葛紅蓮，劉中華 ，張福麗

(周口師范學(xué)院 生命科學(xué)與農(nóng)學(xué)學(xué)院，河南 周口466001)

干旱是影響冬小麥生長(zhǎng)和產(chǎn)量的主要自然災(zāi)害之一[1-4]。干旱脅迫抑制小麥的生長(zhǎng)發(fā)育，并干擾小麥的生理代謝，降低葉綠素含量，減弱光合作用[2-4]；同時(shí)誘導(dǎo)小麥植株內(nèi)活性氧自由基(ROS)的過量產(chǎn)生與積累，對(duì)植株造成氧化損傷，引起膜脂的過氧化和MDA含量增加，破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，造成小麥植株生長(zhǎng)與發(fā)育受到抑制，導(dǎo)致小麥產(chǎn)量下降[3-4]。 因此，提高小麥的抗干旱能力對(duì)提高小麥產(chǎn)量和國(guó)家的糧食生產(chǎn)具有重要意義。

近年來，許多研究通過植物基因工程技術(shù)轉(zhuǎn)入外源抗干旱基因[5-6]和接種有益微生物菌劑來提高植物的抗旱能力[7-10]。有益微生物具有固氮、溶磷和溶鉀作用以及產(chǎn)生嗜鐵素、吲哚-3-乙酸(IAA)、1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸(ACC)脫氨酶、抗生素、5-氨基乙酰丙酸(ALA)等促生因子，對(duì)植物具有促生抗逆的作用[7-17]。Naveed等[7]用伯克霍爾德氏菌(Burkholderiaphytofirmans)PsJN接種干旱脅迫下的小麥幼苗，提高了小麥幼苗的干重、葉綠素含量、水分利用率和抗氧化酶活性，增強(qiáng)了小麥植株的抗旱能力。趙慧云等[8]用枯草芽孢桿菌處理干旱脅迫下的小麥幼苗，顯著提高了幼苗的根系活力、葉綠素和脯氨酸含量，明顯降低了相對(duì)電導(dǎo)率和丙二醛含量，緩解了干旱對(duì)幼苗生長(zhǎng)的抑制作用。Timmusk 等[9]用蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)AZP2和多粘類芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa)B接種干旱脅迫下的小麥幼苗，顯著促進(jìn)了幼苗的生長(zhǎng)，提高了抗氧化酶活性，緩解了干旱脅迫下ROS對(duì)小麥造成的傷害。不同的微生物對(duì)植物的促生能力與促生機(jī)制不同，本研究采用褐球固氮菌AC17處理干旱脅迫下的小麥幼苗，測(cè)定小麥幼苗的生長(zhǎng)和生理指標(biāo)，研究褐球固氮菌AC17菌株對(duì)干旱脅迫下小麥幼苗生長(zhǎng)的影響，為AC17菌株作為菌肥的進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

褐球固氮菌AC17菌株(AzotobacterchroococcumAC17)是采用阿須貝無氮培養(yǎng)基從小麥根際分離篩選的菌株，該菌株具有固氮和溶磷作用，并能產(chǎn)生IAA，被保存于周口師范學(xué)院生命科學(xué)與農(nóng)學(xué)學(xué)院微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室；供試小麥品種為周麥18。

1.2 AC17菌液的制備

AC17菌株被接種于阿須貝無氮液體培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)2天，用波長(zhǎng)600 nm的分光光度計(jì)測(cè)定培養(yǎng)基中AC17菌株的濃度, 然后用無菌水將菌液濃度稀釋為108CFU/mL。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)查閱的文獻(xiàn)[2-4]和預(yù)實(shí)驗(yàn)，1/3 Hoagland 營(yíng)養(yǎng)液+20%聚乙二醇6000對(duì)小麥幼苗生長(zhǎng)影響顯著，所以采用20%聚乙二醇6000模擬干旱脅迫。

將小麥種子用70%乙醇消毒1分鐘，然后用1%次氯酸鈉消毒10分鐘，最后用無菌水清洗3-4次。消毒后的種子置于鋪有濕濾紙的培養(yǎng)皿中，于光照培養(yǎng)箱(28 ℃，光照14 h/d)內(nèi)培養(yǎng)3天，然后培養(yǎng)在含有2500 mL 1/3 Hoagland 營(yíng)養(yǎng)液育苗盤(規(guī)格為30 cm×20 cm×5 cm)中，置于光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，光照時(shí)間為16 h/d、晝夜溫度28 ℃、相對(duì)濕度70%。待小麥幼苗生長(zhǎng)至兩葉期時(shí)，試驗(yàn)分4組處理：(1)對(duì)照組(CK)：1/3 Hoagland 營(yíng)養(yǎng)液；(2)干旱脅迫組(DS)：1/3 Hoagland 營(yíng)養(yǎng)液+20% PEG-6000(w/v)；(3) AC17組：1/3 Hoagland 營(yíng)養(yǎng)液+10 mL 108CFU/mLAC17菌液； (4) AC17 + 干旱脅迫組(AC17 + DS)：1/3 Hoagland 營(yíng)養(yǎng)液+20% PEG-6000 (w/v)+10 mL 108CFU/mL AC17菌液。每處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)3盤。干旱脅迫7天后，每盤取15株小麥幼苗測(cè)定幼苗的形態(tài)指標(biāo)和生理生化指標(biāo)。采用皮尺測(cè)量小麥幼苗的株高和根長(zhǎng)；取小麥幼苗植株，去根，用電子天平稱量幼苗鮮重，然后采用干燥箱80 ℃烘干后，稱幼苗干重。

