尚麗娜，熊學艷，蔣益，戴標，王春來，毛旭華

(1.寧夏吳忠市人民醫(yī)院兒科，寧夏吳忠 751100；2.銀川市婦幼保健院普兒科，銀川 750000；3.江蘇大學附屬宜興醫(yī)院 a.兒科，b.體檢中心，c.檢驗科，江蘇無錫 214200)

發(fā)育性癲癇性腦病9型(developmental and epileptic encephalopathy-9，DEE9)是一種以認知功能障礙、發(fā)育遲緩、精神異常為特征的早發(fā)性癲癇癥。該疾病與位于Xq22染色體上的原鈣黏蛋白19(Protocadherin 19, PCDH19)密切相關，PCDH19基因可以編碼鈣依賴性細胞黏附蛋白——PCDH19[1]，該蛋白質主要在中樞神經系統(tǒng)中表達，可以調節(jié)神經元細胞增殖、細胞黏附、細胞遷移以及突觸傳遞?；螯c突變或基因片段缺失、插入、重復等致病變異形式均可能會導致PCDH19基因功能異常。PCDH19基因突變被認為是DEE9的主要誘因。在DEE9患者中，攜帶PCDH19基因突變的雜合子女性發(fā)病，攜帶此突變的半合子男性不發(fā)病，但含有2種不同遺傳特征細胞群的嵌合體男性發(fā)生PCDH19基因突變時，會出現DEE9疾病癥狀[2]。本研究擬調查一DEE9家系的基因型，對患兒及其父母外周血進行外顯子組高通量測序，確定患兒遺傳學病因，以期提高臨床醫(yī)師對DEE9的認識。

1 對象與方法

1.1研究對象 患兒女性，3歲5個月，主因“半天內抽搐4次”于2021年10月入住銀川市婦幼保健院兒科。患兒入院前半天無明顯誘因出現抽搐，表現為意識喪失，呼之不應，雙眼凝視、口吐白沫，雙手握拳，四肢抖動持續(xù)10余秒抽搐自行緩解，無大小便失禁，無發(fā)熱及頭痛。追問病史，患兒1歲5月齡有無熱驚厥病史，腦電圖異常，經口服左乙拉西坦口服液1.5 mL/次，2次/日抗癲癇治療，服藥1年后無發(fā)作故而自行停藥。出生史無異常，父母體健，否認近親婚配及家族遺傳性疾病。

入院體格檢查T：36.8 ℃，P：90次/分，R：20次/分，神志清楚，咽部充血，雙側扁桃體1度腫大。雙肺呼吸音清晰，未聞及干濕性啰音。心率90次，心律齊，未聞及病理性雜音。腹部無異常。生理反射存在，病理反射未引出，四肢肌力正常。入院后輔助檢查血常規(guī)：血細胞計數8.82×109/L，紅細胞4.49×1012/L，血紅蛋白128 g/L，血小板247×109/L，淋巴細胞百分比20.3%，中性粒細胞百分比74.7%。C-反應蛋白0.29 mg/L，肌鈣蛋白6.45 pg/mL。血糖、肝腎功、電解質、血氣均正常。腦脊液常規(guī)及生化無異常。顱腦核磁示：右側額葉近中線處及右側頂枕葉交界處皮層下DWI異常信號影，不除外缺血缺氧后遺改變。監(jiān)測腦電圖：幼兒期異常腦電監(jiān)測，檢測中1次強直-陣攣發(fā)作。

入院后給予苯巴比妥鈉，咪達唑侖鎮(zhèn)靜治療，吸氧甘露醇降顱壓，患兒仍有反復抽搐。結合腦電圖結果，抗癲癇治療的左乙拉西坦口服液調整劑量3 mL/次，2次/日，抽搐次數減少。根據患兒臨床特征及輔助檢查高度懷疑遺傳學疾病可能。為進一步明確診斷，經家長同意抽取患兒及父母外周血2 mL進行全外顯子基因測序(委托北京邁基諾基因科技股份有限公司檢測)。

1.2方法

1.2.1試劑與儀器 Blood Genomic DNA提取試劑盒(加拿大Norgen Biotek公司)，快速高保真DNA聚合酶(北京索萊寶公司)，DNA凝膠回收試劑盒(南京諾唯贊公司)，Sanger測序試劑盒(美國ThermoFisher公司)。NanoDrop One超微量紫外分光光度計(美國Thermo Fisher公司)，GTC96S梯度PCR基因擴增儀、CSL-RVMSCHOICE一體式核酸電泳儀(英國Cleaver Scientific公司)，ABI 3730XL自動測序儀(美國ABI 公司)，Illumina MiSeq測序系統(tǒng)(美國Illumina公司)。

