林迎春，張芳，喬鳳昌，張翠平，焦嬌，胡平

(南京醫(yī)科大學附屬婦產(chǎn)醫(yī)院&南京市婦幼保健院產(chǎn)前診斷中心，南京 210004)

Dravet綜合征(dravet syndrome, DS)是最典型的發(fā)育性癲癇性腦病，其發(fā)病率約為1/40 000～1/20 000[1]，具有起病早、發(fā)作形式多樣及對抗癲癇藥物不敏感等特點。目前報道的DS致病基因包括電壓門控性鈉離子通道α亞單位基因(SCN1A、SCN2A、SCN8A、SCN9A)，原鈣黏蛋白19(PCDH19)，GABA受體α1亞型(GABRA1)，γ-氨基丁酸γ2受體基因(GABRG2)及染色質(zhì)解旋酶DNA結(jié)合蛋白2(CHD2)等，但DS主要是由SCN1A雜合性功能缺失突變所致[2]。2001年，Claes等[3]首次在DS患者中發(fā)現(xiàn)SCN1A基因突變，并證實其可以編碼電壓門控鈉通道。以往研究證實與DS相關(guān)的SCN1A基因突變占比約為85%[4]。SCN1A是常染色體顯性遺傳基因，多數(shù)為新發(fā)突變，低于10%的突變遺傳自突變嵌合體父母[5]。近年來，隨著全外顯子測序技術(shù)的發(fā)展，為癲癇的遺傳學病因分析、遺傳咨詢以及精準治療提供了重要的支撐[6]。本研究擬采用全外顯子測序技術(shù)診斷2例不明原因癲癇伴精神運動發(fā)育遲緩患兒，并發(fā)現(xiàn)患兒SCN1A基因均存在新發(fā)雜合突變，分別為c.5354T>C(p.I1785T)和c.4380T>A(p.Y1460*)。報道如下。

1 研究對象和方法

1.1研究對象 患兒一，男，15歲，漢族，1周歲診斷為癲癇，每月發(fā)作2次，口服奧卡西平至今，但效果欠佳?；純喊l(fā)病后出現(xiàn)進行性精神運動發(fā)育遲緩，尤其是語言發(fā)育遲緩，智商檢測為重度智力低下(IQ30)?；純和庠耗X電圖及頭顱MRI檢查未見異常。

患兒二，女，8歲，漢族，患兒存在全面發(fā)育遲緩，智力低下，語言、運動發(fā)育落后，肢體不協(xié)調(diào)，4個月癲癇發(fā)作，開始時每1～2個月發(fā)作1次，藥物治療每3～4個月后發(fā)作1次。

2例患兒均就診于南京醫(yī)科大學附屬婦產(chǎn)醫(yī)院醫(yī)學遺傳中心，患兒一就診時間為2020年11月，患兒二就診時間為2021年7月。行外周血及染色體微陣列芯片檢查均未見異常，征得2例患兒父母同意，擬對2例患兒進行全外顯子測序檢測以尋找致病基因及位點，本研究獲得南京醫(yī)科大學附屬婦產(chǎn)醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準(No.寧婦倫字 [2019] KY-081號)，患兒家屬簽署知情同意書。

1.2主要儀器與試劑 S220型Covaris 超聲破碎儀(美國Covaris公司)，BECKMAN Allegra X-12 R離心機(美國Beckman coulter公司)，Qubit3.0熒光儀(美國Thermo公司)，Veriti 梯度PCR 儀(美國ABI公司)，Illumina Hiseq2500 測序儀(美國Illumina公司)。DNA 提取試劑盒(德國Qiagen公司)，PCR擴增試劑(南京諾唯贊公司)，Agilent SureSelect QXT ALL Human Exon V6 kit試劑盒(美國Agilent公司)，文庫構(gòu)建試劑盒(德易東方公司)。

