張蒙，龔覺曉，毛晨晗，高昕，張丞波，王新東，

1.南京中醫(yī)藥大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210028；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，江蘇 南京 210028

血管內(nèi)皮功能紊亂是高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）等血管穩(wěn)態(tài)失衡性疾病的始動(dòng)因素。流體切應(yīng)力（FSS）是血流作用于血管壁表面產(chǎn)生的平行于血管壁的切線摩擦阻力，直接作用于血管壁表面內(nèi)皮細(xì)胞（ECs）。FSS通過何種途徑完成力學(xué)向生物學(xué)信號(hào)的轉(zhuǎn)化從而影響內(nèi)皮細(xì)胞功能，目前尚不十分清楚。有研究表明，與生物力學(xué)信號(hào)密切相關(guān)的新型跨膜蛋白分子機(jī)械敏感性陽離子通道Piezo1可能在其中扮演關(guān)鍵角色，Piezo1是ECs的FSS傳感器。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，低FSS可從氣虛血瘀的病機(jī)角度認(rèn)識(shí)，益氣活血法是治療AS等心血管疾病的關(guān)鍵治法，該法的代表藥對(duì)黃芪-丹參在治療心血管疾病氣虛血瘀證中應(yīng)用廣泛。本研究基于機(jī)械敏感性陽離子通道 Piezo1觀察黃芪丹參藥物血清對(duì)低FSS誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）炎癥和功能紊亂的影響，探討其保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與細(xì)胞

SD大鼠30只，體質(zhì)量（220±30）g，雌雄各半，南京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)SYXK（蘇）2018-0049。動(dòng)物飼養(yǎng)于清潔、（22±2）℃環(huán)境，自由攝食飲水，12 h明暗交替。本研究符合南京中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理規(guī)范（JL-A2020016）。HUVEC，美國ScienCell公司，貨號(hào)YS806C。

1.2 藥物及血清制備

黃芪、丹參飲片購于南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院中藥房，經(jīng)江蘇省中醫(yī)藥研究院童黃錦藥師鑒定為豆科植物膜莢黃芪（Fisch.）Bge.和唇形科植物丹參Bge.的干燥根。根據(jù)臨床處方常用劑量，將黃芪、丹參以 2∶1比例配伍，按前期實(shí)驗(yàn)方法制備原藥材濃度為1 g/mL的黃芪丹參水煎液。將30只大鼠隨機(jī)分為空白組和給藥組，每組15只，給藥組按4.7 g/（kg?d）灌胃黃芪丹參水煎液（相當(dāng)于60 kg成人臨床用藥量的6.25倍），2次/d，連續(xù)7 d；空白組灌胃等體積生理鹽水。末次灌胃后1 h，乙醚麻醉大鼠，無菌條件下腹主動(dòng)脈取血，4 ℃靜置2 h，3 000 r/min離心15 min，吸取上清液，0.22 μm濾膜過濾除菌，56 ℃水浴滅活30 min，即得空白血清和黃芪丹參藥物血清，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 主要試劑與儀器

Piezo1激活劑Yoda-1（美國Selleck公司，貨號(hào)S6678），胎牛血清（FBS，美國 Gibco公司，貨號(hào)26140-079），內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基（ECM，美國ScienCell公司，貨號(hào)8578），Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，貨號(hào)E-CK-A211），一氧化氮（NO）、內(nèi)皮素-1（ET-1）檢測(cè)試劑盒（南京建成生物工程研究所，貨號(hào)分別為A013-1、A018-1），白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）ELISA試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，貨號(hào)分別為 E-EL-R0012c、E-EL-H0109c），熒光定量 PCR試劑盒（日本Takara公司，貨號(hào)DRR096A），Piezo1兔多克隆抗體（英國Abcam公司，貨號(hào)ab259949），內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）兔多克隆抗體（英國 Abcam 公司，貨號(hào)ab252439），pro-IL-1β兔多克隆抗體（美國Proteintech公司，貨號(hào)16806-1-AP）。FSS加載分析設(shè)備（美國Flexcell公司，型號(hào)STR-4000），細(xì)胞培養(yǎng)載玻片（美國 Flexcell公司，型號(hào) CS-U），CO培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher公司，型號(hào)HERAcell 150i），倒置顯微鏡（日本Olympus公司，型號(hào)CKX53），酶標(biāo)儀（中國邁瑞公司，型號(hào) MR-96A），流式細(xì)胞儀（美國Thermo Fisher公司，型號(hào)Attune NxT），RT-PCR儀（美國Applied Biosystems公司，型號(hào)ABI7500），電泳槽（美國Bio-Rad公司，型號(hào)Mini-Protean Tetra），電泳轉(zhuǎn)印槽（美國 Bio-Rad公司，型號(hào) Mini Trans-Blot），型離心機(jī)（德國 Eppendorf公司，型號(hào)5417R）。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)、分組及造模