1.2.2樣本收集及DNA抽提 用EDTA-K2抗凝血常規(guī)真空管采集患兒及其父母外周血樣本2 mL,置于-80 ℃保存。按照Blood Genomic DNA提取試劑盒說明書提取外周血DNA，產物用NanoDrop One超微量紫外分光光度計進行質量及純度檢測，取吸光度(A260 nm/A280 nm)值為1.7～1.8的DNA樣本進行后續(xù)試驗，樣本置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3全外顯子基因檢測突變位點 患兒及其父母外周血的全外顯子基因檢測按照參考文獻[3]，由北京邁基諾基因科技股份有限公司完成，該公司利用自主研發(fā)的GenCap?全外顯子基因捕獲技術結合Illumina MiSeq測序系統(tǒng)(美國Illumina公司)對目標區(qū)域內的23 000種基因進行檢測，序列讀數與GRCh37/hg19人類基因組組裝比對。為保證數據分析的精確性，利用蛋白質功能預測軟件REVEL(Rare Exome Variant Ensemble Learner)[4]對變異位點進行注釋解讀，按照突變形式、人群頻率、遺傳方式等指標對數據進行過濾，選擇與表型相關的致病位點進行后續(xù)研究。

1.2.4Sanger測序驗證突變位點 對患兒及其父母基因組運用Sanger測序進一步驗證全外顯子測序所獲得的致病位點，引物序列使用在線軟件Primer 6.0設計，并由上海擎科生物科技有限公司合成。序列覆蓋PCDH19基因(NC_000023.10)第1號外顯子中待驗證的致病位點及其側翼序列(PCDH19F：5′-CAAGGTGACCGACTCCAAT-3′，PCDH19R：5′-CGCCTATCTGCTCTCTGTGT-3′)。使用快速高保真DNA聚合酶對目標區(qū)域進行擴增。PCR擴增體系為50 μL，包括：ddH2O 40 μL，10×PCR mix 5 μL，PCDH19F 1 μL，PCDH19R 1 μL，dNTP 1 μL，DNA模板1 μL，高保真酶1 μL。PCR反應參數：95 ℃ 2 min；95 ℃ 20 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s，循環(huán)35次；72 ℃ 5 min。PCR產物經10 g/L瓊脂糖凝膠電泳后用DNA凝膠回收試劑盒純化，利用Sanger測序試劑盒進行測序反應，使用ABI 3730XL自動測序儀進行測序驗證。

2 結果

2.1先證者及其父母的PCDH19基因突變檢測結果 全外顯子組測序結果發(fā)現，患兒基因PCDH19(NM_001184880)在1號外顯子處存在c.851_852dupGC變異，且為雜合型，即在基因CDS序列中，第851和852位置處的核苷酸序列GC發(fā)生了重復性插入(圖1)。患兒父母未發(fā)生該突變。

注：Reference，參考序列；A，先證者測序結果；B，先證者父親測序結果及反向互補序列；C，先證者母親測序結果；紅色箭頭，GC插入突變。

2.2蛋白質翻譯預測結果 運用DNAMAN軟件對序列進行蛋白質翻譯預測，結果發(fā)現上述二核苷酸插入導致該基因編碼的蛋白質發(fā)生移碼突變，破壞了第284位氨基酸后的讀碼框，使第285位氨基酸由T變?yōu)锳，且在第305位處獲得一終止密碼子，從而使該蛋白質翻譯提前終止(圖2)。根據美國醫(yī)學遺傳學與基因組學學會(ACMG)指南[5]，該變異初步判定為致病性變異(Pathogenic)：該變異為零效變異(移碼突變)，可能導致基因功能喪失(極強致病性證據PVS1)。經家系驗證分析，患兒父親該位點無變異，患兒母親該位點無變異，此變異為自發(fā)突變(強致病性證據PS2)。該突變形式在正常人群頻率1 000 genomes(千人基因組)、ESP6500(NHLBI Exome Sequencing Project)、EXAC(The Exome Aggregation Consortium)和 EXAC-EAS(EXAC約 4000東亞人數據)數據庫中未見報道(中等致病性證據PM2)。經公共數據庫查詢，基因PCDH19(OMIM：300460)的突變可導致患者發(fā)生X染色體相關的DEE9(OMIM：300088)，該疾病特征與本案例先證者表型相符，但突變類型不一樣。Sanger測序驗證結果證實，受檢者PCDH19基因發(fā)生c.851_852dupGC雜合突變，父親和母親均未發(fā)生突變，突變類型屬于從頭突變，該家系圖譜見圖3。