1.3方法

1.3.1標本采集 2例患兒及其父母在遺傳咨詢門診就診后，選擇基因診斷進行遺傳學病因分析。分別對2個家庭的患兒和父母采集外周血2～3 mL(無需空腹)，EDTA-K2抗凝，樣本置于4 ℃保存。按照DNA 提取試劑盒說明書在采血后48 h內(nèi)完成基因組DNA提取，純化的DNA以及剩余的血液樣本置于-20 ℃保存。

1.3.2全外顯子測序 按照DNA 提取試劑盒說明書提取2例患兒及其父母基因組DNA，所得DNA濃度均>50 ng/μL，總DNA量>2.0 μg。基因組DNA經(jīng)打斷后進行文庫構(gòu)建，雜交捕獲后上機測序。測序結(jié)果用BWA0.6.2-r126軟件(https://sourceforge.net/projects/bio-bwa/)與人類參考基因組序列(GRch37/hg19)比對，去掉建庫過程中因PCR擴增產(chǎn)生的冗余信息，運用GATK軟件(http://www.broadinstitute.org/gatk/)識別序列中的單核苷酸變異及基因組小片段的插入或缺失。采用Annovar注釋軟件(https://annovar.openbioinformatics.org/en/latest/)對識別出的變異位點進行注釋及分類，并對測序深度、覆蓋深度等進行統(tǒng)一描述。

1.3.3檢出變異的生物信息學分析 通過ExAC Browser(https://exac.broadinstitute.org/)、Genome Aggregation Database(http://gnomad.broadinstitute.org)、the 1000 Genomes Project(http://gnomad.broadinstitute.org)、dbSNP(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/)獲得突變位點在正常人群中的頻率；通過OMIM、HGMD和ClinVar等數(shù)據(jù)庫，注釋已報道的致病基因及位點等，并與疾病關(guān)聯(lián)。此外，通過SIFT、Polyphen-2、MutationTaster和PROVEAN軟件預(yù)測錯義突變對蛋白質(zhì)功能的影響；通過Human Splicing Finde、regSNP-intron和MutationTaster軟件對剪切位點附近的突變進行預(yù)測。對檢出突變位點致病性的評估采用ACMG(2015)評級指南[7]。

1.3.4Sanger測序驗證 采用NCBI在線軟件(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHom)對2個SCN1A基因變異位點設(shè)計引物，c.5354T>C(p.I1785T)上游引物序列：5′-GCTAGCACCCATTCTCAAC-3′，下游引物序列：5′-GTTTGGTTGTGGCAGATTG-3′，產(chǎn)物片段大小為349 bp。c.4380T>A(p.Y1460*)上游引物序列：5′-GAAATGAGACTGCTCGATG-3′，下游引物序列：5′-CCTGGTCGAGGTATAGGC-3′，產(chǎn)物片段大小為376 bp。PCR反應(yīng)體系均為50 μL，包括25 μL PCR mix，10 μmol/L上、下游引物各2 μL，DNA模板2 μL，ddH2O 19 μL。PCR反應(yīng)參數(shù)：95 ℃ 10 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35個循環(huán)；72 ℃ 10 min。擴增產(chǎn)物送至蘇州金唯智公司進行測序。

2 結(jié)果

2.1外顯子捕獲測序結(jié)果及變異位點致病性分析 2例患兒全外顯子測序質(zhì)控數(shù)據(jù)結(jié)果合格，樣本數(shù)據(jù)量、測序深度及覆蓋度見表1。結(jié)果發(fā)現(xiàn)患兒一SCN1A基因第29號外顯子存在c.5354T>C(p.I1785T)雜合突變，為錯義突變，使該處氨基酸序列發(fā)生改變。患兒二SCN1A基因第26號外顯子存在c.4380T>A(p.Y1460*)雜合突變，為無義突變，截斷第1 460處的蛋白質(zhì)翻譯，產(chǎn)生截短蛋白，2例患兒父母相應(yīng)位點均為野生型。此外，2例患兒還檢測出表型相關(guān)的其他變異，為意義未明變異，同時根據(jù)ACMG SFv2.0推薦范圍內(nèi)未檢出與表型不相關(guān)的致病變異或疑似致病變異[8]。對檢出位點在不同物種的保守性進行了評估，發(fā)現(xiàn)c.5354T>C(p.I1785T)和c.4380T>A(p.Y1460*)在各物種間均高度保守(圖1)。