HUVEC用含20%FBS的ECM培養(yǎng)。將細(xì)胞分為空白組、模型組、Piezo1激活劑組和芪參血清組，每組5個(gè)復(fù)孔。消化收集細(xì)胞，接種于載玻片上，待細(xì)胞融合至80%左右時(shí)，給予相應(yīng)干預(yù)?？瞻捉M、模型組予15%空白血清培養(yǎng)基，Piezo1激活劑組予含2 μmol/L Yoda-1的15%空白血清培養(yǎng)基，芪參血清組予15%黃芪丹參藥物血清培養(yǎng)基，各組繼續(xù)培養(yǎng)6 h后棄去上清液，將載玻片置于FSS加載分析設(shè)備流動(dòng)小室中，按設(shè)備說明書操作，空白組加載正常FSS（1.2 Pa），其余各組加載低FSS（0.12 Pa），于加載6 h收集細(xì)胞及灌流液，檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)。

1.5 指標(biāo)檢測(cè)

1.5.1 細(xì)胞活力檢測(cè)

收集各組細(xì)胞接種于96孔板，MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力，每孔加入5%MTT溶液15 μL，37 ℃培養(yǎng)4 h，棄去上清液，每孔加入二甲基亞砜150 μL，于酶標(biāo)儀波長(zhǎng)570 nm處檢測(cè)各孔OD值。

1.5.2 細(xì)胞凋亡檢測(cè)

各組細(xì)胞分別給予相應(yīng)干預(yù)和FSS處理后，加入10 μL Annexin V-FITC和PI避光染色15 min，于流式細(xì)胞儀激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)530 nm（FITC通道）、617 nm（PI通道）處檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.5.3 細(xì)胞灌流液一氧化氮、內(nèi)皮素-1、白細(xì)胞介素-1β和腫瘤壞死因子-α含量檢測(cè)

細(xì)胞灌流液3 000 r/min離心5 min，吸取上清液，硝酸還原酶法檢測(cè)總硝酸鹽（NOX）含量，以 NOX含量表示NO含量，均相競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)ET-1含量，ELISA檢測(cè)IL-1β和TNF-α含量。

1.5.4 RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞Piezo1、內(nèi)皮型一氧化氮合酶mRNA表達(dá)

收集各組細(xì)胞，PBS洗滌3次，1 500 r/min離心5 min，棄去上清液，沉淀加入Trizol提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，熒光定量PCR試劑盒對(duì)樣品DNA進(jìn)行分析。根據(jù)樣品的Ct值，采用2法測(cè)定Piezo1和eNOS mRNA相對(duì)表達(dá)量。引物序列見表1。

表1 各基因PCR引物序列

1.5.5 Western blot檢測(cè)細(xì)胞Piezo1、內(nèi)皮型一氧化氮合酶和pro-白細(xì)胞介素-1β蛋白表達(dá)

收集各組細(xì)胞，加入裂解液提取總蛋白并測(cè)定蛋白濃度。等量蛋白上樣，經(jīng) SDS-PAGE后，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜（150 mA、90 min），5%脫脂奶粉封閉1 h，按1∶1 000比例分別加入Piezo1、eNOS和pro-IL-1β一抗，4 ℃孵育過夜。加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（1∶1 000），室溫孵育1 h，化學(xué)發(fā)光法顯影。以GAPDH為內(nèi)參，分析目的蛋白條帶相對(duì)表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 黃芪丹參藥物血清對(duì)模型細(xì)胞活力的影響