圖3 該例DEE9患兒的家系圖譜

3 討論

DEE9又稱限于女性的癲癇伴智力低下病癥(epilepsy with mental retardation limited to females，EFMR)[6]，是一種嚴重的神經發(fā)育障礙疾病，主要由Xq22染色體上PCDH19基因突變導致其編碼的PCDH19蛋白在神經元連接、突觸膜信號傳遞等生物過程中的作用失調而致病[7]。PCDH19主要在海馬和大腦皮層的Ⅱ/Ⅲ層和Ⅴ層表達，也會與N-鈣黏蛋白相互作用，影響突觸可塑性[8]。DEE9的主要臨床特征包括：嬰幼兒時期發(fā)病、局灶性癲癇發(fā)作、失張力癲癇發(fā)作、智力缺陷、全面發(fā)育遲緩、全面性強直-陣攣發(fā)作、失神發(fā)作、全身性肌陣攣發(fā)作、發(fā)育倒退，其他臨床特征還包括自閉癥、精神異常。該病癥嚴重影響患兒的身心健康，同時會給患者家庭帶來較大的經濟負擔。

PCDH19基因有6個外顯子，其編碼的PCDH19包括信號肽、6個保守鈣黏蛋白重復序列組成的細胞外結構域、跨膜區(qū)域和細胞內C末端結構域。至今為止至少發(fā)現約有160多種PCDH19突變類型，包括堿基缺失或插入、剪切位點突變、無義突變、錯義突變等，大多數的突變發(fā)生在第1個外顯子，以新生突變?yōu)橹??；蛲蛔冃问接衏.812G>A(p.Gly271Asp)[9]、c.1508_1509 insT(p.Thr504Hisfs Ter19)[10]等，這些突變形式都可能導致PCDH19功能異常。但不是所有的PCDH19基因突變都會導致DEE9，還可能引起睡眠障礙等疾病[11]。PCDH19基因突變形式與疾病的相關性需要臨床醫(yī)生結合受檢者的臨床表現、家族史及其他檢測結果進行綜合分析。Depienne等[12]于2009 年報道了1 例男性DEE9患者存在PCDH19基因缺失的體細胞嵌合突變，患者外周血白細胞中整個PCDH19基因缺失，但在患者部分皮膚成纖維細胞中存在PCDH19等位基因，該發(fā)現提示了一種致病機理：PCDH19基因突變需要2個細胞群(突變體和野生型)才能發(fā)生疾病，而同質細胞群(無論是突變體還是野生型)都不會導致疾病。PCDH19基因突變與X染色體遺傳疾病發(fā)育性癲癇性腦病密切相關，臨床醫(yī)師應了解PCDH19基因的不同突變形式，提高對DEE9的認識。

在本研究中，對先證者及其父母進行全外顯子組測序，結果表明先證者的PCDH19基因在1號外顯子處存在c.851_852dupGC二核苷酸重復插入雜合突變，經數據分析發(fā)現，PCDH19基因編碼區(qū)第851～852位的核苷酸GC發(fā)生重復插入，該異常插入使得蛋白質翻譯發(fā)生移碼突變而提前終止于305位氨基酸處。PCDH19基因的第1個外顯子編碼PCDH19蛋白的細胞外重復序列[13]，該結構主要介導細胞之間的黏附作用及信號傳導功能，蛋白質翻譯的提前終止嚴重影響其正常生理功能。Lamers等[14]通過監(jiān)測DEE9小鼠模型中大腦皮質活動的電生理學表征，發(fā)現成年早期缺失PCDH19會導致疾病發(fā)作。該患兒出生后就有癲癇反復發(fā)作、驚厥、腦電監(jiān)測異?，F象，癥狀與DEE9相一致。由于PCDH19突變所致的DEE9為X染色體相關的遺傳疾病，PCDH19基因突變已被認為是DEE9的主要發(fā)病原因[15]，當表達野生型PCDH19的神經元和表達突變型PCDH19的神經元共存，或根本不表達，會破壞同質細胞群之間的黏附作用，擾亂細胞通訊，導致疾病發(fā)作[16]。高通量外顯子測序及Sanger測序證實本研究的先證者是致病雜合突變型，但患兒的父母未發(fā)生突變。先證者的PCDH19基因在1號外顯子發(fā)生c.851_852dupGC p.T285Afs*21從頭突變，是DEE9的一種新型突變方式。

隨著DEE9患者的數量不斷增加，PCDH19基因的突變形式不斷被發(fā)現，但對該基因突變導致這種綜合征的詳細分子機制知之甚少。本次研究中，筆者分析了患者的測序數據，后續(xù)可進一步通過分子細胞實驗評估該PCDH19突變形式對神經元細胞的影響，進而明確該突變形式的具體致病分子機制。綜上所述，本研究擴展了PCDH19關于DEE9疾病的突變形式，為遺傳咨詢、預后檢測和產前診斷提供了有力支持。