表1 測序數(shù)據(jù)量

圖1 不同物種兩突變位點同源序列比對

根據(jù)ACMG(2015)發(fā)布的關(guān)于變異的解讀標準對該位點進行分析，判定c.5354T>C(p.I1785T)變異證據(jù)為PS2+PM2+PP2+PP3，為可疑致病變異；c.4380T>A(p.Y1460*)變異證據(jù)為PVS1+PS2+PM2，為致病變異。

2.2Sanger測序驗證結(jié)果 2例患兒Sanger測序結(jié)果與全外顯子捕獲測序結(jié)果一致，患兒父母的外周血樣本中并未檢測出相應(yīng)位點的變異，因此，c.5354T>C(p.I1785T)和c.4380T>A(p.Y1460*)為新發(fā)變異(圖2)。

圖2 Sanger測序驗證2例患兒及其父母SCN1A基因的雜合突變

3 討論

SCN1A基因(NM_001165963.4)位于2q24.3，有29個外顯子，編碼2 009個氨基酸。其編碼的蛋白質(zhì)為Nav1.1，對控制中樞神經(jīng)系統(tǒng)的興奮性起重要的調(diào)節(jié)作用[9]。本研究發(fā)現(xiàn)的c.5354T>C(p.I1785T)和c.4380T>A(p.Y1460*)突變位點分別位于Nav.1.1的DIVS6和DⅢS6區(qū)。SCN1A基因突變所致環(huán)門孔區(qū)結(jié)構(gòu)異常會引起鈉通道通透性及電壓敏感性變化，涉及功能突變(截短或錯義)，使得Nav1.1鈉離子通道單極化不足，導致GABA能神經(jīng)元興奮性下降，錐體神經(jīng)元興奮性增強，誘發(fā)神經(jīng)發(fā)育異常與癲癇產(chǎn)生，最終導致DS[10]。故而證實本研究檢出的新發(fā)突變是2例患兒的主要致病原因。

2例患者均屬于新發(fā)突變，再發(fā)風險較低，但也存在父母生殖腺突變嵌合體的可能。因此，告知兩對夫婦可以正常懷孕，但再孕時，建議考慮進行針對變異位點的產(chǎn)前診斷?；純阂荒赣H再次妊娠，孕19周時到本院做產(chǎn)前遺傳咨詢，筆者建議針對突變位點做羊水穿刺及胎兒染色體分析。經(jīng)充分咨詢及告知風險后，患者家屬放棄產(chǎn)前診斷，告知其做好后續(xù)的各項孕期和新生兒檢查，如有異常應(yīng)及時就診。孕30周胎兒超聲系統(tǒng)篩查未見異常，筆者將對該家系進行持續(xù)隨訪。

Dravet綜合征作為耐藥性癲癇的代表性疾病，盡早明確診斷有助于臨床精準治療。目前，大部分DS患者使用鈉通道阻滯劑[11]，其中經(jīng)典抗癲癇藥物鈉通道阻滯劑(如奧卡西平)是DS的禁忌[1]。de Lange等[11]首先證實了鈉通道阻滯劑會加重肌痙攣，并對患者的認知產(chǎn)生負面影響。但由于DS的臨床表現(xiàn)多樣，影像學檢查亦無陽性發(fā)現(xiàn)，因此該病很容易被漏診、誤診。本研究中的患兒由于早期未得到及時正確地診斷，在治療過程中長期服用DS禁忌藥奧卡西平，加重了神經(jīng)功能損害。在回訪中建議該患兒于小兒神經(jīng)科就診，進一步調(diào)整其治療方案并對其隨訪。