MTT結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組細(xì)胞活力顯著降低（＜0.05）；與模型組比較，Piezo1激活劑組細(xì)胞活力無明顯變化（＞0.05），芪參血清組細(xì)胞活力顯著升高（＜0.01）。結(jié)果見表2。

表2 各組HUVEC細(xì)胞活力比較（±s，OD值）

2.2 黃芪丹參藥物血清對(duì)模型細(xì)胞凋亡的影響

與空白組比較，模型組細(xì)胞凋亡率顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，Piezo1激活劑組和芪參血清組細(xì)胞凋亡率顯著降低（＜0.01）。結(jié)果見圖1。

圖1 各組 HUVEC 凋亡比較（±s，n＝5）

2.3 黃芪丹參藥物血清對(duì)模型細(xì)胞一氧化氮、內(nèi)皮素-1、白細(xì)胞介素-1β和腫瘤壞死因子-α含量的影響

與空白組比較，模型組細(xì)胞灌流液NO含量顯著減少（＜0.01），ET-1、IL-1β和TNF-α含量顯著增加（＜0.01）；與模型組比較，Piezo1激活劑組和芪參血清組細(xì)胞灌流液NO含量顯著增加（＜0.01），ET-1、IL-1β和 TNF-α含量顯著減少（＜0.01）。結(jié)果見表3。

表3 各組 HUVEC灌流液 NO、ET-1、IL-1β和TNF-α含量比較（±s）

2.4 黃芪丹參藥物血清對(duì)模型細(xì)胞 Piezo1和內(nèi)皮型一氧化氮合酶 mRNA表達(dá)的影響

與空白組比較，模型組細(xì)胞 Piezo1和 eNOS mRNA表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.01）；與模型組比較，Piezo1激活劑組和芪參血清組細(xì)胞Piezo1和eNOS mRNA表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.01）。結(jié)果見表4。

表4 各組HUVEC Piezo1和eNOS mRNA表達(dá)比較（±s）

2.5 黃芪丹參藥物血清對(duì)模型細(xì)胞Piezo1、內(nèi)皮型一氧化氮合酶和pro-白細(xì)胞介素-1β蛋白表達(dá)的影響

與空白組比較，模型組細(xì)胞Piezo1和eNOS蛋白表達(dá)顯著降低（＜0.01），pro-IL-1β蛋白表達(dá)顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，Piezo1激活劑組和芪參血清組細(xì)胞 Piezo1和 eNOS蛋白表達(dá)顯著升高（＜0.01），pro-IL-1β蛋白表達(dá)顯著降低（＜0.05，＜0.01）。結(jié)果見圖2。

圖2 各組 HUVEC Piezo1、eNOS和 pro-IL-1β 蛋白表達(dá)比較（±s，n＝3）

3 討論

FSS在維持ECs功能穩(wěn)態(tài)和AS病理進(jìn)展方面發(fā)揮重要作用。AS的易感性與ECs不能在流動(dòng)方向上排列有關(guān)，通常歸因于低FSS和/或振蕩FSS。生理性的層流FSS（1.5～7 Pa）能使ECs的形態(tài)沿血液流動(dòng)方向拉伸變長(zhǎng)，從而維持內(nèi)皮穩(wěn)態(tài)；低FSS（＜1.0～1.2 Pa）多發(fā)生在血管狹窄部位的下游和彎曲部位內(nèi)側(cè)壁，使ECs不再沿流動(dòng)方向排列，從而引起內(nèi)皮功能紊亂，進(jìn)一步激活炎癥信號(hào)，加速血管炎癥性疾病的進(jìn)展。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SS較低且受方向變化影響的動(dòng)脈區(qū)域可表現(xiàn)出慢性低度炎癥；垂直于ECs骨架軸的FSS可激活炎癥，而平行方向的FSS則具有抗炎作用。