1.4 小麥幼苗生理生化指標(biāo)的測(cè)定

采用劉萍等[19]的方法測(cè)定抗氧化酶活性、葉綠素和丙二醛(MDA)含量；采用Zou[20]的方法測(cè)定可溶性蛋白和可溶性糖的含量。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)的整理與作圖，用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，并采用Duncan氏新復(fù)極差法分析相同指標(biāo)不同處理間數(shù)據(jù)的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 AC17菌株對(duì)干旱脅迫下小麥幼苗的生長(zhǎng)和葉綠素含量的影響

由表1可知，干旱脅迫抑制了小麥幼苗的生長(zhǎng)。與對(duì)照組相比，干旱脅迫處理組小麥幼苗的株高、根長(zhǎng)、鮮重、干重和葉綠素含量分別降低了26.73%、30.98%、68.10%、42.86%和38.55% (P< 0.05)。AC17菌株處理后，小麥幼苗的株高、根長(zhǎng)、鮮重、干重和葉綠素含量有明顯提高。單獨(dú)AC17菌株處理組幼苗的株高、根長(zhǎng)、鮮重、干重和葉綠素含量比對(duì)照組分別提高了15.24%、18.70%、22.09% 、28.57%和12.65%(P< 0.05)；與干旱脅迫組相比，AC17 +干旱脅迫組幼苗的株高、根長(zhǎng)、鮮重、干重和葉綠素含量分別增加了28.51%、25.60%、119.23%、37.50% 和50.00% (P< 0.05)。這些結(jié)果表明，AC17菌株緩解了干旱脅迫對(duì)小麥幼苗生長(zhǎng)的抑制作用。

表1 AC17菌株對(duì)干旱脅迫下小麥幼苗生長(zhǎng)和葉綠素含量的影響

2.2 AC17菌株對(duì)干旱脅迫下小麥幼苗可溶性糖和可溶性蛋白質(zhì)含量的影響

由圖1所示，AC17處理組小麥幼苗的可溶性糖和可溶性蛋白含量明顯提高 (P< 0.05)。單獨(dú)AC17菌株處理組小麥幼苗的可溶性糖和可溶性蛋白含量分別比對(duì)照組提高了25.48%和59.40%，AC17+干旱脅迫組的可溶性糖和可溶性蛋白含量分別比干旱脅迫組提高了24.69%和70.39% (P< 0.05)。從以上結(jié)果可以看出，AC17菌株可通過增加可溶性糖和可溶性蛋白的含量來維持細(xì)胞的滲透勢(shì)，增強(qiáng)幼苗對(duì)抗干旱脅迫的耐受性。

不同小寫字母表示不同處理間差異顯著(P < 0.05)

2.3 AC17菌株對(duì)干旱脅迫下小麥幼苗丙二醛含量及抗氧化酶活性的影響

由圖2可知，干旱脅迫組小麥幼苗的丙二醛含量比對(duì)照提高了191.74% (P< 0.05)。AC17菌株處理小麥幼苗后，干旱脅迫組幼苗的丙二醛含量有所降低。與干旱脅迫組相比， AC17+干旱脅迫組小麥幼苗MDA含量降低了25.11% (P< 0.05)。同時(shí)，AC17菌株誘導(dǎo)了小麥幼苗的抗氧化酶活性(圖2)，與對(duì)照相比，單獨(dú)AC17菌株處理組幼苗的SOD、CAT和POD的活性較對(duì)照組分別提高了13.27%、23.87%和20.01% (P< 0.05)，AC17+干旱脅迫組SOD、CAT和POD的活性較干旱脅迫組分別提高了6.54%、25.45%和35.18% (P< 0.05)，這些結(jié)果表明，AC17菌株提高抗氧化酶活性，減輕干旱脅迫引起的膜脂過氧化，提高小麥幼苗對(duì)干旱的耐受性。

不同小寫字母表示不同處理間差異顯著(P < 0.05)

