MIC50、MIC90。藥敏結(jié)果判斷參照美國(guó)CLSI M100-S30判斷標(biāo)準(zhǔn)，所用15種抗生素包括苯唑西林、頭孢唑林、呋喃妥因、甲氧芐啶/磺胺甲惡唑(復(fù)方新諾明), 紅霉素、克林霉素、利福平、利奈唑胺、慶大霉素、四環(huán)素、替加環(huán)素、替考拉寧、萬(wàn)古霉素、左氧氟沙星、莫西沙星。

四、分型檢測(cè)方法

多位點(diǎn)序列分型(MLST)聯(lián)合SCCmec分型方法進(jìn)行分子分型。使用PubMLST數(shù)據(jù)庫(kù)網(wǎng)站(https://pubmlst.org/)推薦引物，PCR擴(kuò)增7個(gè)管家基因(arc C、aro E、glp F、gmk、pta、tpi和yqi)，擴(kuò)增片段送生工生物測(cè)序，測(cè)序結(jié)果登錄PubMLST數(shù)據(jù)庫(kù)經(jīng)過(guò)序列比對(duì)，以獲取等位基因號(hào)，最終確定MLST分型。SCCmec基因分型使用5對(duì)特異性引物，對(duì)每株MRSA基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳鑒定擴(kuò)增產(chǎn)物，鑒定五種類型(I、II、III、IV、V), 其余判定為未定型(NT),具體方法參考文獻(xiàn)[4-5]。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、標(biāo)本來(lái)源

30.76% MRSA標(biāo)本來(lái)源中痰標(biāo)本，占比最高；21.15%來(lái)源于肺泡灌洗液。呼吸系統(tǒng)是MRSA的主要來(lái)源，其余來(lái)源(見(jiàn)表1)。

表1 RICU病房52株MRSA標(biāo)本來(lái)源

二、藥敏試驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)

MRSA對(duì)苯唑西林、頭孢唑林及紅霉素的耐藥率高，分別達(dá)到100.00%、100.00%及84.62%；對(duì)克林霉素、四環(huán)素、左氧氟沙星的耐藥率較高，分別為48.08%、28.85%及和32.69%；其次為甲氧芐啶/磺胺甲惡唑、慶大霉素、莫西沙星，耐藥率分別為13.46%、15.38%及17.31%。暫未發(fā)現(xiàn)對(duì)利奈唑胺、替加環(huán)素、替考拉寧及對(duì)照組萬(wàn)古霉素耐藥株(見(jiàn)表2)。

表2 52株MRSA的抗菌藥物藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果

三、MLST分型結(jié)果

52株MRSA分屬為13個(gè)MLST型，其中主要為ST59(21株，40.38%)及ST5(14株，26.92%)；共鑒定出5種SCCmec型，主要為IV型(36株，69.23%)及III型(10株，19.23%)(見(jiàn)表3)。

表3 MLST及SCCmec分型結(jié)果

討 論

金黃色葡萄球菌可采用脈沖場(chǎng)凝膠電泳(PFGE)、多位點(diǎn)序列分型(MLST)、SCCmec等多種技術(shù)進(jìn)行分型鑒定[4]。PFGE為限制性核酸內(nèi)切酶多態(tài)性分型技術(shù)，作為細(xì)菌分型性檢測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”，可用于研究同種菌株間的同源性、分子流行病學(xué)研究等[6]。然而，細(xì)菌在進(jìn)化過(guò)程中會(huì)隨機(jī)發(fā)生各種點(diǎn)突變、基因片段缺失或插入等遺傳變異，造成目的基因酶切位點(diǎn)在空間分布或/和數(shù)量上發(fā)生改變，進(jìn)而造成同一菌株其PFGE電泳圖譜呈現(xiàn)多樣性；并且，PFGE的結(jié)果判讀有較強(qiáng)的主觀性，有作者認(rèn)為同一電泳圖譜的解讀可能不盡相同，影響解讀結(jié)果[7]。MLST分型技術(shù)基于7個(gè)管家基因，因其核酸序列進(jìn)化上保守，良好的延續(xù)性確保了較高的菌株分辨力。并且，測(cè)序結(jié)果客觀，因此其對(duì)菌株的分型更加準(zhǔn)確，更廣泛被應(yīng)用[8-9]。

MRSA是臨床常見(jiàn)的耐藥菌，常引起重癥肺炎、導(dǎo)管內(nèi)感染、皮膚軟組織感染、膿毒癥或膿毒癥休克等嚴(yán)重的感染性疾病，對(duì)其耐藥性分析及分型鑒定一直是醫(yī)院感染病研究工作重點(diǎn)。本次提取樣本的實(shí)驗(yàn)分析顯示，我院RICU病房MRSA菌株主要來(lái)自呼吸道分泌物，其次為血液、胸腔引流液、皮膚軟組織、尿液與腹腔引流液，與文獻(xiàn)報(bào)道較為相符[10]。

本研究結(jié)果表明MRSA具有多重耐藥特征，對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物高度耐藥，對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)素類、磺胺類、氨基糖苷類與喹諾酮類等抗菌藥物都表現(xiàn)出不同程度的耐藥，僅有噁唑烷酮類、糖肽類、甘氨酰四環(huán)素類抗生素表現(xiàn)出高度敏感性。對(duì)苯唑西林、頭孢唑林完全耐藥；紅霉素耐藥率高達(dá)84.62%；第三代喹諾酮類藥物左氧氟沙星和莫西沙星耐藥率分別為32.69%和17.31%；甲氧芐啶/磺胺甲惡唑、慶大霉素耐藥率分別為13.46%及15.38%，耐藥率相對(duì)較低。治療MRSA 感染的一線藥物可選擇萬(wàn)古霉素、利奈唑胺或替加環(huán)素等，其中萬(wàn)古霉素是治療MRSA 感染的首選藥物[11]。雖然達(dá)托霉素已被證實(shí)對(duì)MRSA 感染有良好的治療效果，但在肺部無(wú)抗菌活性，故不作為肺部MRSA感染治療常規(guī)抗菌藥。其他部位MRSA感染可考慮使用達(dá)托霉素，但其存在費(fèi)用高昂，臨床用藥經(jīng)驗(yàn)缺乏等問(wèn)題[12]。

由于MRSA的耐藥性存在區(qū)域差異，MRSA感染經(jīng)驗(yàn)治療的抗生素選擇需根據(jù)不同區(qū)域MRSA的耐藥模式、感染部位、藥物可選擇性、藥物不良反應(yīng)等因素決定[13]。臨床應(yīng)用主要根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果決定聯(lián)合用藥模式，并重視抗菌藥物管理，改善MRSA感染治療結(jié)局并減少耐藥性產(chǎn)生。