ECs能感應(yīng)不同特征的血流，并相應(yīng)地調(diào)節(jié)血管生理和重塑。FSS可觸發(fā)ECs釋放多種血管活性介質(zhì)，其中由eNOS參與生成的NO被認(rèn)為是最主要的血管舒張因子。血流誘導(dǎo)NO和前列環(huán)素呈劑量依賴性分泌是維持FSS恒定的穩(wěn)態(tài)機(jī)制。本研究發(fā)現(xiàn)，低FSS可誘導(dǎo)HUVEC功能表型發(fā)生變化，主要表現(xiàn)為降低細(xì)胞活力，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制血管舒張因子NO分泌，促進(jìn)血管收縮因子ET-1分泌，降低eNOS mRNA和蛋白表達(dá)。黃芪丹參藥物血清可提高細(xì)胞活力，抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)血管舒張因子NO分泌，抑制血管收縮因子ET-1分泌，升高eNOS mRNA及蛋白表達(dá)，提示其對(duì)ECs具有保護(hù)和調(diào)節(jié)作用。

Piezo1廣泛存在于血管ECs和平滑肌細(xì)胞中，是機(jī)械敏感性陽離子通道，介導(dǎo)機(jī)械敏感陽離子電流。研究表明，Piezo1可被FSS和施加在ECs質(zhì)膜上的側(cè)向力（膜張力）激活，且 Piezo1參與FSS誘導(dǎo)的ECs Ca內(nèi)流和細(xì)胞排列。本研究發(fā)現(xiàn)，低FSS可誘導(dǎo)HUVEC Piezo1 mRNA和蛋白表達(dá)降低，Piezo1激活劑 Yoda-1可抑制低 FSS誘導(dǎo)的HUVEC凋亡，增加血管舒張因子NO分泌及Piezo1 mRNA和蛋白表達(dá)，驗(yàn)證了Piezo1作為感受器在低FSS介導(dǎo)的HUVEC功能紊亂中的關(guān)鍵作用。黃芪丹參藥物血清可上調(diào)Piezo1 mRNA和蛋白表達(dá)，提示其可能通過激活Piezo1抑制低FSS誘導(dǎo)的 HUVEC損傷，從而發(fā)揮保護(hù)ECs和調(diào)節(jié)細(xì)胞功能的作用。

盡管Piezo1可以介導(dǎo)ECs的流量感應(yīng)，并且在維持ECs功能中具有重要作用，但ECs Piezo1下游的機(jī)制仍不清楚。炎癥及炎性微環(huán)境的形成是誘導(dǎo)ECs功能障礙的關(guān)鍵機(jī)制之一。促炎因子IL-1β在AS炎癥的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，靶向IL-1β是當(dāng)前抗血管炎癥藥物研發(fā)的熱點(diǎn)。本研究發(fā)現(xiàn)，低 FSS可促進(jìn)HUVEC炎癥因子IL-1β和TNF-α分泌，上調(diào)pro-IL-1β蛋白表達(dá)，表明低FSS誘導(dǎo)的HUVEC損傷與炎癥的相關(guān)性。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，Piezo1激活劑Yoda-1和黃芪丹參藥物血清均可抑制炎癥因子IL-1β和TNF-α分泌，下調(diào)pro-IL-1β蛋白表達(dá)，提示Piezo1可能介導(dǎo)低FSS相關(guān)的ECs炎癥，而黃芪丹參藥物血清可能通過激活 Piezo1，抑制低 FSS誘導(dǎo)的HUVEC炎癥，從而發(fā)揮血管內(nèi)皮保護(hù)效應(yīng)。

綜上所述，低FSS可下調(diào)HUVEC Piezo1 mRNA和蛋白表達(dá)，激活 IL-1β介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，誘導(dǎo)HUVEC凋亡和功能障礙，黃芪丹參藥物血清可上調(diào)HUVEC Piezol mRNA和蛋白表達(dá)，抑制促炎因子IL-1β和 TNF-α分泌，提示黃芪-丹參可能通過上調(diào)Piezo1表達(dá)，發(fā)揮抑制ECs炎癥反應(yīng)、保護(hù)ECs功能的作用。