3 討論

干旱脅迫抑制小麥的生長(zhǎng)，降低小麥幼苗的株高、根長(zhǎng)、鮮量、干量、根冠比和葉綠素含量，影響抗氧化活性與滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的積累[2, 4, 8, 21]。近年來，許多研究報(bào)道利用外源有益微生物能提高小麥、水稻、玉米等植物對(duì)鹽、干旱和重金屬等逆境脅迫的抗性，促進(jìn)植物的生長(zhǎng)[7-18]。Tahir 等[14]用芽孢桿菌(Bacillussp.) MWT14接種小麥，促進(jìn)了小麥幼苗的生長(zhǎng)，提高了幼苗葉綠素含量和抗氧化酶活性，增強(qiáng)了小麥對(duì)干旱脅迫的抗性。?；燮嫉萚21]用具有固氮溶磷能力，并能產(chǎn)生IAA的假單胞菌(Pseudomonassp.)HN1202處理干旱脅迫下的小麥幼苗，幼苗的株高和根長(zhǎng)增加，葉綠素、可溶性蛋白和可溶性糖的含量以及抗氧化酶活性提高，丙二醛含量降低，提高了植株對(duì)干旱脅迫的抗性。叢國(guó)強(qiáng)等[22]報(bào)道球毛殼菌(Chaetomiumglobosum)ND35能顯著提高干旱脅迫下小麥幼苗的株高、根長(zhǎng)、根冠比，誘導(dǎo)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)脯氨酸和可溶性糖的積累以及抗氧化酶CAT的活性。本研究結(jié)果表明， AC17菌株提高了干旱脅迫下小麥幼苗的株高、根長(zhǎng)、鮮重、干重和葉綠素含量，比單獨(dú)干旱脅迫處理組分別提高了28.51%、25.60%、119.23%、37.50% 和50.00%，這一結(jié)果證明AC17菌株能有效緩解干旱脅迫對(duì)小麥幼苗生長(zhǎng)的抑制作用。

可溶性糖和可溶性蛋白是植物抗逆境脅迫的重要滲透調(diào)節(jié)因子[10, 21]。在干旱脅迫下，植物體內(nèi)可積累可溶性糖和可溶性蛋白，降低細(xì)胞滲透勢(shì)和參與活性氧自由基的清除，增強(qiáng)植物對(duì)逆境脅迫的抗性[21, 23-24]。Moustakas等[23]表明可溶性糖參與活性氧自由基的清除。Couée等[24]報(bào)道可溶性糖可能是控制ROS平衡的防御信號(hào)的組成成分。可溶性蛋白是植物體內(nèi)的親水性高分子化合物，干旱脅迫時(shí)，植物會(huì)通過增加可溶性蛋白的含量來提高細(xì)胞的保水能力，提高植物對(duì)干旱脅迫的抗性[25]。因此，可溶性蛋白和可溶性糖的積累反映了植物對(duì)逆境脅迫抗性的提高。本研究中，AC17菌株能顯著提高干旱脅迫下小麥幼苗的可溶性蛋白和可溶性糖的含量，表明小麥幼苗應(yīng)對(duì)干旱的滲透調(diào)節(jié)能力與清除ROS的能力增強(qiáng)。

干旱脅迫誘導(dǎo)活性氧自由基(ROS)的產(chǎn)生，過量的ROS積累會(huì)通過膜脂的過氧化作用，造成細(xì)胞的嚴(yán)重?fù)p傷，最終導(dǎo)致MDA含量的升高[3-4]。SOD、POD和CAT在清除ROS和保護(hù)細(xì)胞免受損傷方面發(fā)揮著重要作用[8, 10, 14, 21]。所以，抗氧化酶活性的變化反映了植物對(duì)逆境脅迫抗性的強(qiáng)弱。本研究中，AC17菌株顯著提高了干旱脅迫下小麥幼苗SOD、POD和CAT的活性，降低MDA含量，說明AC17菌株能通過提高植株抗氧化酶活性來清除過量ROS，降低質(zhì)膜的過氧化作用，緩解干旱對(duì)小麥植株的氧化損傷，提高小麥對(duì)干旱脅迫的抗性。

4 結(jié)論

AC17菌株促進(jìn)了干旱脅迫下小麥幼苗的生長(zhǎng)，增強(qiáng)了小麥幼苗對(duì)干旱脅迫的抗性。AC17菌株提高了干旱脅迫下小麥幼苗的株高、根長(zhǎng)、鮮重和干重以及葉綠素、可溶性蛋白和可溶性糖的含量，誘導(dǎo)了抗氧化酶活性，降低了MDA的含量。本研究為探究AC17菌株促生機(jī)理及菌株的開發(fā)利用提供支持。